Echinakosid obrací remodelaci myokardu a zlepšuje funkci srdce

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstraktní

Remodelace myokardu je důležitým patologickým základem srdečního selhání, mitochondriální oxidační stres je promotorem hypertrofie myokardu, fibrózy a apoptózy. ECH je hlavní aktivní složkou tradiční čínské medicíny Cistanches Herba, mnoho studií ukazuje, že má silnou antioxidační kapacitu v nervových buňkách a nádorech, inhibuje mitochondriální oxidační stres, chrání mitochondriální funkce, ale konkrétní mechanismus není jasný. SIRT1/FOXO3a/MnSOD je důležitá antioxidační osa, studie zjistila, že ECH se kovalentně váže na SIRT1 jako ligand a up-reguluje expresi SIRT1 v mozkových buňkách. Předpokládáme, že ECH může zvrátit remodelaci myokardu a zlepšit srdeční funkci HF prostřednictvím regulace signální osy SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibice mitochondriálního oxidačního stresu v kardiomyocytech. Zde nejprve indukujeme buněčný model oxidativního stresu pomocí ISO s AC-16 buňkami a předem ošetříme ECH, hladinu mitochondriálního ROS, oxidativní poškození mtDNA, MMP, karbonylovaný protein, peroxidaci lipidů, intracelulární ROS a apoptózy, potvrzují účinek ECH v mitochondriálním oxidativním stresu a fungují in vitro. Poté jsme vytvořili model HF potkanů ​​indukovaný pomocí ISO a předem ošetřili ECH. Měří se indexy srdeční funkce, remodelace myokardu, mitochondriálního oxidačního stresu a funkce, exprese signalizační osy SIRT1/FOXO3a/MnSOD, data naznačují, že ECH zlepšuje srdeční funkci, inhibuje hypertrofii myokardu, fibrózu a apoptózu zvyšuje expresi SIRT1/FOXO3a/ Signální osa MnSOD, snižuje mitochondriální oxidační poškození, chrání mitochondriální funkci. Došli jsme k závěru, že ECH obrací remodelaci myokardu a zlepšuje srdeční funkci prostřednictvím up-regulace osy SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibice mitochondriálního oxidačního stresu u HF potkanů.

KLÍČOVÁ SLOVA echinakosid, srdeční selhání, mitochondriální oxidační stres, remodelace myokardu

čerstvé bylinky cistanchenamitochondriální oxidační stres

1|ÚVOD

Srdeční selhání (HF) je konečným výsledkem většiny kardiovaskulárních onemocnění s vysokou prevalencí a špatnou prognózou as přitěžujícím trendem stárnutí populace, hospitalizace a úmrtnost v důsledku chronického srdečního selhání (CHF) po celém světě prudce vzrostly.1 Během posledních 20 let zaznamenala medikamentózní léčba srdečního selhání velký pokrok, ale účinek je velmi omezený, takže jsou naléhavě zapotřebí nové léky. Remodelace myokardu je důležitým patologickým základem srdečního selhání a je charakterizována hypertrofií myokardu, apoptózou, intersticiální fibrózou, myokardiální buňky jsou dezorganizované a vedou ke snížení ejekční frakce (LVEF), zvětšení enddiastolických a systolických rozměrů levé komory (LVIDd a LVID) a snížení frakčního zkrácení levé komory (LVFS).2 Ale základní mechanismy nebyly stále plně pochopeny. V posledních letech četné studie potvrdily, že oxidační stres je důležitým stimulátorem remodelace myokardu.3-7

Oxidační stres je stav, při kterém dochází k nadměrné tvorbě reaktivních forem kyslíku (ROS) nebo volných radikálů, které vedou k oxidativnímu poškození buněčných komponent, což následně způsobuje buněčnou dysfunkci.8 Mitochondrie jsou hlavním zdrojem intracelulárních ROS v důsledku únik z respiračního elektronového transportního řetězce a mitochondrie jsou nejcitlivější pozicí na účinky ROS.9 Studie v HF identifikovaly zvýšenou tvorbu ROS z komplexu I dýchacího řetězce.8 Zvýšená produkce ROS napadá nejprve mitochondriální komponenty a vede k nadměrnému oxidačnímu stresu se projevuje karbonylací proteinů, peroxidací lipidů a poškozením DNA10 a dysfunkcí mitochondrií, které následně vedou k nadměrné tvorbě ROS,8 tvoří začarovaný kruh. Je prokázáno, že trvalý oxidační stres může způsobit hypertrofii myokardu a fibrózu myokardu11-13 a způsobit apoptózu buněk myokardu prostřednictvím aktivace apoptózy závislé na mitochondriích v důsledku karbonylace proteinů mitochondriální membrány a ztráty potenciálu mitochondriální membrány. se má za to, že inhibice mitochondriálního oxidačního stresu může být novou strategií prevence remodelace myokardu a dokonce i HF.15-17

Echinacosid (ECH), přírodní fenylethanoidní glykosid, je hlavní aktivní složkou Cistanches Herba, což je tradiční čínská medicína. V posledních letech byla ECH rozsáhle studována v nervovém systému a nádorech a bylo hlášeno, že má různé farmakologické účinky, jako jsou antioxidační, protizánětlivé, antiapoptózové a protinádorové vlastnosti.18,19In nervových buněk, ECH výrazně zvyšuje antioxidační kapacitu, snižuje produkci ROS, zlepšuje potenciál mitochondriální membrány (MMP) a zvyšuje životaschopnost buněk,20 vykazuje ochranné účinky na mitochondriální funkci a inhibuje mitochondriální oxidační stres, chrání před oxidačním poškozením a zlepšuje paměť, případně zabraňuje neurodegenerace.21,22 ECH také zvyšuje aktivitu SOD a hraje ochrannou roli v mozkové tkáni a tkáni sítnice,19,23 ale konkrétní mechanismus jejího antioxidačního účinku není jasný.

SIRT1 úzce souvisí s oxidačním stresem a signalizační osa SIRT1/FOXO3a/MnSOD je nejdůležitější antioxidační osou a je zodpovědná za potlačení mitochondriálního oxidačního stresu, MnSOD se široce distribuuje v mitochondriích a je primárně zodpovědný za čištění mitochondriálních ROS, tedy inhibující oxidační stres mohou sloučeniny, které aktivují tuto antioxidační osu, inhibovat oxidační stres.24,25 Nedávné studie ukázaly, že ECH uplatňuje své farmakologické účinky prostřednictvím regulace více signálních drah, jako jsou p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads a signální dráha SIRT1.{10}} nová studie zjistila, že ECH se kovalentně váže na SIRT1 jako ligand a upreguluje expresi SIRT1 v mozkových buňkách.26Naznačuje to, že ECH může inhibovat mitochondriální oxidační stres v kardiomyocytech a zvrátit činnost myokardu předělávání. Výzkum účinků ECH se však zaměřil na nervový systém nebo nádor, účinky a mechanismy ECH na mitochondriální oxidační stres v kardiomyocytech a remodelaci myokardu zůstávají neznámé. Zde nejprve indukujeme buněčný model oxidačního stresu pomocí ISO a potvrzujeme účinek ECH na mitochondriální oxidační stres a funkci in vitro. Poté jsme vytvořili model HF potkanů ​​indukovaný ISO a prokázali, že ECH obrací remodelaci myokardu a zlepšuje srdeční funkci prostřednictvím up-regulace signalizační osy SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibice mitochondriálního oxidačního stresu u HF potkanů. Výsledky mají poskytnout experimentální důkazy pro vývoj nových léků k prevenci srdečního selhání.

2|MATERIÁLY A METODY

2,1|Buněčná kultura a léčba

Buňky AC16 jsou zakoupeny od Bena Culture Collection. Buňky jsou udržovány v doplňku Dulbeccova modifikovaného Eagleova média s vysokým obsahem glukózy (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) s 10 procenty fetálního hovězího séra (10 procent FBS; Gibco) v T-75 lahvích (Corning Glassworks, Corning, NY, USA). Podmínky jsou udržovány na 37 stupních ve vlhké atmosféře obsahující 5 procent CO2. Jakmile buňky dosáhnou 70 procent -80 procent konfluence, buňky skupiny ISO (Sigma, USA) se inkubují s médiem obsahujícím 10 uM ISO (Sigma, USA) po dobu 24 hodin, buňky skupiny ECH se předem ošetří 50 uM ECH (MCE , USA) po dobu 30 minut před expozicí ISO. Řídicí buňky (Ctrl) nejsou ošetřeny ničím.

cistanche na prodejvýpis

2,2|Detekce mitochondriální hladiny ROS pomocí luminolové chemiluminiscence

Mitochondrie jsou izolovány a purifikovány z AC-16 buněk pomocí Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) podle pokynů výrobce. Koncentrace proteinu jsou stanoveny soupravou pro stanovení proteinu BCA (Biotech). Mitochondriální hladina ROS je detekována luminálním (3-hydrazidem aminoftalové kyseliny 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazinedionem) pomocí soupravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), reaguje s ROS a způsobuje emisi fotonů, což je pásmové spektrum s vrcholem při asi 460 nm, a relativní světelná jednotka (RLU) je detekována chemiluminiscenčním měřicím přístrojem a převedena na RLU/ug mitochondriální protein.

2,3|8-OHdG se používá k hodnocení oxidačního poškození mitochondriální DNA

Oxidační poškození mitochondriální DNA se hodnotí detekcí obsahu 8-Hydroxy-2-deoxyguanosinu (8-OHG). Vyčištěné mitochondrie v buňkách se izolují pomocí soupravy pro izolaci mitochondrií, jak je uvedeno výše (Sigma). Koncentrace proteinu jsou stanoveny soupravou pro stanovení proteinu BCA (Biotech). Poté se disociují za účelem stanovení hladiny 8-OHdG pomocí soupravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) podle pokynů výrobce. Absorbance změny barvy se měří na spektrofotometru při vlnové délce 450 nm. Koncentrace 8-OHdG ve vzorcích se pak určí porovnáním OD vzorků se standardní křivkou a převede se na ng/ml.

2,4|Měření MMP společností JC-1

Mitochondrie jsou izolovány a purifikovány od AC-16 a koncentrace proteinu je určena výše uvedeným způsobem. Poté jsou mitochondrie resuspendovány na koncentraci 1 mg/ml, MMP se měří pomocí JC-1 testovací soupravy podle pokynů výrobce. Intenzita fluorescence se měří při excitační vlnové délce: 490nm, štěrbina 5nm, emisní vlnová délka: 590 nm, štěrbina 5nm pomocí spektrofotometru30, výsledky jsou uvedeny jako FLU/ugP.

2,5|Detekce apoptotických buněk průtokovou cytometrií v AC-16 buňkách

Průtoková cytometrie se používá k hodnocení buněčné apoptózy. K detekci apoptotických a nekrotických buněk se používá souprava pro detekci apoptózy Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Čína) podle pokynů dodavatele. Raná fáze apoptózy, pozdní fáze apoptózy nebo nekrózy, buněčné zbytky a životaschopné buňky jsou identifikovány jako annexin V ( plus )/PI (-), annexin V ( plus )/PI ( plus ), annexin V (-)/PI ( plus ) a annexin V (-)/PI (-). Intenzity fluorescence se analyzují pomocí průtokového cytometru (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Každý experiment se opakuje 3x.

2,6|Stanoveno intracelulární ROS průtokovým cytometrem

Po ošetření se buňky trypsinizují, dvakrát promyjí PBS. Buňky jsou poté resuspendovány v PBS, obarveny DCFH-DA (Beyotime, Čína) na konečnou koncentraci 1 μM a inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 stupních v inkubátoru s CO2 a poté testovány v průtokovém cytometru při excitaci 488 nm . Intenzita fluorescence představuje hladinu intracelulárního ROS.

2,7|Testujte obsah karbonylového proteinu v mitochondriích AC-16 buněk

Po ošetření se vyčištěné mitochondrie izolují a sonikují na ledu a zpracují se s 1 procentem streptomycin sulfátu, aby se vysrážely mitochondriální nukleové kyseliny, stanovila se koncentrace proteinu. Obsah karbonylového proteinu je testován pomocí soupravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) založené na derivatizaci karbonylové skupiny dinitrofenylhydrazinem (DNPH), dle návodu soupravy je OD měřena čtečkou mikrodestiček a převedena na nmol/ mg proteinu porovnáním se standardní křivkou.

2,8|Stanovení hladiny peroxidace lipidů v mitochondriích AC-16 buněk

Po ošetření jsou buňky shromážděny a lyžovány, mitochondrie jsou izolovány a purifikovány a rozštěpeny ultrazvukem, koncentrace proteinu je určena soupravou pro stanovení proteinů BCA (Biotech), peroxidace lipidů je stanovena hladinou malondialdehydu (MDA) pomocí testu TBARS pomocí soupravy (Nan jing Jian cheng, Čína) a hladina MDA se měří podle protokolu výrobce. OD se detekuje při 586 nm čtečkou mikrodestiček a převede se na μmol/g proteinu porovnáním se standardní křivkou.

2,9|Zvířata a léčba

Mladí samci krys Sprague-Dawley o hmotnosti 120-140g byli získáni z Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Center (Shaanxi, Čína). Vyšetřování je v souladu s Příručkou pro péči a použití laboratorních zvířat, kterou vydal americký Národní institut zdraví (publikace NIH č.{2}}, revidovaná v roce 1996) a experimentální protokoly byly schváleny místními úřady ( Biomedicínský etický výbor lékařského oddělení univerzity Xi 'a Jiao tong). Krysí model HF je založen tak, jak jsme již dříve popsali.31 Stručně, Isoproterenol (10 mg/kg) se podává jednou denně intraperitoneální injekcí po dobu 2 týdnů (definováno jako skupina HF), ECH se podává s 20 ug/g jednou denně intraperitoneální injekcí 30 minut před ošetřením ISO (definováno jako skupina ECH) a podávání trvá 2 týdny. Kontrolním zvířatům byl podáván 0,9% NaCl (definovaný jako Ctrl skupina). Pro hodnocení srdeční funkce se provádí echokardiografická měření.

2.10|Echokardiografická měření

Zvířata se anestetizují intraperitoneální injekcí 300 mg/kg chloralhydrátu. K provádění echokardiografických vyšetření se používá ultrazvukový systém SONOS-2500 s ultrazvukovým měničem 7,5 MHz (HP, USA). Ejekční frakce levé komory (LVEF), frakční zkrácení levé komory (LVFS), rozměry na konci diastoly levé komory (LVIDd), rozměry na konci systoly levé komory (LVID), srdeční frekvence (HR), tloušťka mezikomorového septa v diastole (IVSTd ), tloušťka zadní stěny levé komory v diastole (LVPWTd) se měří tak, jak bylo popsáno dříve.32

OBRÁZEK ​​1 50μmol ECH účinně inhibuje mitochondriální oxidační stres AC-16 buněk vyvolaný 10μmol/L ISO a chrání mitochondriální funkci a snižuje apoptózu.

2.11|Měří se poměr hmotnosti srdce k tělesné hmotnosti (HW/BW).

Potkani se před anestetizací zváží, izoluje se čerstvé srdce a vymyje se krev pomocí 0,1 mol/l PBS, odříznou se cévy a další nadbytečná tkáň a srdce se zváží, poté se HW/BW(mg/100g) vypočítané.

2.12|Histologické barvení

Srdce krys se vypreparuje a fixuje ve 4% paraformaldehydu, zalije se do parafínu a nařeže na plátky o tloušťce 5 μm. K pozorování patologických změn se používá barvení hematoxylin-eosin (HE) a k hodnocení kolagenových vláken tkáně myokardu potkanů ​​se používá Massonův trichrom. Objemová frakce srdečního kolagenu (CVF) a plocha průřezu kardiomyocytů se měří pomocí Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2,13|Barvení TUNEL

Odebere se tkáň myokardu z levé komory a provede se test TUNEL, jak bylo dříve popsáno32

2,14|Transmisní elektronový mikroskop

Čerstvá srdeční tkáň je fixována v 2,5% glutaraldehydu při 4 stupních, tkáň je poté nařezána na objem 1 mm3 a znovu fixována ve 2,5% glutaraldehydu při 4 stupních po dobu 2 hodin, poté je promyta 0,1 mol/l PBS, fixována v 1% kyselině osminové, dehydratované acetonem, zalité epoxidovou pryskyřicí, se vyrobí ultratenké plátky tenké asi 800nm, obarví se uranylacetátem a citrátem olovnatým a poté se pozorují pod transmisním elektronovým mikroskopem (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japonsko). Pro kvantifikaci ochranného účinku ECH v mitochondriální morfologii se pomocí Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA) statisticky analyzuje průměrný mitochondriální obvod, průměrná plocha průřezu mitochondrií, procento degenerace a procento vakuolizace v mitochondriích.

2,15|Kvantitativní PCR

Celková RNA se připraví z tkáně levé komory pomocí činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA je syntetizována pomocí TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonsko). Specifické sekvence primerů kolagenu I použité pro PCR v reálném čase jsou následující: dopředný: 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, reverzní: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH vpřed 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', reverzní 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) se provádí pomocí SYBRPremix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara, Japonsko). Relativní hladina mRNA se vypočítá normalizací na GAPDH podle metody 2-ΔΔCT.

2,16|Western blot analýza exprese proteinu SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Celkový protein tkáně levé komory se extrahuje na ledu za použití studeného pufru RIPA (BioRad, USA) s koktejlem inhibitoru proteázy (Sigma-Aldrich). Koncentrace je stanovena metodou BCA. Postupy Western blotu jsou popsány dříve.33 Stručně řečeno, vzorek proteinu je frakcionován na 15% dodecylsulfát-polyakrylamidových gelech, přenesen na PVDF membrány (BioRad, USA), blokován 5% odstředěným mlékem a inkubován s myší protilátkou MYH. (ředěno 1:200, Santa Cruz, USA). Poté inkubováno s kozí myší protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (zředěnou 1:2,000, Santa Cruz, USA). Relativní hladina proteinu se vypočítá normalizací střední hodnoty paprsku na -aktin. Proteinové pásy jsou detekovány chemiluminiscenčním systémem (ChemiDoc XRS, BioRad).

2,17|Měření mitochondriálního oxidačního stresu v myokardu potkana

Purifikované mitochondrie krysího myokardu jsou izolovány pomocí Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) podle pokynů výrobce, mitochondriální ROS, MMP, oxidační poškození mtDNA, obsah karbonylovaných proteinů a hladina peroxidace lipidů v mitochondriích jsou detekovány stejnými metodami jako výše popsané buněčné experimenty. Za zmínku stojí, že ROS v tkáni myokardu je detekován fluorescenčními sondami DCFH-DA, intenzita fluorescence je detekována měřicím přístrojem pro enzymatické značení, výsledky jsou reprezentovány jako RLU/ug mitochondriálního proteinu.

2,18|Statistická analýza

Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Jednocestná ANOVA se používá k porovnání rozdílů mezi více skupinami, po které následuje Tukeyho post hoc test na významnost. Všechny statistiky jsou stanoveny pomocí softwaru SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA). Hodnota pravděpodobnosti P < 0,05="" je="" považována="" za="">

3|VÝSLEDEK

3,1|50 μM ECH účinně inhibuje mitochondriální oxidační poškození a apoptózu v AC-16 buňkách

Neošetřené buňky jsou nastaveny jako skupina Ctrl. Za prvé, jak ukazuje obrázek 1A, ECH inhibuje mitochondriální ROS indukované ISO. Buňky ošetřené ISO vykazují významný nárůst mitochondriálních ROS ve srovnání s Ctrl a tento nárůst je významně zmírněn předúpravou 50 μM ECH. Za druhé, ECH může inhibovat oxidační poškození mtDNA indukované ISO. 8-OHdG je považován za jednu z nejhojnějších lézí DNA vyplývajících z oxidačního stresu a je biomarkerem oxidativního poškození a opravy DNA. Jak ukazuje obrázek 1B, je detekován obsah 8-OHdG v purifikovaných mitochondriích z AC-16 buněk, výsledky ukazují, že hladina 8-OHdG v mitochondriích z buněk ošetřených ISO se dramaticky zvýšila, ale změna byla obrácena 50 μM ECH. Za třetí, ECH účinně chrání MMP, který je narušen ISO. Intenzita fluorescence je významně snížena u buněk ošetřených ISO ve srovnání s buňkami Ctrl, zatímco předběžné ošetření 50 μM ECH výrazně zmírňuje snížení MMP, jak ukazuje obrázek 1C. Za čtvrté, ECH chrání před oxidačním poškozením mitochondriálního proteinu v AC-16 buňkách. Jak ukazuje obrázek 1D, obsah karbonylového proteinu v mitochondriích buněk ošetření ISO je významně zvýšený a ECH zeslabuje účinek. Za páté, ECH také inhibuje mitochondriální lipidovou peroxidaci v AC-16 buňkách indukovanou ISO. Jak ukazuje obrázek 1E, hladina lipidových peroxidů v mitochondriích ISO buněk je zjevně vyšší než v Ctrl buňkách, přičemž toto zvýšení je významně sníženo předúpravou 50μM ECH. Nakonec ECH inhibuje akumulaci intracelulárního ROS. Jak ukazuje obrázek 1F, hladina intracelulárního ROS v ISO buňkách je výrazně zvýšená a výrazně snížena v buňkách předem ošetřených ECH. Obrázek 1G ukazuje, že rychlost apoptózy AC-16 buněk je významně zvýšena po 24hodinové inkubaci s 10 uM ISO, ve srovnání s buňkami Ctrl, zatímco buňky před ošetřením s 50 uM ECH významně snižují apoptózu indukovanou ISO.

OBRÁZEK ​​2 Srdeční hypertrofie potkanů ​​se srdečním selháním vyvolaná pomocí ISO je zmírněna a srdeční funkce je významně zlepšena léčbou ECH.

3,2|ECH obrací remodelaci myokardu a zlepšuje srdeční funkci ISO-indukovaných HF potkanů

Jak je znázorněno na obrázku 2A, srdce u HF krys jsou zjevná hypertrofie a jsou revertována léčbou ECH. Jak ukazují obrázky 2B-D a L, ECH snižuje HW/BW. Výsledky echokardiografie ukazují, že LVEF a LVFS jsou významně sníženy ve skupině se srdečním selháním, LVIDd, LVID a IVSTd jsou významně zvýšeny ve skupině se srdečním selháním. ECH však významně snižuje LVIDd, LVID, IVSTd a zlepšuje LVEF a LVFS, mezi těmito třemi skupinami není žádný významný rozdíl v HR, LVPWTd je zvýšen u HF, ale žádný rozdíl mezi ECH a Ctrl nebo mezi ECH a HF, vše jako Obrázek 2E-K ukazuje. Výsledky barvení HE ukazují, že hypertrofie myokardu, uspořádaná porucha nebo nekróza degenerace, zánětlivá buněčná infiltrace a intersticiální hyperémie a edém u potkanů ​​HF a ECH významně zmírňuje tato poškození, hypertrofie myokardu a uspořádaná porucha jsou zmírněny. degenerační nekróza a zánětlivý infiltrát jsou redukovány, jak je znázorněno na obrázku 3A. Měří se plocha průřezu kardiomyocytu, která se po ISO významně zvětší a ve skupině léčené ECH se sníží, jak ukazuje obrázek 3E. Hodnocení ukládání kolagenu pomocí Massonova barvení odhalilo, že obsah kolagenu v levé komoře u potkanů ​​se HF je zjevně zvýšený a zjevně snížen po léčbě ECH, což zjevně snižuje CVF. Analýza PCR v reálném čase ukazuje, že transkripty prokolagenu typu Ⅰ jsou up-regulovány u ISO potkanů ​​a down-regulovány u ECH potkanů, tyto výsledky jsou vzájemně konzistentní, jak ukazují obrázky 3B a FG, data naznačují, že ECH účinně snižuje ukládání kolagenu . Počet TUNEL-pozitivních buněk v kardiomyocytech je významně zvýšený u HF potkanů ​​ve srovnání s Ctrl, ECH výrazně snižuje apoptózu myokardiálních buněk a Obrázek 3C-D ukazuje reprezentativní obraz TUNEL-pozitivních buněk v polích s nízkým a vysokým výkonem, a Obr. 3H ukazuje rychlost apoptózy buněk myokardu. Tyto výsledky naznačují, že ECH účinně ruší hypertrofii myokardu, myokardiální intersticiální fibrózu a apoptózu a zlepšuje srdeční funkci u HF potkanů ​​indukovanou ISO.

OBRÁZEK ​​3 Výsledky histologického barvení demonstrují, že ECH obrací remodelaci levé komory u HF potkanů ​​indukovanou ISO.

3,3|ECH chrání ultrastrukturu myokardu u HF potkanů

Výsledky transmisních elektronových mikrografů ukazují, že poškození ultrastruktury myokardu by mohlo být oslabeno ECH, jak ukazuje obrázek 4A-B. Myofibrily jsou uspořádány vertikálně, struktura sarkomer je zřejmá, myofilamenta jsou uspořádána úhledně a linie Z je zřetelná. Mitochondrie jsou úhledně uspořádány a struktura je u Ctrl potkanů ​​jasná. Myofibrily jsou však dezorganizované, prasklé a rozpuštěné, struktura sarkomer je neostrá, chybí linie Z, je viditelná zóna myokardu, zvětšuje se počet a objem mitochondrií, mitochondrie jsou různého tvaru a velikosti, jsou uspořádány neuspořádaně, struktura je nejasná, bobtnání a fragmentace krist, kolaps nebo shlukování a rozpuštění do vakuoly u HF potkanů. ECH tyto změny zjevně zmírňuje, většina vláken srdečního svalu je úhledně uspořádána a vlákna myokardu jsou čistá, linie Z existuje, i když je patrné určité rozpouštění vláken, struktura sarkomer je jasná, hustota mitochondrií je snížena, tvary a velikosti jsou uvolněné, uspořádanější, otok mitochondrií a fragmentace krist, kolaps nebo shlukování a vakuolizace jsou evidentně sníženy ECH ve srovnání s HF. Otok mitochondrií a fragmentace krist, kolaps nebo shlukování a částečná vakuolizace jsou identifikovány jako mitochondriální degenerace. Výsledky ukazují, že ECH účinně chrání ultrastrukturu myokardu a zvláště chrání mitochondriální morfologii u HF potkanů, jak ukazuje obrázek 4C-F.

OBRÁZEK ​​4 ECH chrání ultrastrukturu kardiomyocytů a mitochondriální morfologii HF potkanů ​​indukovanou ISO.

3,4|ECH up-reguluje proteinovou expresi SIRT1, FOXO3a a MnSOD

Analýza Western Blot ukazuje, že hladina proteinové exprese SIRT1, FOXO3a a MnSOD je významně down-regulována u HF potkanů, nicméně ECH evidentně up-reguluje sníženou proteinovou expresi. Reprezentativní proteinové pásy výsledků imunoblotu a statistické analýzy jsou ukázány na obrázku 5. Část dat ukazuje, že ECH zvyšuje proteinovou expresi SIRT1, FOXO3a a MnSOD.

3,5|ECH inhibuje mitochondriální oxidační stres v tkáni myokardu levé komory

V této části jsou měřeny mitochondriální ROS, MMP, oxidační poškození mitochondriální DNA, obsah karbonylového proteinu a hladina peroxidace lipidů v mitochondriích v tkáni myokardu levé komory potkanů ​​a výsledky jsou v souladu s buněčnými experimenty, tj. ECH snižuje mitochondriální ROS, chrání MMP, zmírňuje stupeň poškození mtDNA, snižuje obsah karbonylového proteinu a peroxidaci lipidů v mitochondriích, jak ukazuje obrázek 6.

OBRÁZEK ​​5 ECH up-reguluje hladinu proteinové exprese SIRT1, FOXO3a a MnSOD, která je down-regulována u HF krys.

4|DISKUSE

Tato studie ukazuje, že ECH má účinné role v prevenci remodelace myokardu a zlepšení srdeční funkce prostřednictvím up-regulace signalizační osy SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibice mitochondriálního oxidačního stresu.

Mitochondrie jsou hlavním místem tvorby ROS jako vedlejšího produktu oxidativní fosforylace, vzhledem k jejich blízkosti k ROS se předpokládá, že mitochondriální proteiny, lipidy a mtDNA jsou primárními cíli oxidačního poškození po nadměrné emisi mitochondriálních ROS,34,35 toto poškození stimuluje další produkci ROS, začarovaný kruh pokračuje, ROS a oxidační stres by mohly vést k hypertrofii myokardu, apoptóze, intersticiální fibróze a HF prostřednictvím aktivace více signálních drah.35 Zdá se tedy, že léky, které cílily na inhibici mitochondriální oxidativní Stres je účinný při prevenci remodelace myokardu. ECH je přírodní fenylethanoidní glykosid, součást tradiční čínské byliny Cistanche tubulosa. je široce studován a v posledních letech bylo prokázáno, že má různé farmakologické aktivity, jako je protinádorový účinek, antiapoptóza, anti-aging, neuroprotektivní účinek a tak dále. Studie prokázaly, že farmakologické působení ECH závisí především na jeho antioxidační a protizánětlivé aktivitě,18,21 a ECH snižuje mitochondriální ROS a chrání mitochondriální funkci před oxidačním poškozením v nervových buňkách.20,22 Zde jsme nejprve prokázali, že ECH snižuje mitochondriální ROS kardiomyocytů, a tím zlepšuje MMP, snižuje oxidační poškození mtDNA, proteinu a lipidů, účinně inhibuje mitochondriální oxidační poškození a snižuje apoptózu in vitro a in vivo, takže obrací remodelaci myokardu a zlepšuje funkci srdce. To znamená, že ECH je potenciálním novým lékem pro prevenci remodelace myokardu a srdečního selhání.

Za normálních podmínek se mitochondriální ROS čistí hlavně MnSOD, který se distribuuje v mitochondriích a chrání před mitochondriálním oxidačním poškozením. Ang II významně snižuje expresi MnSOD v kardiomyocytech a indukuje hypertrofii myokardu, nicméně resveratrol by mohl zvýšit expresi MnSOD a inhibovat hypertrofii myokardu indukovanou Ang II.36 U HF je aktivita MnSOD významně snížena a tvorba mitochondriálních ROS je zvýšena .37,38 U myší s knockoutem genu MnSOD specifického pro srdce nemohlo být mitochondriální ROS odstraněno a ROS je zvýšeno v kardiomyocytech, což vedlo k mitochondriální dysfunkci a progresivnímu zvětšení srdce, což nakonec vedlo k srdečnímu selhání.39 V této studii potvrzujeme že exprese MnSOD je významně snížena, což je zeslabeno léčbou ECH, a tím je snížena mitochondriální ROS a inhibován mitochondriální oxidační stres. Znamená to, že ECH chrání kardiomyocyty před oxidačním poškozením prostřednictvím up-regulace exprese MnSOD, dále zkoumáme molekulární mechanismy, které jsou základem těchto účinků.

Exprese MnSOD je regulována FOXO3a, což je transkripční faktor a váže se v oblasti genového promotoru MnSOD a vede k podpoře genové transkripce.40 SIRT1 je upstream molekula FOXO3a a může aktivovat FOXO3a deacetylací. Signální osa SIRT1/FOXO3a/MnSOD hraje klíčovou roli v ochraně před oxidačním stresem u různých typů buněk, aktivace signální osy estradiolem inhibuje oxidační stres a vykonává srdeční ochranu24; Aktivace signální osy resveratrolem inhibuje buněčnou smrt vyvolanou oxidativním stresem40; Jinak angiotenzin II inhibuje dráhu SIRT1/FoxO3a/MnSOD a indukuje mitochondriální oxidační stres, poškození mtDNA v osteoblastech41, adenylylcykláza typu 5 zvyšuje oxidační stres inhibicí exprese MnSOD prostřednictvím dráhy Sirt1/FoxO3a.42 Tato studie zjistila, že exprese SIRT1, FoxO3a a MnSOD jsou všechny významně sníženy u HF potkanů ​​a mitochondriální ROS je zvýšen a oxidační stres je zesílen, avšak změny jsou zvráceny ECH. Nový výzkum ukazuje, že ECH přímo váže SIRT1 jako ligand a tvoří komplex s 9 kovalentními vazbami a upreguluje expresi SIRT1 v nervových buňkách.26 V souladu s touto studií tato studie ukazuje, že ECH také upreguluje expresi SIRT1 v kardiomyocytech pak up-reguluje genovou expresi MnSOD prostřednictvím FoxO3a a inhibuje mitochondriální ROS a oxidační stres.

Dlouhodobá chronická ischémie může způsobit hibernaci myokardu, tyto hibernující buňky myokardu typicky vykazují ztrátu kontraktilních filament, v cytosolu jsou nadbytečná granula glykogenu, sarkoplazmatické retikulum a příčné tubuly jsou ztraceny,43 také existují abnormality ve velikosti a tvaru mitochondrií. , reaktivní hypertrofie myokardu a intersticiální fibróza, která je sekundární ke ztrátě myocytů.44 Výše ​​uvedené změny jsme také pozorovali u potkanů ​​se srdečním selháním v naší studii, zatímco ECH tyto změny významně zmírňuje, protože nejnovější studie uvádí, že obnovení srdeční funkce po ischemickém stresu může být rysem hibernace myokardu45, je také měřena hladina glykogenu v myokardu, výsledky naznačují, že mezi těmito třemi skupinami není žádný významný rozdíl, jak ukazuje obrázek 7J.

Předchozí studie také detekovala hibernaci myokardu na prasečím modelu s neischemickým srdečním selháním pomocí vysokofrekvenční stimulace volné stěny LK,46 protože mikrovaskulární obstrukce hraje důležitou roli v hibernaci myokardu a výsledné kontraktilní dysfunkci, která se výrazně zlepší, když mikrovaskulární obstrukce je zvrácena lékem.47 V současné době některé studie docházejí k závěru, že revaskularizační terapie je účinná u hibernujícího myokardu,43 pomocí HE a Massonova barvení pozorujeme, že myokardiální kapilární a arteriolární denzita je u potkanů ​​se srdečním selháním zjevně snížena a významně se ulevilo pomocí ECH, jak je znázorněno na obrázku 7A-H. Předchozí studie ukázaly, že jiné přírodní sloučeniny, jako je beta-glukan ječmene, vykazují kardioprotektivní účinky zvýšením exprese MnSOD48,49 a zvýšení MnSOD souvisí se zvýšenou hustotou myokardiálních kapilár a expresí VEGF. Provedli jsme RT-PCR k detekci exprese VEGF, data jsou v souladu s nálezem histologického barvení, což znamená, že ECH může podporovat angiogenezi a zvyšovat hustotu myokardiálních kapilár prostřednictvím regulace exprese VEGF, jak je znázorněno na obrázku 7I. Tato studie zjistila, že ECH může chránit a zvyšovat kapilární a arteriolární myokard prostřednictvím up-regulace dráhy SIRTI/FOXO3a/MnSOD a exprese VEGF, čímž potlačuje hibernující myokard a přispívá ke zlepšení funkce srdce.

Cistanche přispívánazlepšení funkce srdce.

Pro více informací klikněte sem.

Je třeba poznamenat, že apoptóza kardiomyocytů je dobře známá jako důležitá patologická změna při srdečním selhání a tato studie skutečně potvrzuje, že velké množství apoptotických buněk u HF potkanů ​​a ECH významně snižuje apoptózu prostřednictvím regulace dráhy SIRTI/FOXO3a/MnSOD a inhibice mitochondriální oxidační stres, jak je uvedeno výše.

ECH především obrací remodelaci myokardu a zlepšuje srdeční funkci prostřednictvím up-regulace signalizační osy SIRT1/FoxO3a/MnSOD, čímž inhibuje mitochondriální oxidační stres a snižuje hibernující myokard. Proto se předpokládá, že ECH je potenciálním lékem pro prevenci nebo léčbu remodelace myokardu a srdečního selhání.