DNA methylom a transkriptom identifikované klíčové geny a cesty zapojené do tvorby kropenatých vaječných skořápek u starých nosnic

Abstraktní

Pozadí

Kvalita skořápek drůbežích vajec úzce souvisí s rentabilitou produkce vajec. Skvrny z vaječných skořápek odrážejí důležitý kvalitativní znak, který ovlivňuje vzhled vajec a preference zákazníků. Mechanismus tvorby skvrn je však stále špatně pochopen. V této studii jsme systematicky porovnávali sérové ​​imunitní a antioxidační indexy slepic snášejících skvrnitá a normální vejce. K objasnění mechanismu tvorby skvrn ve vaječných skořápkách byly použity transkriptomové a methylomové analýzy.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Výsledek

Výsledky ukázaly, že mezi normálními a skvrnitými skupinami bylo identifikováno sedm odlišně exprimovaných genů (DEG). Analýza obohacení genové sady (GSEA) odhalila, že exprimované geny byly obohaceny hlavně o vápníkovou signální dráhu, fokální adhezi a signální dráhu MAPK. Dále bylo detekováno 282 diferenčně methylovaných genů (DMG), z nichž 15 genů bylo spojeno se stárnutím, včetně ARNTL, CAV1 a GCLC. Analýza dráhy ukázala, že DMG byly spojeny s imunitou zprostředkovanou T buňkami, odpovědí na oxidační stres a buněčnou odpovědí na stimul poškození DNA. Integrační analýza dat transkriptomu a metylace DNA identifikovala BFSP2 jako jediný překrývající se gen, který byl exprimován v nízkých hladinách a hypomethylován ve skupině skvrnitých.

Závěry

Celkově tyto výsledky naznačují, že geny a dráhy související se stárnutím a imunitou hrají klíčovou roli při tvorbě skvrnitých vaječných skořápek a poskytují užitečné informace pro zlepšení kvality vaječných skořápek.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Klíčová slova

Nosnice, Skvrnitá vejce, Transkriptom, metylace DNA, Imunita

Pozadí

Drůbeží vejce jsou jedním z nejdůležitějších zdrojů bílkovin a díky relativně nízké ceně jsou mezi spotřebiteli oblíbená. Za poslední čtyři desetiletí se produkce vajec značně zlepšila díky rozvoji specializovaných plemen vajec a genetické selekci s cílem „Krmit nosnice na 100 týden, abychom vyprodukovali 500 vajec“ [ 1, 2]. Dosažení tohoto cíle však bylo omezeno postupným poklesem kvality a fyziologie vaječných skořápek související se stárnutím slepic, což mělo za následek zvýšenou hmotnost vaječných skořápek, světlejší barvu skořápky a skvrnité vaječné skořápky [3]. Červenohnědá skvrnitost, důležitý znak kvality skořápky, se často objevuje na tupém konci hnědé skořápky, což značně ovlivňuje vzhled vajec a preference zákazníků. Stupeň skvrnitosti vaječné skořápky se hodnotí pomocí bodovací metody. Skvrny mohou být hodnoceny podle intenzity pigmentu, distribuce a velikosti skvrn [4]. Kromě toho se dědičnost skvrnitých vaječných skořápek pohybuje v rozmezí 0,15–0,2, což ukazuje na genetickou determinaci [5]. Kromě toho předchozí studie ukázala, že staré slepice mají vyšší míru skvrnitých vaječných skořápek než mladší slepice, dosahující 20 % po 60. týdnu věku [6]. Žláza ve skořápce je orgán pro tvorbu vajec, který hraje klíčovou roli ve struktuře skořápky a tvorbě barvy. Při tvorbě vajíčka žloutek putuje přes infundibulum, magnum a isthmus a dostává se do žlázy ve skořápce, která vylučuje velké množství vápníku, pigmentu, kutikuly a dalších látek, tvořících kompletní strukturu vaječné skořápky a vnější kutikulu [7–9 ]. Jakákoli úprava nebo poškození žlázy skořápky ovlivňuje tvorbu struktury a pigmentaci skořápky [10–12]. Metylace DNA je jednou z prvních známých modifikačních cest a zahrnuje přenos methylových skupin na páté uhlíkové místo cytosinu za vzniku 5-methylcytosinu [13]. Metylace DNA hraje důležitou roli v procesu stárnutí zvířat, reguluje genovou expresi související s věkem a etiologii neurologických, imunologických a metabolických onemocnění [14–17]. Navíc methylace DNA v kombinaci s faktory prostředí může způsobit různé fenotypy během stárnutí [18]. Několik komplexních fenotypů hospodářských zvířat bylo spojeno s metylací DNA [19, 20]. Nedávno bylo sekvenování RNA (RNA-seq) užitečné při odhalování genů a cest, které jsou základem znaků na transkripční úrovni [21–24], jako je embryonální vývoj svalů, účinnost krmiva a velikost vrhu. Naše předchozí studie ukázala, že ačkoli výskyt kropenatých skořápek neovlivňuje užitkovost nosnic (nepublikovaná data), mohou skvrnitosti ovlivnit vzhled vajec a výrazně snížit jejich ekonomickou hodnotu. Molekulární mechanismy tvorby skvrnitých vajíček jsou navíc špatně pochopeny. Tato studie si proto kladla za cíl objasnit mechanismus tvorby skvrnitých vaječných skořápek pomocí transkriptomických a DNA metylačních technik. Vzhledem k tomu, že skvrnité vaječné skořápky jsou dědičné a související s věkem, použili jsme kombinaci transkriptomických a DNA methylačních analýz, abychom prozkoumali klíčové geny a cesty zapojené do tvorby skvrnitých vaječných skořápek. Očekává se, že výsledky této studie zlepší porozumění molekulárnímu mechanismu tvorby vlastností vaječných skořápek, což by bylo užitečné pro chov zvířat.

Obr. 1 Normální a skvrnitá vejce od starých nosnic. A Normální vejce, B Strakaté vejce

Tabulka 1 Biochemické parametry séra normálních a skvrnitých skupin

Výsledek

Biochemické parametry séra

A typical egg and speckled egg are shown in Fig. 1. Serum antioxidant and immune indices were measured to determine the physiological status of the laying hens. Serum biochemical parameters are listed in Table 1. Serum levels of immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin A (IgA) are common indicators of humoral immune function. Birds in the normal group had a higher (p = 0.028) IgA content than those in the speckle group. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione (GSH), and glutathione peroxidase (GSH-PX) are important antioxidant enzymes in the body. MDA is one of the products formed by the reaction of lipids with oxygen radicals, and its content represents the degree of lipid peroxidation. These indices are important in evaluating the oxidative stress process. However, there were no differences (p >0.05) v parametrech antioxidantů mezi normální a skvrnitou skupinou.

Transkriptomový profil vaječné skořápky

Šest knihoven cDNA bylo zkonstruováno ze skupiny skvrnité a normální. Po kontrole kvality bylo získáno celkem 615 170 158 nezpracovaných čtení a 604 275 600 čistých čtení (98,22 % nezpracovaných čtení). Po zarovnání pomocí softwaru HISAT2 byla míra mapování 90,75–93,18 % a jedinečná míra mapování ve všech vzorcích byla vyšší než 73,47 % (doplňková tabulka S3). Úrovně genové exprese jsou ilustrovány pomocí klastrové tepelné mapy a analýzy hlavních komponent (PCA). Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v profilech genové exprese vzorků ze skupiny skvrnitých a normálních, protože vzorky netvořily odlišné shluky (obr. 2A, B). Mezi normálními a skvrnitými skupinami bylo identifikováno celkem sedm odlišně exprimovaných genů (DEG) (str<0.05, |log2 Fold Change|>1), včetně dvou upregulovaných a pěti downregulovaných genů (tabulka 2). Analýza obohacení genové sady (GSEA) ukázala, že čtyři dráhy byly významně obohaceny exprimovanými geny (doplňková tabulka S4). Negativní normalizované skóre obohacení (NES) indikovalo nižší úrovně exprese pro některé dráhy v normální skupině ve srovnání s těmi ze skupiny skvrnitosti, přičemž dráha vápníkové signalizace, interakce neuroaktivní ligand-receptor, fokální adheze a signální dráha MAPK jsou dráhy s nejnižší exprese (obr. 2C). DEG stromů (BFSP2, IQSEC, TMOD4) identifikované pomocí RNA-seq byly ověřeny pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR). Podobná exprese těchto tří genů byla evidentní při použití RNA-Seq a qRT-PCR a koeficient determinace (R2) dosáhl 0,93 (obr. 2D), což ukazuje, že data RNA-seq byla spolehlivá.

Tabulka 2 Diferenciálně exprimované geny (DEG) mezi slepicemi, které snášely skvrnitá a normálními vejci

Obr. 2 Profil transkriptomu vaječné skořápky. A Heatmap úrovní genové exprese, B Analýza hlavních komponent všech genů pomocí DEseq2 normalizovaných hodnot exprese, C Tři reprezentativní genové sady z výsledků analýzy obohacení genových sad, D Výsledky qPCR ověření odlišně exprimovaných genů

Profil metylace DNA vaječné skořápky

A total of 564,415,302 and 581,414,308 clean reads were obtained from the speckle and normal groups, respectively, after quality control (Supplementary Table S5), of which 73–78% were uniquely mapped to the converted chicken reference genome (GRCg6a). The cytosine (C) methylation rate of the six eggshell gland samples was approximately 3.4%, and the cytosine site methylation of CpG ranged from 55.5–to 63.9% in the two groups. The cytosine site methylation of CHH and CHG (H represents A, C, or T) was detected at a low proportion (0.3–0.4%) (Supplementary Table S5). Pearson correlation analysis of the CpG bases suggested that all samples were highly correlated (r>{{0}}.89) (obr. 3A). PCA ukázala, že vzorky z těchto dvou skupin se významně nelišily, protože nevytvářely samostatné shluky (obr. 3B). Mezi těmito dvěma skupinami nebyly žádné významné rozdíly v úrovních methylace CG, CHG a CHH (obr. 3C). Nicméně skupina skvrnitých vykazovala vyšší úroveň metylace CG než normální skupina. Oblasti opakování a exonu vykazovaly nejvyšší úrovně methylace CG, zatímco oblast 5' UTR měla nejnižší úrovně methylace CG (obr. 3D). Mezi normálními a skvrnitými skupinami bylo identifikováno celkem 2788 diferenciálně methylovaných oblastí (DMR). DMR se nacházely hlavně v intronech (47,45 %), následovala intergenová oblast (36,05 %), exon (8,29 %), promotor (5,95 %), 3′-UTR (1,18 %) a 5′-UTR ( 0,97 %) regionů (obr. 4). Dále bylo identifikováno 282 diferenciálně methylovaných genů (DMG), včetně 172 hypermethylovaných a 74 hypomethylovaných genů v oblasti promotoru. Kromě toho bylo v těle genu nalezeno 36 DMG, včetně 30 hypermethylovaných genů a šesti hypomethylovaných genů. Převedli jsme DMG do jejich lidských ortologů a získali jsme 158 genových symbolů, které byly nahrány do Metascape pro funkční anotaci, genovou ontologii (GO) a analýzy cest. Geny byly obohaceny ve 176 biologických procesech GO, včetně regulace buněčné odpovědi na stimul růstovým faktorem a imunity zprostředkované T buňkami, reakce na oxidační stres a buněčné reakce na stimul poškození DNA.

Obr. 3 Celkové úrovně methylace u slepic snášejících skvrnitá a normální vejce. A Korelační analýza úrovní methylace mezi vzorky ze dvou skupin. B Analýza hlavní složky hladiny methylace všech vzorků. C Histogram úrovně methylace cytosinového místa ve dvou skupinách. D Spojnicový graf úrovní methylace různých genomových oblastí. Genomové oblasti každého genu byly rozděleny do 20 přihrádek; úroveň methylace cytosinového místa odpovídajících funkčních oblastí všech genů byla poté zprůměrována.

4 Histogram anotace diferenčně methylovaných oblastí (DMR) v genomových funkčních oblastech Obr.

Obr. 5 Podmínky GO DMG. B Vztah mezi genovou expresí a úrovněmi metylace DNA ve skupině skvrnitých. C Vztah mezi genovou expresí a hladinami metylace DNA u normální skupiny. D Vennův diagram překrývajících se genů mezi DEG a DMG

Analýza dráhy ukázala, že geny byly obohaceny v 19 drahách Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), včetně degradace RNA, regulace zánětlivých mediátorů TRP kanálů a signální dráhy TNF. Navíc bylo detekováno 25 genových sad, včetně signalizace pomocí Rho GTPáz, RHO GTPázového cyklu a CDC42 GTPázového cyklu. Top 20 obohacených ontologických shluků je zobrazeno na obr. 5A. Ze 158 homologních lidských genů 15 souviselo se stárnutím nebo dlouhověkostí (doplňková tabulka S6). Byla provedena integrativní analýza bisulfitového sekvenování celého genomu (WGBS) a dat RNA-seq, aby se určil vztah mezi methylací DNA a hladinami genové exprese (obr. 5B a C). Existovala negativní korelace mezi methylací DNA a hladinami genové exprese proti směru transkripce od místa začátku transkripce (TSS) a po směru od místa ukončení transkripce (TTS); mezi metylací DNA a hladinami genové exprese v těle genu však nebyla žádná korelace. Vennův diagram ukázal, že BFSP2 byl jediným překrývajícím se genem mezi DMG a DEG (obr. 5D).

Diskuse

Několikaleté studie prokázaly, že tvorba skvrn na vaječných skořápkách je dědičná a staré nosnice produkují vyšší míru skvrnitých skořápek než mladé slepice [6]. Stárnutí nosnic je často doprovázeno chronickým zánětem a oxidačním stresem [25, 26]. Krevní parametry zvířat odrážejí jejich fyziologický a nutriční stav. SOD, GSH-PX, GSH, CAT a T-AOC jsou součástí antioxidačního obranného systému. Výsledky této studie naznačují, že nebyl žádný významný rozdíl v antioxidační kapacitě starých slepic mezi skupinami skvrnitých a normálních, což je v rozporu se zjištěními Morena a Osorna [27]. Moreno uvedl, že ptáci snášející vejce se skvrnitou skořápkou mohou trpět fyziologickým stresem kvůli prooxidační funkci hlavní složky skvrnitosti a mají vyšší toleranci oxidačního stresu [28]. Rozdíly ve výsledcích lze přičíst různým druhům použitým ve studiích.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Imunoglobuliny jsou proteiny účastnící se protizánětlivých procesů a hrají regulační roli v zánětlivých reakcích [29]. Předchozí studie ukázala, že sýkory modřinky snášející skvrnitá vejce vykazují nízké celkové hladiny imunoglobulinů [30]. Podobně výsledky této studie ukázaly, že ptáci ve skupině skvrnitých měli podstatně nižší hladiny IgA v séru ve srovnání s těmi v normální skupině, což naznačuje, že slepice ve skupině skvrnitých mohou mít nižší protizánětlivé schopnosti, což je v souladu s nálezy Martíneze a Merina [30]. IgA, jako jeden z důležitých ukazatelů při hodnocení humorální imunitní funkce drůbeže, má antivirovou, antibakteriální a antitoxinovou funkci [31]. Studie prokázaly, že suplementace kvasinkovým glukanem ve stravě může zvýšit obsah IgA v séru. Zvýšený obsah IgA může zvýšit schopnost jedince udržovat imunitní homeostázu, což vede k možným zdravotním přínosům [32]. Studie také ukázaly, že s věkem nosnic klesá jejich odolnost vůči vnějším patogenům [33]. Při vstupu patogenů do těla starých nosnic může dojít k poškození slizničního obranného systému tkání vejcovodů v důsledku současného snížení imunity [34]. Vyšší hladina IgA však může zvýšit schopnost těla udržovat imunitní homeostázu, zabránit invazi patogenů do submukózní tkáně vejcovodu, a tím zachovat dobrou kvalitu vaječných skořápek. Kromě toho analýza RNA-seq identifikovala sedm stupňů mezi skvrnitými a normálními skupinami, včetně IQSEC3, BFSP2, TMOD4, LOC112530987, GABRA2, TRIQK a pseudogenu. IQSEC3, člen brefeldin A-rezistentní ARF guanin nukleotidových výměnných faktorů (GEF) [35, 36], podporuje rozvoj inhibičních synapsí vazbou s gefyrinem [37]. IQSEC3 je funkčně důležitý pro udržení síťové aktivity in vivo. Knockdown IQSEC3 v hippocampal dentate gyrus u hlodavců snižuje hustotu GABAergních synapsí a zvyšuje náchylnost k těžkým záchvatům [38]. Neexistují však žádné studie o funkci IQSEC3 u drůbeže.

Kyselina gama-aminomáselná (GABA) je hlavním inhibičním neurotransmiterem v centrálním nervovém systému obratlovců [39] a může změnit strukturu receptoru a iontovou permeabilitu odpovídajícího receptoru [40]. GABA může působit přímo na tubulární buňky hladkého svalstva prostřednictvím GABAA-R nebo GABAB-R, které se nacházejí na stěně vejcovodu a podílejí se na regulaci tubulární kontraktility u králíků [39], lidí [41] a potkanů ​​[42]. Studie ukázaly, že GABRA1 hraje důležitou roli při produkci vajec. Vysoké hladiny exprese GABRA1 mohou inhibovat proliferaci granulózních buněk, zvýšit buněčnou apoptózu a inhibovat syntézu a sekreci progesteronu, což vede ke snížení produkce vajíček [43–45]. Rytmus kladení vajec u nosnic je neuromodulační proces [46, 47]. Na základě těchto výsledků spekulujeme, že existuje jemný vztah mezi tvorbou skvrn ve vaječných skořápkách a nervovým systémem, ačkoli přesná souvislost vyžaduje další zkoumání.

TMOD4, člen rodiny proteinů, které zakrývají špičaté konce aktinových filament [48], je exprimován v kosterním svalu a srdci [49, 50]. Studie uvádějí, že TMOD4 je přítomen v čočkách dospělých kuřat, erytrocytech a rychlých vláknech kosterního svalstva [51]. Bylo zjištěno, že TMOD4 se podílí na sestavování myofibril, svalové kontrakci a diferenciaci [52–54]. Kontrakce svalu vejcovodu způsobuje rotaci vajíčka v děloze, což umožňuje rovnoměrné ukládání pigmentu na povrch skořápky. Domníváme se, že tvorba skvrnitých vajíček může souviset s kontrakcí svalů vejcovodů, ale je zapotřebí dalšího výzkumu. GSEA byla použita k analýze biologické funkce všech exprimovaných genů, aby se zabránilo ztrátě některých zajímavých genových sad prostřednictvím strategie cutof-free. Exprimované geny byly obohaceny hlavně o kalciovou signální dráhu, fokální adhezi, MAPK signální dráhu a neuroaktivní interakci ligand-receptor. Bylo hlášeno, že v procesu mineralizace vaječných skořápek se geny související s vápníkovou signální dráhou podílejí na vstřebávání vápníkových a uhličitanových iontů z krve a jsou transportovány do děložní tekutiny přes epiteliální buňky vejcovodu, aby se podílely na tvorbě vaječné skořápky. mineralizace [46, 55]. Když ionty vápníku a uhličitanu pokračují v mineralizaci ve skořápce vejce, vajíčko se v děloze nepřetržitě otáčí a pigment skořápky, protoporfyrin-IX, se může rovnoměrně ukládat na povrch skořápky [56]. Domníváme se, že rozdíl v dodávce uhličitanových a vápenatých iontů mezi těmito dvěma skupinami mohl vést k nerovnoměrnému rozložení pigmentu v procesu ukládání na povrchu vaječných skořápek, což způsobovalo skvrny ve skořápce.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Fokální adheze jsou makromolekulární struktury, které tvoří mechanické spojení mezi intracelulárním aktinovým cytoskeletem a komponentami extracelulární matrix [57]. Bylo prokázáno, že fokální adheze hrají zásadní roli při udržování morfologie a funkce vejcovodu u čínských hnědých žab [58], zatímco fokální adheze se také podílejí na mechanismu rozdílů v produkci vajec u kuřat Jinghai Yellow a Nandan-Yao domácí kuřata [59, 60]. V současné studii se na tvorbě skvrn ve vaječných skořápkách podílely fokální adheze, ale specifický participační mechanismus stále vyžaduje další zkoumání. Dráha MAPK má tři významné členy: mitogenem aktivovanou proteinkinázu p38 (p38 MAPK), Jun N-terminální kinázu (JNK) a extracelulární kinázu odezvy (ERK), které společně regulují buněčný růst, diferenciaci, apoptózu, zánět a další. důležité fyziologické reakce [61]. Bylo prokázáno, že dráha ERK 1/2 MAPK hraje důležitou roli v růstu, vývoji a diferenciaci vejcovodu a dělohy [62]. Wang a kol. použili vanad k indukci růstu epiteliálních buněk vejcovodů a zjistili, že členové rodiny MAPK byli aktivováni, což vedlo k oxidačnímu stresu vejcovodu, snížené buněčné aktivitě a buněčné apoptóze [63]. V současné studii jsme zjistili, že signální dráha MAPK ve skupině skvrnitých byla podstatně obohacena, a proto spekulujeme, že slepice snášející skvrnitá vejce mohly zažít určitý stres s určitým dopadem na vejcovod. Neuroaktivní interakce ligand-receptor souvisí se syntézou steroidních hormonů v gonádách. Hrají zásadní roli v regulaci produkce vajec a funkce vaječníků u drůbeže [59, 64]. Diferenciálně exprimovaný gen, GABRA2, také patří k neuroaktivní cestě interakce ligand-receptor. Vzhledem k tomu, že skvrny ve skořápce se objevují jako výsledek produkce vajec a produkce vajec je rytmický proces, značné obohacení neuroaktivních interakcí ligand-receptor ve skupině skvrnitých nás vede ke spekulacím, že mohou existovat rozdíly v produkci vajec mezi slepicemi snášejícími skvrnitá vejce. a slepice snášející normální vejce, ale to vyžaduje další průzkum.

Environmentální faktory mohou ovlivnit genovou expresi prostřednictvím epigenetických modifikací. Kombinace genetických a epigenetických modifikací by mohla být nápomocná při vysvětlení mechanismu tvorby komplexních znaků [19, 65]. Vztah mezi metylací DNA v celém genomu a genovou expresí je studován již léta [66, 67]. Methylace DNA obecně potlačuje genovou expresi [68]. Výsledky této studie jsou v souladu s předchozími zjištěními v tom, že vysoké hladiny genové exprese jsou spojeny s nízkou metylací DNA v oblasti promotoru [67, 68]. V oblasti genového těla však nebyl pozorován žádný zřejmý trend, což může být způsobeno tím, že vzorce genové exprese jsou také regulovány jinými faktory [69, 70]. Analýza funkčního obohacení odhalila, že DMG byly obohaceny hlavně o imunitu zprostředkovanou T buňkami, odpověď na oxidační stres a buněčnou odpověď na stimuly poškození DNA a většina drah je spojena se stárnutím [71–73]. Byly také identifikovány další geny související se stárnutím, včetně GCLC [74], CAV1 [75] a LYN [76]. Kombinace dat transkriptomu a methylace DNA ukázala, že BFSP2 byl jediným překrývajícím se genem a byl významně exprimován na úrovni methylace DNA i na transkriptomické úrovni. BFSP2 byl hypomethylován a hladiny jeho exprese byly nízké ve skupině skvrnitých, což naznačuje, že genová exprese je kromě methylační modifikace regulována jinými transkripčními faktory. Navíc byl BFSP2 identifikován jako kandidátní gen u autozomálně dominantní kongenitální katarakty [77] a progresivní katarakty [78]. Ačkoli bylo prokázáno, že BFSP2 souvisí s vývojem očí u kuřat [79], studie jiných funkcí u kuřat jsou omezené. Proto jsou nutné další studie k objasnění jeho role při tvorbě skvrnitých vaječných skořápek.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Závěry

Závěrem lze říci, že sérové ​​imunitní indexy naznačují, že obsah IgA ve skvrnité skupině byl podstatně nižší než u normální skupiny a předpokládáme, že snížená imunitní funkce úzce koreluje s tvorbou skvrn ve vaječných skořápkách. Analýza transkriptomu detekovala sedm stupňů mezi skvrnitými a normálními skupinami, z nichž IQSEC3, GABRA2 a BFSP2 byly identifikovány jako potenciálně důležité geny spojené s tvorbou skvrnitých vajíček. Analýza methylace DNA identifikovala DMG spojené s imunitou zprostředkovanou T buňkami, odpovědí na oxidační stres a buněčnou odpovědí na stimul poškození DNA. Z 282 identifikovaných DMG bylo 15 spojeno se stárnutím. Integrativní analýza transkriptomu a metylace DNA odhalila, že jediným překrývajícím se genem byl BFSP2, který byl u kuřat sotva studován. Údaje zde uvedené naznačují, že imunitní a proces stárnutí nosnic může přispívat k tvorbě skvrnitých vaječných skořápek, což zlepšuje naše chápání mechanismu tvorby skvrn ve skořápce.

Reference

1. Bain MM, Nys Y, Dunn IC. Zvýšení vytrvalosti ve snášce a stabilizace kvality vajec v delších snáškových cyklech. Jaké jsou výzvy? Br Poult Sci. 2016;57(3):330–8.

2. Pottgüter R. Krmení nosnic do stáří 100 týdnů. Lohmann Inf. 2016;50:18–21.

3. Molnar A, Maertens L, Ampe B, Buyse J, Kempen I, Zoons J, Delezie E. Změny ve vlastnostech kvality vajec během poslední fáze produkce: existuje potenciál pro prodloužený cyklus snášky? Br Poult Sci. 2016;57(6):842–7.

4. Gosler AG, Higham JP, James Reynolds S. Proč jsou ptačí vejce skvrnitá? Ecol Lett. 2005;8(10):1105–13.

5. Arango J, Settar P, Arthur J, O'Sullivan N. Vztah mezi barvou skořápky a výskytem skvrn v hnědých liniích vajec. In: Proc XIIth European Poultry Conference: 2006. 2006. s. 10–4.

6. Cheng X, Fan C, Ning Z. Kvalita pihových vajíček a faktory, které ji ovlivňují. Chinese Poult Sci. 2019;41(19):6–9 (v čínštině).

7. Hincke MT, Nys Y, Gautron J, Mann K, Rodriguez-Navarro AB, McKee MD. Vaječná skořápka: struktura, složení a mineralizace. Přední Biosci (Landmark Ed). 2012;17(4):1266–80.

8. Samiullah S, Roberts JR, Chousalkar K. Barva skořápky u nosnic s hnědým vejcem - recenze. Poult Sci. 2015;94(10):2566–75.

9. Wilson PW, Suther CS, Bain MM, Icken W, Jones A, Quinlan-Pluck F, Olori V, Gautron J, Dunn IC. Pochopení tvorby kutikuly ptačího vajíčka ve vejcovodu: studium jeho původu a ukládání. Biol Reprod. 2017;97(1):39–49.

10 Zhu M, Li H, Miao L, Li L, Dong X, Zou X. Dietní chlorid kademnatý narušuje biomineralizaci skořápky tím, že narušuje metabolismus žlázy skořápky u nosnic. J Anim Sci. 2020;98(2):skaa025.

11. Qi X, Tan D, Wu C, Tang C, Li T, Han X, Wang J, Liu C, Li R, Wang J. Zhoršení kvality vaječných skořápek u nosnic experimentálně infikovaných virem ptačí chřipky H9N2. Vet Res. 2016;47:35.

12. Wang J, Yuan Z, Zhang K, Ding X, Bai S, Zeng Q, Peng H, Celi P. Epigallocatechin-3-depigmentace vaječných skořápek vyvolaná gallátem chráněná vanadem prostřednictvím P38MAPK-Nrf2/HO-1 signální dráha u nosnic. Poult Sci. 2018;97(9):3109–18.

13. Avery OT, Macleod CM, McCarty M. Studie o chemické povaze látky indukující transformaci pneumokokových typů: indukce transformace pomocí frakce deoxyribonukleové kyseliny izolované z pneumokoka typu Iii. J Exp Med. 1944;79(2):137–58.

14. Kochmanski J, Marchlewicz EH, Cavalcante RG, Sartor MA, Dolinoy DC. Věkem související epigenomová methylace DNA a hydroxymethylace v longitudinální myší krvi. Epigenetika. 2018;13(7):779–92.

15. Zhang X, Hu M, Lyu X, Li C, Thannickal VJ, Sanders YY. Metylace DNA regulovala genovou expresi u orgánové fibrózy. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2017;1863(9):2389–97.

16. Ehrlich M. Hypermetylace DNA u onemocnění: mechanismy a klinický význam. Epigenetika. 2019;14(12):1141–63.

17. Ling C, Ronn T. Epigenetika u lidské obezity a diabetu 2. typu. Cell Metab. 2019;29(5):1028–44.

18. Kaminen-Ahola N, Ahola A, Maga M, Mallett KA, Fahey P, Cox TC, Whitelaw E, Chong S. Spotřeba ethanolu matkou mění epigenotyp a fenotyp potomků v myším modelu. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000811.

19 Tan X, Liu R, Xing S, Zhang Y, Li Q, Zheng M, Zhao G, Wen J. Genomová detekce klíčových genů a epigenetických markerů pro kuřecí ztučnělá játra. Int J Mol Sci. 2020; 21(5):1800.

20. Hwang JH, An SM, Kwon S, Park DH, Kim TW, Kang DG, Yu GE, Kim IS, Park HC, Ha J a kol. Vzorce methylace DNA a genová exprese spojená s velikostí vrhu v placentě prasat Berkshire. PLoS ONE. 2017;12(9):e0184539.

21. Yu C, Qiu M, Zhang Z, Song X, Du H, Peng H, Li Q, Yang L, Xiong X, Xia B a kol. Sekvenování transkriptomu odhaluje geny zapojené do oxidačního stresu spouštěného kadmiem v kuřecím srdci. Poult Sci. 2021;100(3):100932. 22. Boo SY, Tan SW, Alitheen NB, Ho CL, Omar AR, Yeap SK. Transkriptomová analýza kuřecích intraepiteliálních lymfocytárních přirozených zabíječských buněk infikovaných velmi virulentním virem infekčního onemocnění burzy. Sci Rep. 2020;10(1):18348.

23. Ren L, Liu A, Wang Q, Wang H, Dong D, Liu L. Transkriptomová analýza vývoje embryonálních svalů u kuřete Chengkou Mountain Chicken. BMC Genomics. 2021; 22(1):431.

24. Yang C, Han L, Li P, Ding Y, Zhu Y, Huang Z, Dan X, Shi Y, Kang X. Charakterizace a analýza duodenálního transkriptomu čínského hovězího dobytka s divergentní účinností krmiva pomocí RNA-Seq. Přední Genet. 2021;12:741878.

25. Wang J, Jia R, Gong H, Celi P, Zhuo Y, Ding X, Bai S, Zeng Q, Yin H, Xu S a kol. Vliv oxidačního stresu na kuřecí vaječník: Zapojení mikrobioty a intervence melatoninu. Antioxidanty (Basilej). 2021;10(9):1422.

26. Attia YA, Al-Harthi MA, Abo El-Maaty HM. Hladiny vápníku a cholekalciferolu u nosnic v pozdní fázi: Účinky na produkční vlastnosti, kvalitu vajec, biochemii krve a imunitní odezvy. Front Vet Sci. 2020; 7:389.

27. Moreno J, Osorno JL. Barva ptačích vajec a sexuální výběr: Odráží pigmentace skořápky samičí stav a genetickou kvalitu? Ecol Lett. 2003;6(9):803–6.

28. Afonso S, Vanore G, Batlle A. Protoporfyrin IX a oxidační stres. Free Radic Res. 1999;31(3):161–70.

29. Schwartz-Albiez R, Monteiro RC, Rodriguez M, Binder CJ, Shoenfeld Y. Přírodní protilátky, intravenózní imunoglobulin a jejich role v autoimunitě, rakovině a zánětu. Clin Exp Immunol. 2009;158(Suppl 1):43–50.

30. Martínez-de la Puente J, Merino S, Moreno J, Tomás G, Morales J, Lobato E, García-Fraile S, Martínez J. Jsou skvrnitost vaječných skořápek a barevné indikátory zdraví a kondice u modřinek Cyanistes caeruleus? J Avian Biol. 2007;38(3):377–84.

31. Fagarasan S, Honjo T. Syntéza střevního IgA: regulace obranyschopnosti těla v první linii. Nat Rev Immunol. 2003;3(1):63–72.

32. Zhen W, Shao Y, Wu Y, Li L, Pham VH, Abbas W, Wan Z, Guo Y, Wang Z. Suplementace beta-glukanem ve stravě kvasinek zlepšuje barvu vaječných skořápek a líhnivost plodných vajec a také zlepšuje imunitní funkce u chovatele ležící slepice. Int J Biol Macromol. 2020;159:607–21.

33. Elhamouly M, Nii T, Isobe N, Yoshimura Y. Věkem související modulace vrozeného imunitního obranného systému isthmické a děložní sliznice u nosnic. Poult Sci. 2019;98(7):3022–8.

34. Li J, Qin Q, Li YX, Leng XF, Wu YJ. Expozice tri-ortho-kresylfosfátu vede k nízké produkci vajec a špatné kvalitě vaječných skořápek prostřednictvím narušení vývoje folikulů a funkce skořápkových žláz u nosnic. Ecotoxicol Environ Saf. 2021;225:112771.

35. Fukaya M, Kamata A, Hara Y, Tamaki H, Katsumata O, Ito N, Takeda S, Hata Y, Suzuki T, Watanabe M a kol. SynArfGEF je guanin nukleotidový výměnný faktor za Arf6 a lokalizuje se přednostně v postsynaptických specializacích inhibičních synapsí. J Neurochem. 2011;116(6):1122–37.

36. Hm JW. Synaptické funkce IQSEC rodiny ADP-ribosylačních faktorů guanin nukleotidových výměnných faktorů. Neurosci Res. 2017;116:54–9.

37. Um JW, Choi G, Park D, Kim D, Jeon S, Kang H, Mori T, Papadopoulos T, Yoo T, Lee Y a kol. IQ Motif a SEC7 Domain-obsahující protein 3 (IQSEC3) interaguje s gefyrinem a podporuje tvorbu inhibiční synapse. J Biol Chem. 2016;291(19):10119–30.

38. Kim S, Kim H, Park D, Kim J, Hong J, Kim JS, Jung H, Kim D, Cheong E, Ko J a kol. Ztráta IQSEC3 narušuje udržování GABAergické synapse a snižuje expresi somatostatinu v hippocampu. Cell Rep. 2020;30(6):1995-2005 e1995.

39. Erdö SL, Riesz M, Kárpáti E, Szporny L. GABAB receptorem zprostředkovaná stimulace kontraktility izolovaného králičího vejcovodu. Eur J Pharmacol. 1984;99(4):333–6. 40. Roth FC, Draguhn A. Metabolismus a transport GABA: účinky na synaptickou účinnost. Neural Plast. 2012;2012:805830.

41. Erdő SL, László Á, Szporny L, Zsolnai B. Vysoká hustota specifických vazebných míst GABA v lidském vejcovodu. Neurosci Lett. 1983;42(2):155–60.

42. Erdo SL, Rosdy B, Szporny L. Vyšší koncentrace GABA ve vejcovodu než v mozku krysy. J Neurochem. 1982;38(4):1174–6.

43. Sun X, Chen X, Zhao J, Ma C, Yan C, Liswaniso S, Xu R, Qin N. Transkriptomová srovnávací analýza ovariálních folikulů odhaluje klíčové geny a signální dráhy, které se podílejí na produkci slepičích vajec. BMC Genomics. 2021;22(1):899.

44. Chen X, Sun X, Chimbaka IM, Qin N, Xu X, Liswaniso S, Xu R, Gonzalez JM. Transkriptomová analýza ovariálních folikulů odhaluje potenciální klíčové geny spojené se zvýšenou a sníženou rychlostí produkce slepičích vajec. Přední Genet. 2021;12:622751.

45. Luan X, Liu D, Cao Z, Luo L, Liu M, Gao M, Zhang X. Profilování transkriptomu identifikuje odlišně exprimované geny ve vaječnících husy Huoyan mezi obdobím snášky a obdobím ukončení. PLoS ONE. 2014;9(11):e113211.

46. ​​Cui Z, Zhang Z, Amevor FK, Du X, Li L, Tian Y, Kang X, Shu G, Zhu Q, Wang Y a kol. Cirkadiánní miR-449c-5p reguluje transport Ca(2+) dělohou během kalcifikace vaječných skořápek u kuřat. BMC Genomics. 2021; 22(1):764.

47. Mishra SK, Chen B, Zhu Q, Xu Z, Ning C, Yin H, Wang Y, Zhao X, Fan X, Yang M a kol. Analýza transkriptomu odhaluje odlišně exprimované geny spojené s vysokou mírou produkce vajec v ose hypotalamus hypofýza-ovariální kuřete. Sci Rep. 2020;10(1):5976.

48. Cox PR, Siddique T, Zoghbi HY. Genomická organizace tropomodulinů 2 a 4 a neobvyklý intergenový a intraexonický sestřih YL-1 a tropomodulinu 4. BMC Genomics. 2001;2:7.

49. Cox PR, Zoghbi HY. Sekvenování, analýza exprese a mapování tří unikátních lidských tropomodulinových genů a jejich myších orthologů. Genomika. 2000;63(1):97–107.

50. Yamashiro S, Gokhin DS, Kimura S, Nowak RB, Fowler VM. Tropomoduliny: špičaté koncové proteiny, které regulují architekturu aktinových vláken v různých typech buněk. Cytoskelet (Hoboken). 2012;69(6):337–70.

51. Almenar-Queralt A, Lee A, Conley CA, Ribas de Pouplana L, Fowler VM. Identifikace nové izoformy tropomodulinu, kosterního tropomodulinu, který uzavírá špičaté konce aktinových filamentů v rychlém kosterním svalu. J Biol Chem. 1999;274(40):28466–75.

52. Ren T, Li Z, Zhou Y, Liu X, Han R, Wang Y, Yan F, Sun G, Li H, Kang X. Sekvenování a charakterizace lncRNA v prsním svalu kuřat Gushi a Arbor Acres. Genom. 2018;61(5):337–47.

53. Xu L, Zhao F, Ren H, Li L, Lu J, Liu J, Zhang S, Liu GE, Song J, Zhang L a kol. Analýza koexprese genů souvisejících s hmotností plodu v kosterním svalu ovcí během středních a pozdních fází vývoje plodu. Int J Biol Sci. 2014;10(9):1039–50.

54. Wu Y, Wang Y, Yin D, Mahmood T, Yuan J. Analýza transkriptomu odhaluje molekulární pochopení nikotinamidu a butyrátu sodného na kvalitu masa brojlerů s vysokou hustotou osazení. BMC Genomics. 2020; 21(1):412.

55. Zhang F, Yin ZT, Zhang JF, Zhu F, Hincke M, Yang N, Hou ZC. Integrace transkriptomových, proteomových a QTL dat k objevení funkčně důležitých genů pro tvorbu kachních vaječných skořápek a bílků. Genomika. 2020;112(5):3687–95.

56. Nys Y, Gautron J, Garcia-Ruiz JM, Hincke MT. Mineralizace ptačích skořápek: biochemická a funkční charakterizace matricových proteinů. ČR Palevol. 2004;3(6–7):549–62.

57. Chen CS, Alonso JL, Ostuni E, Whitesides GM, Ingber DE. Tvar buňky poskytuje globální kontrolu sestavy fokální adheze. Biochem Biophys Res Commun. 2003;307(2):355–61.

58 Su H, Zhang H, Wei X, Pan D, Jing L, Zhao D, Zhao Y, Qi B. Srovnávací proteomická analýza vejcovodu Rana chensinensis. Molekuly. 2018;23(6):1384.

59. Zhang T, Chen L, Han K, Zhang X, Zhang G, Dai G, Wang J, Xie K. Transkriptomová analýza vaječníků u relativně větších a menších vajec produkujících Jinghai Yellow Chicken. Anim Reprod Sci. 2019;208:106114.

60. Sun T, Xiao C, Deng J, Yang Z, Zou L, Du W, Li S, Huo X, Zeng L, Yang X. Analýza transkriptomu odhaluje klíčové geny a cesty spojené s produkcí vajec u domácího kuřete Nandan-Yao. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics. 2021;40:100889.

61. Peter AT, Dhanasekaran N. Apoptóza granulózních buněk: přehled role signalizačních modulů MAPK. Reprod Domest Anim. 2003;38(3):209–13.

62. Jeong W, Kim J, Ahn SE, Lee SI, Bazer FW, Han JY, Song G. AHCYL1 je zprostředkován estrogenem indukovanou ERK1/2 MAPK buněčnou signalizací a mikroRNA regulací k ovlivnění funkčních aspektů ptačího vejcovodu. PLoS ONE. 2012;7(11):e49204.

63. Wang J, Huang X, Zhang K, Mao X, Ding X, Zeng Q, Bai S, Xuan Y, Peng H. Vanadátové oxidační a apoptotické účinky jsou zprostředkovány cestou MAPK-Nrf2 ve vrstvách epiteliálních buněk vejcovodu magnum. Metalomika. 2017;9(11):1562–75.

64. Tao Z, Song W, Zhu C, Xu W, Liu H, Zhang S, Huifang L. Srovnávací transkriptomická analýza kachních vaječníků s vysokou a nízkou produkcí vajec. Poult Sci. 2017;96(12):4378–88.

65. Shioda K, Odajima J, Kobayashi M, Kobayashi M, Cordazzo B, Isselbacher KJ, Shioda T. Transkriptomické a epigenetické zachování genetické sexuální identity u estrogenem feminizovaných mužských kuřecích embryonálních gonád. Endokrinologie. 2021;162(1):bqaa208.

66. Huang YZ, Sun JJ, Zhang LZ, Li CJ, Womack JE, Li ZJ, Lan XY, Lei CZ, Zhang CL, Zhao X a kol. Profily metylace DNA v celém genomu a jejich vztahy s mRNA a transkriptomem mikroRNA ve svalové tkáni skotu (Bos taurin). Sci Rep. 2014;4:6546.

67. Tan X, Liu R, Zhang Y, Wang X, Wang J, Wang H, Zhao G, Zheng M, Wen J. Integrovaná analýza methylomu a transkriptomu kuřat s hemoragickým syndromem ztučnění jater. BMC Genomics. 2021; 22(1):8.

68. Fu Y, Li J, Tang Q, Zou C, Shen L, Jin L, Li C, Fang C, Liu R, Li M a kol. Integrovaná analýza methylomu, transkriptomu a miRNAomu tří plemen prasat. Epigenomika. 2018;10(5):597–612.

69. Lawrence M, Daujat S, Schneider R. Laterální myšlení: jak modifikace histonů regulují genovou expresi. Trends Genet. 2016;32(1):42–56.

70. Zhao BS, Roundtree IA, He C. Post-transkripční genová regulace modifikacemi mRNA. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(1):31–42.

71. Chakravarti B, Abraham GN. Stárnutí a imunita zprostředkovaná T-buňkami. Mech Aging Dev. 1999;108(3):183–206.

72. Camougrand N, Rigoulet M. Stárnutí a oxidační stres: studie některých genů, které se podílejí jak na stárnutí, tak v reakci na oxidační stres. Respir Physiol. 2001;128(3):393–401.

73. Ribezzo F, Shiloh Y, Schumacher B. Systémové reakce na poškození DNA při stárnutí a nemocech. Semin Cancer Biol. 2016;37–38:26–35.

74. Orr WC, Radyuk SN, Prabhudesai L, Toroser D, Beneš JJ, Luchak JM, Mockett RJ, Rebrin I, Hubbard JG, Sohal RS. Nadměrná exprese glutamát-cystein ligázy prodlužuje životnost u Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 2005;280(45):37331–8.

75. Park DS, Cohen AW, Frank PG, Razani B, Lee H, Williams TM, Chandra M, Shirani J, De Souza AP, Tang B a kol. Myši Caveolin{1}} null (-/-) vykazují dramatické zkrácení délky života. Biochemie. 2003;42(51):15124–31.

76. Park JW, Ji YI, Choi YH, Kang MY, Jung E, Cho SY, Cho HY, Kang BK, Joung YS, Kim DH a kol. Polymorfismy kandidátských genů pro diabetes mellitus, kardiovaskulární onemocnění a rakovinu jsou u Korejců spojeny s dlouhověkostí. Exp Mol Med. 2009;41(11):772–81.

77. Jakobs PM, Hess JF, FitzGerald PG, Kramer P, Weleber RG, Litt M. Autosomálně dominantní kongenitální katarakta spojená s deleční mutací v genu proteinu lidského perličkového filamenta BFSP2. Am J Hum Genet. 2000;66(4):1432–6.

78. Conley YP, Erturk D, Keverline A, Mah TS, Keravala A, Barnes LR, Bruchis A, Hess JF, FitzGerald PG, Weeks DE, et al. Progresivní lokus katarakty s juvenilním nástupem na chromozomu 3q21-q22 je spojen s missense mutací ve strukturním proteinu korálkového flamentu-2. Am J Hum Genet. 2000;66(4):1426–31.

79. Kumar P, Kasiviswanathan D, Sundaresan L, Kathirvel P, Veeriah V, Dutta P, Sankaranarayanan K, Gupta R, Chatterjee S. Sklízení vodítek z analýzy transkriptomu širokého genomu pro zkoumání anomálií zprostředkovaných thalidomidem ve vývoji oka embrya kuřat oxid napravuje anomálie zprostředkované thalidomidem tím, že systém vrátí zpět do normálního transkriptomového vzoru. Biochimie. 2016;121:253–67.

80. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fastp: ultrarychlý all-in-one FASTQ preprocesor. Bioinformatika. 2018;34(17):i884–90.

81. Kim D, Paggi JM, Park C, Bennett C, Salzberg SL. Zarovnání genomu a genotypování založené na grafu s genotypem HISAT2 a HISAT. Nat Biotechnol. 2019;37(8):907–15.

82. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R, Genome Project Data Processing S. Formát Sequence Alignment/Map a SAMtools. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–9.

83. Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: účinný univerzální program pro přiřazování čtení sekvencí genomickým znakům. Bioinformatika. 2014;30(7):923–30.

84. Love MI, Huber W, Anders S. Moderovaný odhad násobné změny a disperze pro data RNA-seq s DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.

85. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, et al. Analýza obohacení genové sady: znalostní přístup pro interpretaci profilů exprese v celém genomu. Proč Natl Acad Sci USA A. 2005;102(43):15545–50.

86. Krueger F, Andrews SR. Bismark: flexibilní zarovnávač a methylační vyvolávač pro aplikace Bisulfte-Seq. Bioinformatika. 2011;27(11):1571–2.

87. Jones PA. Funkce methylace DNA: ostrovy, startovací místa, genová těla a další. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484–92.

88. Akalin A, Kormaksson M, Li S, Garrett-Bakelman FE, Figueroa ME, Melnick A, Mason CE. methylKit: komplexní balíček R pro analýzu procesů metylace DNA v celém genomu. Genome Biol. 2012;13(10):R87.

89. Zhou Y, Zhou B, Pache L, Chang M, Khodabakhshi AH, Tanaseichuk O, Benner C, Chanda SK. Metascape poskytuje zdroj orientovaný na biologa pro analýzu datových sad na systémové úrovni. Nat Commun. 2019;10(1):1523.