Zkrácený glykoprotein E viru varicella-zoster je ideálním imunogenem pro návrh vakcíny na bázi Escherichia Coli

Virus varicella-zoster (VZV) je vysoce infekční agens odpovědný za onemocnění planých neštovic i herpes zoster. Navzdory vysoké účinnosti přetrvávají u licencovaných vakcín obavy o bezpečnost a dostupnost. Zde jsme se snažili produkovat imunogen gE VZV pomocí expresního systému E. coli. Zjistili jsme, že rozpustná exprese a výtěžek gE proteinu by mohly být zvýšeny prostřednictvím C-koncových zkrácení proteinu, čímž se usnadní robustní a škálovatelný purifikační proces pro výrobu vakcíny. Olovo zkrácený gE (aa 31–358), dále označovaný jako tgE, byl v roztoku homogenním monomerem a vykazoval vynikající antigenicitu. Nakonec jsme hodnotili a porovnávali imunogenicitu tgE s komerční vodkou LAV a vakcínou Shingrix. Zjistili jsme, že tgE s hliníkovým adjuvans byl imunogenní ve srovnání s vodkou LAV. Při adjuvans AS01B vykazovala dvoudávková imunizace tgE srovnatelnou nebo lepší účinnost v protilátkových odpovědích a imunitě zprostředkované buňkami s těmi, které má vakcína Shingrix při stejné dávce, zejména pokud jde o podíl IFN- - exprimujících CD4+ T buňky. Závěrem lze říci, že tato metoda exprese tgE zprostředkovaná E. coli nabízí nákladově efektivní a škálovatelnou strategii pro vytvoření ideálního imunogenu VZV gE pro vývoj vakcín proti planým neštovicím i zosteru.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

virus varicella-zoster, glykoprotein E, Escherichia coli, vakcína

ÚVOD

Varicella-zoster virus (VZV) je patogenní lidský alfa herpesvirus, který vyvolává dvě hlavní kategorie onemocnění: primární infekci planými neštovicemi, vysoce nakažlivé onemocnění charakterizované puchýřovitou vyrážkou na kůži a mírnými systémovými příznaky, jako je horečka a malátnost převážně u dětí; a herpes zoster (HZ), latentní reaktivace viru v reakci na oslabený buněčný imunitní systém způsobený stárnutím, který způsobuje bolestivou, lokalizovanou vezikulární vyrážku (HZ) s nebo bez několika dalších komplikací (Cohen, 2013; Heininger a Seward, 2006; Zerboni a kol., 2014). Varicelle a HZ lze zabránit vakcínami s živými atenuovanými viry (LAV). První LAV pro prevenci planých neštovic byl vyvinut Takahashi et al. (1974) založený na kmeni viru vOka a později byl licencován jako Varivax pro rutinní použití ve Spojených státech. Následoval vývoj a licencování Zostavaxu pro prevenci HZ (Tseng et al., 2011). Bohužel během 10 let od zahájení očkování Varivaxem bylo potvrzeno, že téměř 1/3 případů HZ je spojeno s kmenem vOka (Galea et al., 2008), což naznačuje, že vOka může infikovat a nastolit latenci, jako divoká -typ viru a poté znovu aktivujte, aby způsobil HZ. Kromě toho je účinnost Zostavaxu nepřímo úměrná věku pacienta v době podání, přičemž zvýšený věk je spojen s nižší účinností (Oxman et al., 2005). Předchozí studie ukázaly, že glykoprotein E (gE) VZV je nejhojnějším virovým glykoproteinem na obalu virionu a na povrchu infikované buňky. GE je také jedním z nejdůležitějších protektivních antigenů proti VZV schopných navodit buněčnou a humorální imunitu během přirozené infekce planými neštovicemi i po očkování vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Nedávno byla schválena rekombinantní HZ podjednotková vakcína, Shingrix (HZ/su), pro prevenci HZ a související postherpetické neuralgie (PHN) u dospělých ve věku nad 50 let nebo rovných (Shah et al., 2019; Syed, 2018). V klinických studiích vyvolal Shingrix účinnou, VZV specifickou, buňkami zprostředkovanou imunitu (CMI), s celkovou účinností vakcíny 97,2 % mezi účastníky 50 let nebo rovnými a 91,3 % mírou ochrany u účastníků vyšší nebo rovnou do 70 let. Tato zjištění společně naznačují významně snížené riziko HZ u očkovaných jedinců nezávisle na věku, a tedy účinnější variantu vakcíny ve srovnání s ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Shingrix je navržen z rekombinantního antigenu gE exprimovaného v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO) a adjuvantního systému na bázi lipozomů (AS01B) obsahujícího 3-odesacyl-4′-monofosforyl lipid A (MPL) a Quillaja saponaria Molina, frakce 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Rekombinantní buňky CHO však vyžadují dlouhý produkční cyklus a jsou spojeny se složitým procesem čištění, jehož výsledkem jsou vysoké výrobní náklady a omezené dodávky. Shingrix jako takový není ideálním řešením očkování pro široké použití, zejména v rozvojových zemích (Kim et al., 2012). Mikrobiální expresní systémy nabízejí několik výhod oproti savčím expresním systémům, včetně rychlého růstu, snadnosti kultivace a nižších výrobních nákladů (Overton, 2014), a jsou tak široce používány při expresi a produkci řady biofarmaceutik (Adkins a Wagstaff, 1998; Monie a kol., 2008; Wu a kol., 2012). Pro úspěšnou expresi rekombinantních eukaryotických proteinů v prokaryotických systémech je však třeba překonat několik obtíží během produkce, jako je nesprávné skládání a nedostatek posttranslačních modifikací (Singh a Panda, 2005). Navzdory těmto obtížím by mikrobiální expresní systémy mohly nabídnout ideální systém pro širokou, nákladově efektivní výrobu vakcíny, a proto vyžaduje zkoumání antigenů z expresního systému E. coli pro návrh vakcíny proti VZV. V předchozí práci jsme ukázali úspěšnou expresi rekombinantního proteinu gE (rgE) v hmyzích buňkách a získali jsme purifikované proteiny pro imunizaci myší a produkci mAb (Liu et al., 2015). Na základě této práce zde zkoumáme, zda protein gE může být exprimován v E. coli. Zkoumali jsme nefúzní rozpustnou expresi gE kandidátních antigenů s C-koncovým zkrácením (dále označované jako zkrácený gE (tgE) nebo tgE) v E. coli a charakterizovali purifikované tgE proteiny. Ukázali jsme, že purifikovaný tgE je antigenní podobný nativnímu gE a je schopný indukovat vysoké titry protilátek s vOka-neutralizační aktivitou u myší. Při srovnání imunogenicity antigenu tgE generovaného v naší studii s LAV a Shingrixem jsme zjistili, že náš antigen nejen vykazuje účinnou humorální odpověď, ale také indukuje antigen-specifickou CMI. Celkově může naše strategie E. coli pro produkci proteinu tgE připravit cestu pro alternativní průmyslově vyráběný imunogen pro očkování proti planým neštovicím i HZ.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

VÝSLEDEK

Exprese a purifikace rekombinantního tgE v E. coli

Sekvence DNA kódující extracelulární doménu gE VZV byly připraveny jako konstrukty s různými N- nebo C-koncovými zkráceními a klonovány do vektoru pTO-T7 pro expresi proteinu v E. coli. Extracelulární doména gE v plné délce měla tendenci tvořit inkluzní tělíska v E. coli během exprese, a to by mohlo být zlepšeno C-koncovým zkrácením. Z různých zkrácených proteinů bylo nejlepší rozpustnosti dosaženo s konstruktem gE (aa 31–358) (obrázek 1A), dále označovaným jako zkrácený gE nebo tgE. Kandidátní tgE byl úspěšně exprimován jako rozpustný rekombinantní protein a purifikován ze supernatantu bakteriálních lyzátů pomocí třístupňové chromatografie v laboratorním měřítku pro další hodnocení a vývoj jako potenciální vakcína. K zachycení byla použita silná aniontoměničová chromatografie následovaná keramickým hydroxyapatitem a hydrofobní chromatografií (obrázek 1B). V následných fázích purifikačního procesu došlo ke zvýšení čistoty tgE na SDS-PAGE (obrázek 1C). tgE migroval jako přibližně 40 kD pás a vykazoval dobrou reaktivitu se specifickou protilátkou 1B11 (obrázek 1D). Celkový výtěžek byl přibližně 500 ug purifikovaného tgE na gram bakterií.

Charakterizace zkráceného gE

K analýze homogenity a sedimentačních koeficientů purifikovaných proteinů byla použita vysokoúčinná vylučovací chromatografie (HPSEC) a analytická ultracentrifugace (AUC). Jako kontrola byl použit protein rgE purifikovaný ze systému hmyzích buněk (Liu et al., 2015). V HPSEC se tgE objevil jako ostrý pík při převládajícím retenčním čase 16,1 min (obrázek 2A), což odráží vysokou homogenitu pro purifikované tgE proteiny. V experimentech AUC byl pozorován převažující sedimentační pík při ~2,3 S (obrázek 2B), což se rovná ~39,4 kD, což ukazuje, že tgE se v roztoku vyskytuje jako monomer. Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) byla použita k testování tepelné stability proteinu tgE sledováním tepelné kapacity během procesu tepelného rozbalování. Profily DSC ukázaly pouze jeden tepelný přechod během rozbalování proteinu při hodnotě přechodové teploty (Tm) 63,80 stupně pro tgE, srovnatelné s přechodem rgE (63,64 stupně) (obrázek 2C). Abychom prozkoumali konformační integritu purifikovaných proteinů tgE, analyzovali jsme antigenicitu tgE pomocí testu ELISA, přičemž purifikované proteiny rgE exprimované v hmyzích buňkách sloužily jako kontroly. V testu ELISA bylo použito devět mAb, které dokázaly rozpoznat konformační epitopy (mAb 1B11, 4G4, 14G1) nebo lineární epitopy (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (obrázek 3). Našli jsme podobné hodnoty střední efektivní koncentrace (EC50, ng ml-1) pro proteiny tgE a rgE pro většinu protilátek kromě 1B11, který měl téměř 10-krát nižší reaktivitu, což naznačuje jejich podobnou antigenicitu. Tyto výsledky naznačují, že klíčové epitopy na rgE jsou dobře zachovány v proteinu tgE.

Obrázek 1 (barva online) Exprese a čištění proteinů. Schématické znázornění návrhu konstrukce tgE. Buňky E. coli byly transformovány rekombinantními plasmidy nesoucími zkrácený gen gE (aa 31–358). B, Schematické znázornění procesu čištění tgE. tgE byl purifikován z lyžovaného supernatantu pomocí třístupňové chromatografie. C, SDS-PAGE profil tgE během procesu čištění. Molekulová hmotnost tgE je přibližně 40 kD. M: marker molekulové hmotnosti. Dráha 1: supernatant oddělený od buněčného lyzátu; dráha 2: frakce obsahující tgE z chromatografu Q-FF; dráha 3: frakce obsahující tgE z CHT chromatografu; dráha 4: frakce z butylového chromatografu obsahující protein tgE s vysokou čistotou. D, Imunoblotování purifikovaného tgE.

Analýza imunitních reakcí indukovaných tgE u myší

Abychom porovnali imunogenicitu tgE s rgE, formulovali jsme proteiny se dvěma adjuvans běžně používanými pro výzkumnou práci: adjuvans na bázi hliníku Al-001 a Freundovo adjuvans. Myši byly imunizovány třikrát v týdnech 0, 2 a 4 dávkou 1 ug pro tgE a rgE s adjuvans. Titry gE-specifických protilátek a odpovědi T-buněk v týdnu 5 po první imunizaci byly použity ke stanovení imunogenicity různých formulací adjuvans. Myši imunizované vakcínou tgE formulovanou s Al-001 vykazovaly podobné profily protilátek jako myši ve skupině rgE a Freundovo adjuvans vykazovalo lepší stimulační účinek, když bylo formulováno s tgE než s rgE (obrázek 4A). Neutralizační titry neukázaly žádné rozdíly u myší imunizovaných vakcínou tgE nebo rgE, s neutralizačními titry ~10}3 pro tgE formulovaný s různými adjuvans (obrázek 4B). Při analýze CD4+ T buněk ze splenocytů intracelulárním barvením cytokinů (ICS) však vakcíny tgE i rgE vyvolaly podobné hladiny gE-specifického IFN- ve srovnání se skupinou s fyziologickým roztokem (obrázek 4C, ~{ {22}},1 % pro skupiny s vakcínami nebo pro skupinu s fyziologickým roztokem) a pouze mírná simulace gE-specifického IL{{20}} (obrázek 4D, ~0,2 % pro skupiny s vakcínami vs. ~0,1 % pro skupinu s fyziologickým roztokem). Celkově tyto výsledky ukazují, že tgE/Al-001 a tgE/Freundovo adjuvans vyvolávají gE-specifické imunitní odpovědi srovnatelné s těmi, které vyvolává rgE, se zvláště silnou humorální odpovědí.

Hodnocení kandidátní vakcíny proti planým neštovicím tgE ve srovnání s LAV

Dále jsme hodnotili produkci protilátek a perzistenci hliníkem adjuvovaných tgE proteinů u BALB/c myší. Dvě skupiny myší (n=5 na skupinu) byly imunizovány třikrát v týdnech 0, 2 a 4 různými dávkami 0,5 ug a 5 ug tgE/Al{{ 8}} (obrázek 5A a B). Profily protilátkové odpovědi ukázaly, že primární inokulace proteinu tgE vyvolala vysoké titry protilátek s trvalým nárůstem po dvou posilovacích imunizacích v týdnech 2 a 4 a dosáhla maximální hladiny v týdnu 6, než pomalu klesla na více než 1{{ 20}}4 za sledované období. Různé dávkové skupiny sdílely podobné profily titrů protilátek během sledovaného období, s podobnými vysokými neutralizačními titry v týdnu 6. Imunogenicita tgE byla hodnocena a srovnávána s vodkou. Poloviční účinná dávka (ED50) u myší byla použita jako míra sérokonverze, přičemž nižší ED50 svědčí o lepší imunogenicitě. Myši Balb/c byly rozděleny do skupin a intraperitoneálně imunizovány tgE s hliníkovým adjuvans (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625 nebo 0.03125 ug; n{{30}}) nebo vakcína vOka (1,000, 500, 250, 125 nebo 62,5 pfu; n=6) v sériových ředěních. Séra byla odebrána po 4 týdnech a testována pomocí ELISA. Sérokonverze byla analyzována podle Reedovy a Muenchovy metody (obrázek 5C). Ve věkových skupinách měly myši míry sérokonverze 83 %, 100 %, 100 %, 100 %, 50 % a 17 % pro dávky 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 a 0,03125 ug, v daném pořadí. Ve skupinách s vodkou měly myši nižší míry sérokonverze 67 %, 50 %, 33 %, 17 % a 0 % pro dávky 1, 000, 500, 250, 125 nebo 62,5 pfu, v daném pořadí. Hodnoty ED50 byly 0,063 ug pro tgE a 449,425 pfu pro vOka, což ukazuje, že imunogenicita tgE při nižší dávce 0,3 ug byla ekvivalentní imunogenicitě dosažené při jedné dávce vakcíny proti planým neštovicím obsahující vOka (obvykle více než 2,{{78} } pfu na dávku).

Obrázek 2 Charakterizace proteinů tgE a rgE. A, HPSEC profily purifikovaného tgE. Je uveden retenční čas gE. B, Analýza rychlosti sedimentace purifikovaného proteinu tgE. Sedimentační koeficient a molekulová hmotnost tgE byly stanoveny metodami c(s) a c(M) nezávisle. V (A) a (B) je tgE zobrazen černě a červeně modře. C, Profily diferenciální skenovací kalorimetrie purifikovaného proteinu tgE a rgE.

Obrázek 3 Reaktivity tgE a rgE s mAb. mAb byly sériově zředěny a reagovaly s potaženými proteiny tgE nebo rgE v testu ELISA. Reakce byly detekovány pomocí HRP-značených anti-myších protilátek. Pro každé ředění byly měřeny duplicitní jamky na stejné destičce. Hodnoty EC50 byly vypočteny proložením sigmoidního trendu pomocí softwaru GraphPad Prism.

Obrázek 4 Imunogenicita tgE a rgE testovaná u BALB/c myší 1 týden po imunizaci třemi dávkami. A, Produkce protilátek u myší pro tgE a rgE formulované s různými adjuvans. B, Titry neutralizačních protilátek u myší pro tgE a rgE formulované s různými adjuvans. C a D, Hodnocení gE specifických IFN- a IL-2 odpovědí indukovaných vakcínami tgE nebo rgE.

Obrázek 5 Testy imunogenicity vakcíny tgE formulované s hliníkem u BALB/c myší. A a B, Perzistence protilátek a neutralizační protilátková odpověď tgE/Al-001. Titry byly monitorovány po dobu až 16 týdnů. C, ED50 u myší pro tgE s obsahem hliníku a vodku.

Vyhodnocení kandidátní vakcíny tgE Zoster ve srovnání se Shingrixem

Pro srovnání imunogenicity naší vakcíny tgE s vakcínou Shingrix byl lyofilizovaný protein tgE formulován s adjuvans Shingrix, AS01B. Myši C57BL/6 byly imunizovány dvěma dávkami tgE/AS01B nebo Shingrix intramuskulárně do holenního svalu v týdnech 0 a 4. Hladiny protilátek po první imunizaci naznačovaly, že imunizace Shingrixem byla dostatečná k indukci vysokých hladin anti-gE protilátek, významně vyšší než ty produkované tgE/AS01B; po druhé imunizaci však mezi těmito dvěma skupinami nebyl žádný významný rozdíl v produkci protilátek (obrázek 6A). Pokud jde o hladiny neutralizačních protilátek, imunizace jednou dávkou tgE/AS01B vedla k produkci zanedbatelných množství neutralizačních protilátek, významně nižších než ty, které produkoval Shingrix. Nicméně znovu, po posilovací imunizaci jsme neviděli žádný významný rozdíl, pokud jde o produkci neutralizačních protilátek mezi těmito dvěma skupinami (obrázek 6B). Aby se ověřilo, jak imunizace ovlivňuje CMI, byly po první a druhé imunizaci detekovány hladiny gE-specifických IFN- a IL{14}} pomocí testu ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot) a intracelulárního barvení cytokiny. Imunizace tgE/AS01B indukovala špatnou humorální imunitní odpověď ve srovnání s jednou dávkou Shingrix, ale vykazovala srovnatelnou účinnost, pokud jde o indukci splenocytů produkujících IFN- - a IL{18}} (obrázek 6C). Po druhé imunizaci byl skutečně detekován významný počet gE-specifických buněk produkujících cytokiny ve skupině tgE/AS01B ve srovnání s kontrolní skupinou s fyziologickým roztokem, které byly také srovnatelné nebo lepší než u skupiny Shingrix (obrázek 6D ). Podobné výsledky byly pozorovány v analýze průtokové cytometrie s pozorováním podobných podílů IFN- -exprimujících CD4+ T buněk (obrázek 6E), IL-2-exprimujících CD4+ T buňky (obrázek 6F) a IFN- -CD8+ T buňky (obrázek 6G) mezi myšmi imunizovanými tgE/AS01B a Shingrix, bez ohledu na imunizaci jednou nebo booster dávkou. Tyto výsledky ukazují, že protein tgE odvozený z bakteriálního expresního systému může indukovat humorální i buněčné imunitní reakce, když je formulován s vhodnými adjuvans, a může být tedy považován za kandidátní antigen pro vytvoření vakcíny proti VZV.

Obrázek 6 Imunogenicita tgE u myší C57BL/6. Byly podávány dávky 5 ug tgE formulované s 50 μl AS01B adjuvans. To byla 1/10 dávky vakcíny Shingrix. Imunizace byla provedena v týdnech 0 a 4. A, Srovnání produkce protilátek indukované vakcínou tgE/AS01B ve srovnání s vakcínou Shingrix. Sérové ​​titry byly stanoveny testem ELISA za použití destiček potažených rgE. B, Srovnání reakce neutralizačních protilátek na vOka po očkování vakcínou tgE/AS01B nebo Shingrix. Neutralizační titry antiséra v týdnu 2 (levý panel) a týdnu 6 (pravý panel) jsou vyjádřeny jako převrácená hodnota ředění séra vedoucí k 50% inhibici. C, Hodnocení gE-specifických reakcí IFN- a IL-2 indukovaných vakcínou tgE/AS01B nebo Shingrixem v týdnu 2. Počty splenocytů produkujících IFN- - a IL-2- byly vypočteny z Test ELISPOT po restimulaci s poolem gE peptidů. D, Hodnocení gE-specifických reakcí IFN- a IL-2 indukovaných vakcínou tgE/AS01B nebo Shingrixem v týdnu 8. Počty splenocytů produkujících IFN- - a IL-2- byly vypočteny z Test ELISPOT po restimulaci se souborem gE peptidů. E–G, průtokové cytometrické testy pro gE-specifické cytokiny exprimující CD4+ a CD8+ buňky. Podíl IFN- -produkujících CD4+ T buněk, IL-2-produkujících CD4+ T buněk a IFN- -produkujících CD8+ T mezi splenocyty.

DISKUSE

VZV gE je hlavním cílem humorální a buňkami zprostředkované imunitní odpovědi během přirozené infekce planými neštovicemi a po vakcinaci VZV Oka. Shingrix (GSK) je rekombinantní podjednotková vakcína obsahující VZV gE exprimovaný v CHO buňkách a adjuvans na bázi lipozomů AS01B. Jiná práce se snažila prozkoumat podjednotkové vakcíny proti HZ pomocí gE proteinů generovaných z CHO nebo hmyzích buněk formulovaných s novými adjuvans (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang a kol., 2021; Wui a kol., 2019; Wui a kol., 2021). Zde jsme zkoumali a ukázali, že protein gE by mohl být rozpustně exprimován a purifikován z E. coli a poté formulován jako kandidát na podjednotkovou vakcínu s vhodným adjuvans, aby vyvolal nejen silný neutralizační titr, ale také silnou CMI odpověď.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

E. coli jako expresní systém nabízí několik výhod: rychlý růst buněk, levné kultivační podmínky a účinný a všestranný nástroj pro produkci rekombinantních proteinů. Výzkum antigenu souvisejícího s herpes virem měl několik úspěchů s použitím expresního systému založeného na E. coli. Neutralizační lineární epitop gE (aa 121–135) byl fúzován se 149 aa proteinu jádra viru hepatitidy B (HBc) za vzniku chimérických VLP, které by mohly indukovat VZV-specifické neutralizační protilátky u myší (Zhu et al., 2016). V jiné studii byl homologní protein gE z viru opičích planých neštovic (SVV) exprimován v E. coli s využitím GST fúzního tagu pro generování gE antiséra (Gray et al., 2001). Dosud nebyly hlášeny žádné zprávy o VZV gE proteinu bez fúzní značky purifikované z E. coli jako kandidáta na vakcínu.

gE se skládá ze tří oblastí: 544-aa hydrofilní ektodoména se signálním peptidem (aa 1–30), 17-aa hydrofobní transmembránová oblast a 62-aa cytoplazmatická ocasní oblast. Zkoumali jsme několik kandidátních molekul s různými zkrácením v N- nebo C-koncových oblastech ektodomény gE a zjistili jsme, že exogenní exprese těchto proteinů v E. coli byla nejlepší s použitím zkrácené části (data nejsou uvedena). Intaktní ektodoména gE bez fúzní značky má tendenci tvořit inkluzní tělíska, když je exprimována E. coli a je obtížné ji purifikovat. Mezi testovanými kandidáty na zkrácení protein gE (aa 31–358) vykazoval vysokou rozpustnou expresi s minimálními obtížemi při purifikaci, stejně jako vysokou čistotu a vysokou homogenitu (obrázek 1), takže tento konstrukt zkrácení byl považován za ideální kandidátní vakcínu. antigen. Tato strategie zkrácení mohla mít potenciální vliv na vlastnosti proteinu, zejména jeho antigenicitu. Dříve jsme exprimovali rekombinantní gE v hmyzích buňkách a purifikovali tento konstrukt, abychom imunizovali myši BALB/c, a získali jsme 70 gE monoklonálních protilátek pro analýzu epitopu (Liu et al., 2015). Prostřednictvím naší analýzy jsme identifikovali aa 1–194 jako imunodominantní oblast (data nejsou uvedena). Podobné výsledky byly získány jinde, přičemž gE-specifické mAb poukazovaly na oblasti aa 109–123 a 160–316, které jsou oblastmi odpovědnými za protilátky stabilní protilátek navazování mezi variantními izoláty (Vafai, 1994). V jiné studii s použitím rekombinantních hybridních fragmentů gE-VLP autoři identifikovali zbytky 1–134 jako nejvíce antigenní oblast proteinu gE a ukázali, že C-konec gE (zbytky 303–623) obsahující několik cysteinových zbytků nedokázal produkovat částice v kvasinkách (Fowler et al., 1995), což naznačuje, že heterologní exprese gE by měla brát v úvahu nejen antigenicitu, ale také snadnost exprese. Zde jsme optimalizovali délku gE proteinu pro jeho účinnou rozpustnou expresi s minimálním snížením antigenicity. tgE vykazoval podobnou reaktivitu jako většina protilátek na obrázku 3 jako rgE produkovaný v hmyzích buňkách, což naznačuje, že klíčové epitopy jsou dobře zachovány v tgE proteinu purifikovaném z E. coli. Jedna studie však ukázala, že imunodominantní epitopy CD4+ T buněk rozpoznávané dárci vakcíny Shingrix byly rozptýleny v proteinu gE (Voic et al., 2020). Imunogenicita tgE v naší studii byla identická s imunogenitou zjištěnou pro gE odvozené z CHO buněk v Shingrix, když byl antigen kombinován s AS01B adjuvans, s podobně účinnými humorálními odpověďmi a odpověďmi CMI, jak je ukázáno na obrázku 5. Tyto výsledky ukázaly, že zkrácený gE odvozený z prokaryotického systému byl z hlediska antigenicity stejně dobrý jako intaktní ektodoména gE z eukaryotického systému.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Mezi proteiny gE odvozenými z různých expresních systémů jsou značné rozdíly. Nejvýraznější rozdíly jsou zaznamenány u posttranslačních modifikací, zejména u glykosylace. O-vázané glykany z membránových glykoproteinů mají význam z hlediska rozpoznávání virových glykopeptidových epitopů T-buňkami a protilátkami a toto rozpoznání má potenciál vysokého biomedicínského významu v našich pokusech zprostředkovat imunitní ochranu proti virům pomocí podjednotkových vakcín. Odstranění glykanů v gE produkovaných v buňkách CHO-K1 vedlo k 17% snížení reaktivity s VZV-pozitivním sérem. Naproti tomu O-glykosylace může interferovat s imunoreaktivitou B buněčných epitopů: některé důležité epitopy jsou blokovány dalšími O vázanými glykany (Nordén et al., 2019). V naší studii se zdá, že tgE generovaný z E. coli se chová stejně jako rgE pocházející z hmyzích buněk, pokud jde o jeho imunoreaktivitu a imunogenicitu, což naznačuje, že "nahý" protein tgE je příslibem jako kandidát na vakcínu. Vakcíny s tgE jako antigenem pravděpodobně indukují nejen vysoké titry IgG, což svědčí o jejich potenciálu jako podjednotkové vakcíny proti planým neštovicím bez potenciálního rizika virové latence, ale také vysoké CMI, což naznačuje její potenciál také jako vakcíny proti pásovému oparu. Celkově lze říci, že gE antigen odvozený z bakteriálního expresního systému v této studii nabízí mnohem ekonomičtější strategii pro vývoj vakcín proti VZV.

Reference

Adkins, JC a Wagstaff, AJ (1998). Rekombinantní vakcína proti hepatitidě B: přehled její imunogenicity a ochranné účinnosti proti hepatitidě B. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Buňkou zprostředkovaná imunita proti viru varicella-zoster. J Infect Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. a Liu, C. (2021). Imunogenicita glykoproteinu E viru varicella-zoster formulovaného s lipidovými nanočásticemi a nukleovými imunostimulátory u myší. Vakcíny 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. a Xia, N. (2014). Vývoj neutralizačního testu viru varicella-zoster s použitím imunosorbentního bodového testu s enzymem vázaným na protilátku proti glykoproteinu K. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Klinická praxe: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255–263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. a Giannini, SL (2012). Buňkami zprostředkované imunitní reakce na vakcínu s glykoproteinem E viru varicella-zoster s použitím agonisty TLR i QS21 u myší. Vaccine 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ a Layton, GT (1995). Identifikace imunodominantních oblastí a lineárních B buněčných epitopů obalového proteinu gE viru varicella-zoster. Virologie 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA a Sharrar, RG (2008). Bezpečnostní profil vakcíny proti planým neštovicím: 10-roční přehled. J Infect Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB a Soike, KF (2001). Exprese glykoproteinu E. Virus viru opičích planých neštovic Res 79, 27–37.

Heininger, U., a Seward, JF (2006). Plané neštovice. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG a Lee, GM (2012). CHO buňky v biotechnologii pro produkci rekombinantních proteinů: současný stav a další potenciál. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., a kol. (2015). Účinnost adjuvované vakcíny proti herpes zoster podjednotky u starších dospělých. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. a Nam, JH (2020). Vyhodnocení vakcín podjednotky glykoproteinu E a živých atenuovaných virů varicella-zoster formulovaných s adjuvans na bázi jednovláknové RNA. Immun Inflamm Dis 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., a kol. (2015). Kvantitativní stanovení glykoproteinu E VZV na bázi monoklonálních protilátek a jeho aplikace na kvantifikaci antigenu ve vakcíně proti VZV. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. a Liu, C. (2022a). Ionizovatelné lipidové nanočástice zvýšily synergický adjuvantní účinek CpG ODN a QS21 ve vakcíně s glykoproteinem E podjednotkou viru varicella-zoster. Pharmaceutics 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K., a Liu, C. (2022b). Glykoprotein E viru varicella-zoster s adjuvans LNP-CpG ODN indukoval srovnatelné úrovně imunity se Shingrix™ u myší po vakcinaci VZV. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. a Wu, TC (2008). Cervarix: vakcína pro prevenci HPV 16, 18-přidružené rakoviny děložního čípku. Biologics 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S., and Bergström, T. (2019). Rekombinantní glykoprotein E viru varicella-zoster obsahuje glykan-peptidové motivy, které modulují epitopy B buněk do diskrétních imunologických signatur. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E., a Arvin, AM (2016). Glykoproteiny viru varicella-zoster: vstup, replikace a patogeneze. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Rekombinantní produkce proteinů v bakteriálních hostitelích. Drug Discov Dnes 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE a kol. (2005). Vakcína k prevenci herpes zoster a postherpetické neuralgie u starších dospělých. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, OSN a Tyring, SK (2019). Shingrix pro herpes zoster: recenze. Skin Therapy Lett 24, 5–7. Singh, SM, a Panda, AK (2005). Solubilizace a refolding proteinů bakteriálních inkluzních tělísek. J Biosci Bioeng 99, 303-310.

Syed, YY (2018). Rekombinantní vakcína zoster (Shingrix®): přehled o herpes zoster. Drogy stárnutí 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T., and Isomura, S. (1974). Živá vakcína se používá k prevenci šíření planých neštovic u dětí v nemocnicích. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS a Jacobsen, SJ (2011). Vakcína proti herpes zoster u starších dospělých a riziko následného onemocnění herpes zoster. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Vazebná místa protilátek na zkrácených formách glykoproteinu gpI(gE) viru varicella zoster. Vaccine 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., a kol. (2020). Identifikace a charakterizace epitopů CD4+ T buněk po očkování Shingrixem. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. a Liu, C. (2021). Imunitní reakce na glykoprotein E viru varicella-zoster formulovaný s nanočásticemi poly(mléčná-koglykolová kyselina) a adjuvans nukleových kyselin u myší. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS, a Zhao, Q. (2012). Vývoj vakcíny proti hepatitidě E: 14-letá odysea. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ a kol. (2019). Účinná indukce buněčně zprostředkované imunity vůči glykoproteinu E viru varicella-zoster lyofilizovanému s kationtovým adjuvans na bázi lipozomů u myší. Vaccine 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. a Lee, NG (2021). Účinek TLR4 agonisty/kationtového lipozomového adjuvans na účinnost vakcíny s glykoproteinem E viru varicella-zoster: prezentace antigenu, příjem a dodání do lymfatických uzlin. Pharmaceutics 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL a Arvin, AM (2014). Molekulární mechanismy patogeneze viru varicella zoster. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T., a Xia, N. (2016). Vysoce konzervovaný kandidát na epitop vakcíny proti viru varicella-zoster indukuje u myší neutralizační protilátky. Vaccine 34, 1589–1596.