Celkové glykosidy Cistanche Deserticola podporují obnovu neurologických funkcí indukcí neurovaskulární regenerace
Mar 29, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* a Yong Jiang1*
Pozadí:Tradiční čínská medicína Cistanche deserticola je údajně účinná při kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních onemocněních. Jeho aktivní složky pro ochranu před ischemickou cévní mozkovou příhodou však nejsou jasné. Naším cílem bylo prozkoumat aktivní složky C. deserticola proti ischemické cévní mozkové příhodě a také její potenciální mechanismy.
Metody:Zkoumali jsme mozkové ochranné účinky extraktů z C. deserticola, celkových glykosidů (TG), polysacharidů (PS) a oligosacharidů (OS) na potkaním modelu okluze-reperfuze střední mozkové tepny (MCAO/R). 2, 3, 5-K vyhodnocení objemu mozkového infarktu bylo použito barvení trifenyltetrazoliumchloridem (TTC) a pro hodnocení permeability hematoencefalické bariéry (BBB) byl použit test Evansblue. Poté výrazy CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin{11}}, occludin,Keap{12}} a Nrf{13 }} byly analyzovány pomocí western blotu nebo imunofluorescence a aktivity MDA, SOD, CAT a GSH-Px byly analyzovány pomocí souprav.
Výsledek:Léčba TG významně snížila skóre neurologického deficitu a objemy infarktů, podpořila angiogenezi a neurální remodelaci a účinně udržovala integritu krevní-mozkové bariéry ve srovnání s modelovou skupinou. Kromě toho TG významně snížil hladiny MDA a zvýšil antioxidační aktivity (SOD, CAT a GSH-Px) v mozcích. Mezitím TG pozoruhodně snížily expresi Keep-1 a usnadnily jadernou translokaci Nrf-2. Naopak u skupin PS a OS nebyly pozorovány žádné ochranné účinky.
Závěr:TG jsou hlavními aktivními složkami C. deserticola proti poškození mozku vyvolanému MCAO/R a ochrana je zajištěna hlavně cestou Nrf-2/Keap-1.
klíčová slova:Cistanche deserticola,cerebrální poranění, celkové glykosidy, polysacharidy, oligosacharidy, dráha Nrf-2/Keap{1}}
cistanche amazon deserticola
ÚVOD
Cévní mozkové příhody jsou ve světě považovány za hlavní příčinu úmrtí a invalidity (Donnan et al., 2008). Téměř 87 procent všech případů mrtvice je vyvoláno ischemickou mrtvicí (Ovbiagele a Nguyen-Huynh, 2011). V současnosti je nejúčinnějším prostředkem a jediným lékem schváleným FDA používaným k léčbě ischemické cévní mozkové příhody rekombinantní tkáňový aktivátor plasminogenu. Velké množství pacientů s cévní mozkovou příhodou však na tento lék nereaguje kvůli jeho úzkému terapeutickému časovému oknu a vážnému riziku hemoragických komplikací (Lee et al., 2012; Schellinger a Kohrmann, 2014). Hlavním problémem trombolytické léčby je ischemicko/reperfuzní (I/R) poškození, které je považováno za hlavní příčinu poškození mozku a destrukce funkce. Reperfuze po cerebrální ischemii zvyšuje riziko krvácení do mozku a zároveň vede k neurovaskulárnímu poškození a produkci nadměrně reaktivních forem kyslíku (ROS), které poškozují hematoencefalickou bariéru (Alluri et al., 2015). Řada studií potvrdila, že narušení BBB je hlavní příčinou patogeneze ischemické cévní mozkové příhody (Cao et al., 2016b).
BBB se skládá hlavně z endoteliálních buněk, pericytů, astrocytů, neuronů a bazálních membrán. Základními složkami BBB jsou cerebrální mikrovaskulární endoteliální buňky, které jsou spojeny těsnými spoji, čímž omezují exogenní molekuly do mozku. Patologické změny těsných spojů – zejména occludin, claudin{0}} a zonulaocludens-1 (ZO-1) – významně ovlivňují funkci BBB během ischemické mozkové příhody, zejména propustnost bariéry (Liuet al., 2014 Hu a kol., 2018; Liu a kol., 2019). Během I/R období je nadměrná ROS jedním z hlavních faktorů vedoucích k přímému poškození mozkových neuronů (Ding et al., 2014). Nadprodukce ROS vede k degradaci určitých spojení a narušení BBB, což vede k tomu, že exogenní molekuly vstupují do mozku přes BBB, což vede ke zhoršení poškození mozku (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Proto byla ochrana BBB antioxidanty považována za potenciální způsob prevence reperfuzního poškození.
Kromě rozpadu BBB může I/R vést k neurovaskulárnímu poškození a smrti neuronů (Jung et al., 2010). Během mrtvice může být zvýšená smrt neuronových buněk důsledkem oxidačního stresu (Chi et al., 2018) a četné studie ukázaly, že ROS zhoršuje závažnost mrtvice a neurologické poškození (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Přestože klinické studie nepřinesly uspokojivé výsledky, neuroprotekce je stále slibnou strategií pro léčbu akutní ischemické cévní mozkové příhody (Moretti et al., 2015). Nalezení účinných neuroprotektivních léků k léčbě mrtvice je tedy přínosem pro pacienty s mrtvicí.
Tradiční čínská medicína (TCM) přijímá opatření k zásahu proti vnitřní nerovnováze organismu (Gaire, 2018). Vzhledem ke složité patogenezi ischemických cévních mozkových příhod hraje v léčbě cévních mozkových příhod rozhodující roli jejich multifaktoriální účinek TČM a jejích aktivních složek. Cistanche deserticola YC Ma, rozšířená v aridních nebo polosuchých oblastech po celém Mongolsku a severozápadní Číně, je v Číně více než 1,{3}} rok široce používaná bylina TCM k léčbě různých nemocí, jako je zapomnětlivost a deprese. Moderní farmakologické studie ukázaly, že surové extrakty z C. deserticola vykazovala četné farmakologické účinky, jako je zlepšení funkce učení a paměti, neuroprotekce, posílení imunity, antioxidační, anti-aging a antiúnavové účinky (Ko a Leung, 2007; Wang a kol., 2012; Li a kol., 2015). Chemická analýza of C. deserticola ukázal, že jeho hlavní složky zahrnují fenylethanoidní glykosidy, iridoidní glykosidy, polysacharidy a oligosacharidy (Jiang a Tu, 2009). Avšak aktivní složky C. deserticola pro ochranu mozku nejsou příliš jasné.
Neuroprotektivní vlastnost C. deserticola implikuje její terapeutický potenciál u kognitivních onemocnění, jako je mrtvice a deprese, stejně jako Alzheimerova choroba (Wang et al., 2017). Výzkum vlivu mrtvice C. deserticola, včetně jejích aktivních složek a mechanismů působení, je však velmi omezený. V této práci jsme zkoumali ochranný účinek tří extraktů z C. deserticola, celkových glykosidů (TG, fenylethanoidní glykosidy a další glykosidy), polysacharidů (PS) a oligosacharidů (OS) na cerebrální I/R poranění. Naše zjištění mohou přispět k přesné klinické aplikaci C. deserticola a poskytnout kandidáta na léčbu ischemické cévní mozkové příhody.
Cistanche má tléčebný potenciálu kognitivních onemocnění, jako je mrtvice a deprese,stejně jako Alzheimerova choroba.
MATERIÁLY A METODY
Chemikálie a činidla
Stonky Cistanche deserticola byly zakoupeny z Alashanu ve Vnitřním Mongolsku a identifikovány jedním z autorů (P.-F. Tu). TG, PS a OS byly připraveny podle naší dříve uvedené metody (Gao et al., 2015). . Kvantitativní analýza TGs byla provedena vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), jak bylo popsáno dříve (Li et al, 2019), a její chromatogram je znázorněn na obrázku 1. Hlavními složkami TG jsou echinakosid, tubulosid A, akteosid, isoakteosid a 2'- acetylakteosid; jejich obsahy jsou 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g, respektive 12,045 mg/g. Obsah PS a OS je 69,42 procent a 65,24 procent, v daném pořadí, jak bylo stanoveno pomocí HPLC a analýzy fenol-kyselina sírová (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).
Standardní reference echinakosidu (A0282), tubulosidu A (A0942), akteosidu (A0280), isoakteosidu (A0281) a 2'-acetylakteosidu (A0943) byly zakoupeny od Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, Čína). Čistota všech standardů je více než 98 procent. Sady Nissl Stain H&E byly zakoupeny od Boster (Wuhan, Čína). Edaravone (T0407-1) byl zakoupen od společnosti TargetMol (Shanghai, Čína). Králičí antikrysí MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap{15}} (ab66620) a myší antikrysí CD31 (ab24590) byly zakoupeny od Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Králičí anti-krysí Claudin5 (BS1069), ZO{23}} (BS9802M) a Occludin (BS72035) byly zakoupeny od Bioworld Technology (Nanjing, Čína). Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, USA) byl zdrojem králičího anti-krysího synapsinu-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actinu (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) byl zakoupen od Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Sekundární protilátky byly dodány společností Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Peking, Čína). Hoechst 33258 byl získán z Beyotime (Jiangsu, Čína).
OBRÁZEK 1|HPLC chromatogramy TG (A) a standardní reference (B).
Zvířata
Potkani Sprague-Dawley (samci, vážící 250–300 g) byli získáni od Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Čína) a umístěni v klimatizované místnosti udržované v cyklu světlo/tma 12 hodin. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny ARRIVE pro výzkum na zvířatech (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) a schváleny InstitutionalAnimal Care and Use Committee of Peking University HealthScience Center (LA2019123).
Experimentální protokoly na zvířatech
Krysy byly podrobeny MCAO/R, jak bylo popsáno dříve (Wang et al., 2018). Stručně řečeno, levá společná krkavice (CCA), vnější krkavice (ECA) a vnitřní krkavice (ICA) a 3-0 nylonová monofilamentární sutura byla vložena z ECA do ICA, dokud nedosáhla střední mozkové tepny ( MCA). Po 1,5 h okluze MCA byla simulována reperfuze odstraněním vlákna. Během chirurgického zákroku byla tělesná teplota všech potkanů udržována na 37,0 °C.
Správa léčiv
Krysy byly náhodně rozděleny do šesti skupin pomocí softwaru SPSS verze 22.0, jak je popsáno (Jiang et al., 2014): normální skupina (NOR); modelová skupina (MOD); skupina edaevavon (pozitivní lék, 6 ml/kg, EDI); skupina TG (280 mg/kg, TG); Skupina PSs (280 mg/kg, PSs) a skupina OSs (280 mg/kg, OSs). TG, PS a OS byly podávány ig jednou denně po MCAO/R po dobu 14 dnů. Skupiny NOR a MOD byly ošetřeny fyziologickým roztokem. Počty zvířat jsou uvedeny v tabulce 1.
TABULKA 1|Počet zvířat pro různé experimentální skupiny a různé parametry 14 dní po podání.
Měření hmotnosti a upravené skóre neurologického deficitu (mNSS)
Tělesná hmotnost byla monitorována 14. den pomocí ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). NSS byla hodnocena podle metody popsané FJ Wangem (Wang et al., 2018), s menšími revizemi.
2, 3, 5-Barvení trifenyltetrazoliumchloridem (TTC).
Objem infarktu byl měřen, jak bylo popsáno dříve (Wanget al., 2015). Stručně řečeno, mozky byly rozděleny do sedmi rovnoměrně rozmístěných koronálních bloků (2 mm). Tyto řezy byly obarveny 2% TTC (Coolaber, Peking, Čína) při 37 stupních po dobu 15 minut. Infarctvolume ( procento )=(objem ipsilaterální ischemické hemisféry – objem kontralaterální ischemické hemisféry)/objem kontralaterální ischemické hemisféry × 100.
Barvení Nissl a H&E
Krysy byly hluboce anestetizovány a celý mozek byl poté rychle vyjmut z lebky a fixován pomocí 4% paraformaldehydu a zalit do parafinového vosku a nakrájen na plátky o tloušťce 7 um. Řezy byly obarveny Nissl a H&E. V této studii bylo v každém vzorku tkáně pomocí světelného mikroskopu zachyceno šest náhodných polí 200 × 200 µm. Počet Nisslových těl byl počítán pomocí softwaru IPP verze 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).
Evans Blue Assay
Krysám byla po MCAO/R injikována 2% EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD). O dvě hodiny později byly krysy anestetizovány a celý mozek byl poté rychle odstraněn a homogenizován v acetonu. Supernatanty byly analyzovány při 620 nm čtečkou absorbance 800 TS (BioTek, USA).
Měření aktivity katalázy (CAT), superoxiddismutázy (SOD), malondialdehydu (MDA) a glutathionperoxidázy (GSH-Px)
Všechny vzorky séra byly centrifugovány při 4, 000 × ot./min. po dobu 15 minut při 4 stupních a poté analyzovány k detekci aktivit MDA, CAT, SOD a GSH-Px podle pokynů výrobce (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. , Čína).
Western blotting analýza
Mozkové tkáně (100 mg) odebrané od každé krysy byly homogenizovány a lyžovány v RIPA lyzačním pufru a poté analyzovány pro detekci koncentrace proteinu pomocí BCA kitu (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Tkáňové celkové proteiny byly naneseny na 10% SDS-PAGE gely a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla blokována pomocí 5% odstředěného mléka, poté inkubována přes noc s primárními protilátkami při 4 stupních. Membrána byla poté inkubována se sekundární protilátkou. Analýza Western blot byla analyzována pomocí Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Čína).
Imunofluorescenční analýza
Bylo provedeno imunofluorescenční barvení pro CD31, a-SMA, ZO-1,claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 aKeap-1. Primární protilátky proti Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludinu, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 a Keap-1 byly naředěny na 1:200 a 1:100. Sekundární protilátky Alexa Flur 488 myší anti-králičí IgG a rhodamin (TRITC) kozí anti-králičí IgG byly obě naředěny na 1:200. Jádra byla obarvena pomocí Hoechst 33258. Snímky byly zachyceny pomocí Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Exprese proteinu byla analyzována pomocí softwaru IPP verze 6.0.
Statistická analýza
Všechna data byla popsána jako průměr ± SD. Pro statistickou analýzu byla provedena verze softwaru SPSS 22.{1} Při porovnávání různých skupin byla použita jednocestná ANOVA. P < 0.05="" bylo="" považováno="" za="" statistický="">
cistanche kulturistická neuroprotekce
VÝSLEDEK
TG zvyšují tělesnou hmotnost a snižují poškození mozku u potkanů MCAO/R
Po 14 dnech léčby pomocí TG, PS, Oss a EDI byly vyhodnoceny tělesné hmotnosti, neurologické deficity a infarktové objemy I/R potkanů. Výsledky ukázaly, že tělesné hmotnosti ve skupině MOD byly výrazně sníženy, zatímco snížené hmotnosti ve skupinách TG, PS a EDI byly zjevně zvýšené (obrázek 2A). Skóre neurologického deficitu bylo podstatně sníženo pomocí EDI a TG (obrázek 2B). Mozkové řezy u krys skupiny NOR byly tmavě červené a nebyly tam žádné infarkty, zatímco krysy skupiny MOD vykazovaly velký ipsilaterální mozkový infarkt. Po léčbě TG byly objemy infarktu významně sníženy (obrázky 2C, D). Léčba PS a OS nevykazovala žádný zřejmý vliv na výše uvedené indexy. Výše uvedená data ukázala, že TG by mohly výrazně zmírnit I/R-indukované cerebrální poranění, ale PSs a OS nemohly.
OBRÁZEK 2|TG snižují poškození mozku vyvolané přechodnou fokální cerebrální ischemií.
TG zlepšují histopatologické poškození u MCAO/R potkanů
Aby bylo možné určit některé účinky léčby TG, PS a OS na histopatologická poškození, bylo provedeno barvení H&E, aby se odhalilo patologické poškození. Histomorfologické struktury mozků ve skupině NOR byly uspořádány pravidelně. Morfologické změny ve skupinách TGs byly mírnější než ve skupině MOD. Avšak léčebné skupiny PS a OS nevykázaly žádné významné zlepšení morfologických změn (obrázek 3).
TG zmírňují neuronální poranění po I/R-indukovaných krysách
Nissl barvení ukázalo histopatologické změny neuronů v polostínu ischemické oblasti. Jak je znázorněno na obrázku 4, normální neurony měly jasné jadérko a neporušenou strukturu. Ve skupině MOD měly neurony zvětšené mezibuněčné prostory. Nisslbody zmizela, byla scvrklá a hluboce zašpiněná. Tyto změny však byly zřídka pozorovány ve skupinách EDI, TG a PS. Tyto výsledky ilustrovaly, že TG a PS mohou významně zmírnit poškození neuronů vyvolané ischemií/reperfuzí.
TG zmírňují narušení BBB po krysách ošetřených I/R
Evansova modř je klasická metoda pro výzkum změny permeability BBB. Výsledky experimentu ukázaly, že zvýšené množství Evansovy modři bylo pozorováno ve skupině MOD, zatímco u krys ošetřených TG a EDI bylo významně sníženo Evansova modř. Navíc nebyl žádný významný rozdíl mezi terapeutickými skupinami PS a OS (obrázek 5). Tyto výsledky naznačují, že TG by mohly významně zmírnit narušení BBB.
OBRÁZEK 3|TG zlepšují histopatologické poškození u MCAO/R potkanů.
TG podporují angiogenezi u I/R zraněných potkanů
Novější studie ukazují, že angiogeneze hraje zásadní roli v neurologickém funkčním zotavení a prognostickém výsledku po akutní ischemické cévní mozkové příhodě (Yuen et al., 2015). K vyhodnocení účinků TG, PS a OS na angiogenezi byly CD31 a a-SMA použity ke kvantifikaci počtu kapilár. Imunofluorescenční barvení ukázalo, že skupina MOD způsobila výrazné snížení exprese CD31 (obrázky 6A, B) a a-SMA (obrázky 6C, D) v polostínu ischemických oblastí I/Rkrys ve srovnání s normálními potkany. Tento výsledek ukázal, že I/R může způsobit vaskulární poškození v kortexu polostínu ischemických hemisfér. Léčba TG a EDI však výrazně zvýšila hustotu kapilár, angiogenezi a arteriogenezi, jak je indikováno zvýšenou expresí CD31 a a-SMA. Tyto výsledky naznačují, že TG by mohly podporovat angiogenezi v ischemickém polostínu I/R potkanů, ale PSs a OS ne.
TG zvyšují expresi proteinů Tight Junction u I/R zraněných krys
Narušení BBB může zvýšit obsah vody v mozku a otok tkání, což vede k poškození mozku. Proteiny těsného spojení jsou důležitými strukturálními složkami BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Aby se otestovalo, zda léčba TG, PS a OS po cévní mozkové příhodě může ovlivnit integritu BBB, byly pomocí imunofluorescenční analýzy provedeny exprese ZO-1, claudinu-5 a okludinu. Výsledky ukázaly, že exprese claudinu-5, okludinu a ZO-1 byly ve skupině MOD viditelně sníženy. Po 14 dnech podávání TG však byly podstatně zvýšeny. Skupiny PS a OS nevykazovaly žádné významné změny v těchto proteinových expresích (obrázek 7). Tato data naznačují, že TG mohou regulovat expresi proteinů s těsným spojením a pravděpodobně zachovávají integritu BBB po poškození I/R.
TG zvyšují pokrytí pericytů na kapilárách u I/R zraněných krys
Pokrytí pericytů na kapilárách hraje zásadní roli při udržování integrity BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Testovali jsme tedy, zda lze pokrytí pericytů zvýšit léčbou TG, PS a OS. Výsledky analýzy intenzity imunofluorescence ukázaly, že exprese PDGFRb i CD31 byly ve skupině MOD dramaticky sníženy. Podání TG krysám I/R významně obnovilo nebo dokonce zvýšilo intenzitu exprese PDGFRb a CD31, ale ve skupinách léčených PSs a OSs nebyl pozorován žádný rozdíl (obrázek 8). Léčba TG by tedy mohla významně zvýšit pokrytí pericytů. Tato zjištění dále potvrdila, že TG mohou zachovat integritu BBB po I/R.
TG podporují neurální remodelaci u krys s poraněním I/R
Podle četných studií může neurogeneze po mrtvici významně zlepšit funkční zotavení (Grefkes a Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), proteiny postsynaptické hustoty 95 (PSD-95) a protein 2 spojený s mikrotubuly (MAP-2) byly použity jako markery pro vyšetření neuronální plasticity v ischemickém polostínu kůry. Za účelem posouzení účinků TG, PS a OS na neurogenezi u I/R zraněných potkanů byly provedeny imunofluorescence a western blot pro SYN, PSD95 a MAP-2 exprese. Jak je znázorněno na obrázcích 9 a 10, hladiny exprese SYN, PSD95 a MAP-2 u I/Rrats po 14 dnech reperfuze poklesly ve srovnání s potkany NOR, zatímco vyléčení TGs a PSs mohlo významně zvýšit hladinu jejich exprese . Skupina OS nevykazovala žádnou významnou změnu ve srovnání se skupinou MOD. Údaje naznačovaly, že léčba TG a PS byla schopna dramaticky podpořit neurální remodelaci po poranění I/R.
TGs Alter Nrf-2 and Keep{1}} Expressions in I/R Injured Rats
Oxidační stres je hlavním patogenním mechanismem při poranění I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Studie potvrdily, že Nrf-2 je hlavním regulátorem antioxidačních reakcí (Thompson et al., 2015). Abychom prozkoumali oxidativní odezvy zprostředkované Nrf-2 a Keap-1 po poranění I/R, vyhodnotili jsme cytoplazmatickou expresi a také jadernou translokaci Keap-1. Mezitím exprese Nrf{{7 }} v I/R poraněných mozkových tkáních potkanů byl také testován (obrázky 10 a 11). Podle imunofluorescenční analýzy bylo zjištěno, že Nrf{10}} se nachází hlavně v cytoplazmě ve skupině NOR. Ve skupině TGs byla exprese Nrf-2 v cytoplazmatické lokalizaci downregulována, ale upregulována v jádře, a byla také pozorována snížená exprese Keap{12}}. Data ukázala, že ochrana mozku TG by mohla být spojena s modulací Nrf-2 a Keap-1.
OBRÁZEK 4|TG zmírňují neuronální poškození po I/R-léčených krysách.
TG zmírňují oxidační stres mozkové tkáně u potkanů zraněných I/R
Aby se potvrdily antioxidační účinky TG, byly hodnoceny aktivity SOD, CAT, GSH-Px a MDA u I/R zraněných potkanů. Na obrázku 12 byl obsah MDA výrazně zvýšen ve skupině MOD a současně byly sníženy aktivity SOD, CAT a GSH-Px ve srovnání s normálními potkany. Naopak léčba TG vedla k významnému poklesu v obsahu MDA a zvýšení aktivit SOD, CAT a GSH-Px. Tyto výsledky dále potvrdily antioxidační aktivitu TG.
DISKUSE
Mnoho studií naznačuje, že TCM C. deserticola má rozsáhlé biologické aktivity, např. zlepšuje schopnost učení, paměť a imunitu (Dong a kol., 2007; Jiang a Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia a kol., 2018 ). Nicméně aktivní složky C. deserticola pro neuroprotekci zůstávají nejasné. Současná práce se zaměřuje na screening aktivních složek z C. deserticola proti ischemické cévní mozkové příhodě na modelu MCAO/R. Tři extrakty z C. deserticola (TG, PS a OS) byly použity k hodnocení jejich účinků na MCAO/R potkany, stejně jako možných mechanismů.
Cévní mozková příhoda je běžné akutní cerebrovaskulární onemocnění. Epidemiologické studie ukazují, že mrtvice je častější u mužů než u žen (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik a Bushnell, 2017). V našem experimentu tedy byli pro testy adoptováni samci potkanů. Naše výsledky prokázaly, že indukce I/R zrychlila oxidační stres a objem infarktu, porušila BBB a vedla k poškození nervů a cerebrovaskulárních cév. Po screeningu bylo zjištěno, že TG snižují objem infarktu a podporují neurální remodelaci a angiogenezi. Navíc bylo pozorováno, že TG udržují integritu BBB po I/R poranění. Naopak, PS a OS nepřinášejí žádné významné zmírnění I/R zranění. TG jsou tedy považovány za hlavní aktivní frakci C. deserticola pro neuroprotekci, potenciálně prostřednictvím podpory neurální remodelace, angiogeneze a integrity BBB prostřednictvím aktivace dráhy Nrf-2/Keap-1.
OBRÁZEK 5|TG zmírňují narušení BBB po poranění I/R.
Přibývající důkazy naznačují, že zavedení účinného kolaterálního oběhu je významně důležité pro zamezení vzniku infarktu a ischemické polostínu a je kritickou léčbou v časném stadiu ischemické cévní mozkové příhody (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferace vaskulárních endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva po ischemickém infarktu určuje vytvoření kolaterální cirkulace. Modely ischemie však mají společný fenomén – to znamená oxidační stres široce rozšířený v mozkové mikrovaskulatuře. Údaje ze studií ukázaly, že velké množství antioxidantů může narušit funkci BBB a vlastnosti angiogeneze (Mentor a Fisher, 2017). CD31 a a-SMA jsou markery vaskulárních endoteliálních buněk, respektive buněk hladkého svalstva (Saboor et al., 2016). Pro zkoumání vlivu na výše uvedenou buněčnou proliferaci extraktů z C. deserticola jsme zkoumali exprese CD31 a a-SMA v homogenátu mozkové ischemické penumbry. Naše data ukázala, že TG výrazně zvýšily expresi CD31 a a-SMA. U skupin PS a OS však nebyly žádné významné rozdíly. Proto jsme odvodili, že TG mohou snížit poškození mozku podporou angiogeneze prostřednictvím zvýšení exprese CD31 a a-SMA, zatímco PS a OS neposkytují žádnou takovou ochranu před poškozením mozku. Tyto výsledky dále potvrdily, že pouze TG může zabránit poranění mozku I/R.
Ischemickou cévní mozkovou příhodu lze považovat za důsledek cerebralichemie způsobené poruchou neuronální plasticity nebo remodelací oblastí mozku. Většina pacientů s mrtvicí trpí neurologickým deficitem. Aktivace neurogeneze je slibnou strategií pro pacienty s mrtvicí ke zlepšení jejich neurologických funkcí (Cramer a Chopp, 2000). Neurogeneze se přímo podílí na obnově neurologických funkcí po I/Rinjury mozku (Zhang et al., 2019). Předchozí výzkumy ukazují, že TG mohou zlepšit míru přežití hipokampálních pyramidálních buněk a indukovat neurogenezi (Lian et al., 2017). Oxidační stres způsobuje ztrátu neuronů při mnoha onemocněních, jako je Parkinson, mrtvice a tak dále (Duan a Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2přepisuje mnoho genů souvisejících s neuroprotekcí v oblasti jejich promotoru, včetně SOD, MDA, CAT a g glutamylcystein ligáz atd. (Satoh et al., 2006). Proteiny SYN, PSD-95 a MAP-2, které jsou úzce spojeny se synaptickou formací a neurotransmisí, lze považovat za markery výzkumné neuronální plasticity v oblasti ischemického polostínu. Po prostudování jsme zjistili, že léčba TG by mohly významně zvýšit expresi PSD95, SYN a MAP-2, což naznačuje, že cerebrální ochrana TG byla v korelaci se zvýšenou neuronální plasticitou během I/R. Je však škoda, že zde není žádný zřejmý rozdíl ani pro PSs jako skupiny OS. Tyto výsledky naznačují, že TG mohou zvýšit neuroplasticitu po cerebrálním I/R poranění.
Zobrazovací výzkum u pacientů s mrtvicí ukázal, že dysfunkci BBB lze považovat za pozoruhodný atribut periischemického mozku (Bang et al., 2007). TJ, které se skládají z cytoplazmatických proteinů, transmembránových proteinů a spojovacích adhezních molekul mezi kapilárními endoteliálními buňkami, jsou velmi důležité pro udržení integrity BBB (Ye et al., 2019). Mezi nimi jsou ZO-1, claudin-5 a okludin nejdůležitější proteiny v TJ. Přibývající důkazy naznačují, že zvýšená permeabilita BBB vyvolaná ischemií obecně koreluje se změnami ZO-1, claudinu-5 a okludinu (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu a kol., 2018). V této práci výsledky prokázaly, že ačkoli TG mohly významně zvýšit expresi proteinů ZO-1, claudinu-5 a andokludinu v mozkových tkáních vyvolaných MCAO, nedělaly to ani PSs ani OS. BBB se skládá z mozkových endoteliálních buněk a je úzce spojen s pericyty (Nyul-Toth et al., 2016). Pericyty jsou životně důležité pro integritu BBB (Bell et al., 2010). Ischemická mrtvice spouští smrt pericytů a odloučení od mozkových endoteliálních buněk v akutní fázi, čímž destabilizuje mikrovaskulaturu a mění vlastnosti BBB (Zechariahet al., 2013). Naše data ukázala, že TG mohou zvýšit pokrytí pericytů na kapilárách a zvýšit hladiny exprese ZO-1, claudinu-5 a okludinu. Tyto jevy prokázaly, že TG mohou účinně chránit integritu BBB po cerebrálním I/R poranění. Stručně řečeno, TG mohou zmírnit cerebrální poškození mnoha způsoby, jako je podpora angiogeneze, zlepšení neuronální plasticity a udržení integrity BBB.
Poté jsme zkoumali signální dráhu, abychom prozkoumali mechanismus, který je základem ochrany mozku TG. Proces I/R poškození je multifaktoriální, a proto se na patogenezi podílí řada mechanismů. Oxidační stres je základním rizikovým faktorem přispívajícím k I/R-indukovanému poranění mozku (Suda et al., 2013), jako je poškození struktury BBB, vaskulární endoteliální dysfunkce a zhoršení ischemického poškození neuronů (Xiong et al., 2015; Caglayan et al. al., 2019; Priestley et al., 2019). Oxidační stres se tak stal atraktivním terapeutickým cílem při poranění mozku vyvolaném I/R. Enzymy fáze 2, které jsou zprostředkovány 2-faktorem souvisejícím s jaderným faktorem E-2 (Nrf-2), byl považován za důležitý prostředek, kterým se neurony chrání před oxidačním stresem (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Přibývající důkazy naznačují, že aktivace Nrf-2 během I/R je potenciálním terapeutickým cílem neuroprotekce (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, jako důležitý regulátor endogenní antioxidační obrany, zprostředkovává hladinu hemoxygenázy 1 (HO-1) a dalších antioxidačních enzymů, jako je NAD(P)H chinonoxidoreduktáza1 (NQO1), SOD, CAT, GSH a MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Kromě toho hraje Nrf-2 důležitou regulační roli v angiogenezi. Tato studie ukazuje, že Nrf-2 může být významně zesílen a aktivován v procesu vaskulárního vývoje (Wei et al., 2013).
Jak bylo popsáno dříve (Jiang a Tu, 2009), TG obsahují spoustu bioaktivních sloučenin, například echinakosid, tubulosid A, akteosid, isoakteosid a 2'-acetylakteosid, a některé z nich vykazují neuroprotektivní funkce po poranění I/R mozku (Penget al. ., 2016). Echinakosid má mnoho farmakologických účinků, jako je antioxidační, anti-senescence, neuroprotekce, protizánět, podpora jizvy, hepatoprotekce, podpora tvorby kostí a protinádorové aktivity (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. a kol., 2018; Ji a kol., 2019; Xu a kol., 2019). Nedávno byl echinakosid identifikován jako silný antioxidant v centrálním nervovém systému (Lu et al., 2016). Echinakosid může omezit obsah MDA a zlepšit aktivity SOD a GSH Px při ischemickém poranění mozku a analýza molekulárního dokování ukázala, že echinakosid se může vázat na Keap{13}}, což vede k jaderné translokaci Nrf{14}} (Li et al. , 2018). Studie Xia ukázala, že akteosid by mohl snížit objem infarktu a obsah vody v mozku, aby se zlepšil neurologický deficit u MCAO/R potkanů prostřednictvím zmírnění oxidačního stresu (Xia et al., 2018). Jiné studie prokázaly, že isoakteosid by mohl zvýšit aktivity buněčných antioxidačních enzymů, SOD a CAT v H2O 2-ošetřovaných V79-4 buňkách (Chae et al., 2005). Na základě výše uvedených zpráv o aktivních sloučeninách obsažených v TG je možné odvodit, že TG mohou chránit před ischemickou mrtvicí prostřednictvím antioxidačních cest.
Li referoval o neuroprotektivních účincích fenylethanoidglykosidů (PhGs) na H2O2-indukovanou apoptózu na buňkách PC12 prostřednictvím dráhy Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Tyto PhG byly významně potlačeny spuštěním jaderné translokace Nrf2 a zvýšením exprese HO-1, NQO1, katalytické podjednotky glutamát-cysteinligázy (GCLC) a podjednotky modifikátoru glutamát-cysteinligázy (GCLM) (Li et al., 2018; Gong et al., 2019). Tato zjištění proto naznačují, že dráha Nrf-2/ARE hraje klíčovou roli v ochranných účincích na neuronální buňky zprostředkovaných PhGs. Podobně jsme v této studii zjistili, že TG mohou snížit hladinu MDA a zvýšit hladiny SOD, CAT a GSH-Px u I/R potkanů. Mezitím TG mohly zvýšit expresi Nrf2 v jádře, snížit odpovídající expresi v cytoplazma a významně snižují expresi Keap{16}}. Dráha Nrf-2/Keap-1 se proto může podílet na neuroprotektivních účincích zprostředkovaných TG. Další ověření této cesty bude v budoucnu prováděno in vitro na buněčné kultuře s modely poškození kyslíkem a glukózou/reoxygenací. Navíc, C. Extrakty z deserticoly byly v naší studii podávány nepřetržitě po dobu 14 dnů. Vzhledem k tomu, že neurogeneze dospělých by ovlivnila interpretaci neuroprotektivních účinků během 14 dnů reperfuze, nelze neurogenezi v našem současném experimentu při zkoumání neuroprotektivního účinku CT vyloučit. To je omezení našeho výzkumu.
Závěrem lze říci, že jsou to TG z C. deserticola, které mohou zlepšit angiogenezi a neurogenezi, stejně jako udržovat integritu BBB u krys s poraněním I/R, ale ne PS a OS. Účinky by mohly být zprostředkovány aktivací cesty Nrf-2/Keap-1.
