Celkové glykosidy a polysacharidy Cistanche Deserticola zabraňují osteoporóze

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang 1, Pengfei Tu, Kewu Zeng *, Yong Jiang **

ABSTRAKTNÍ

Etnofarmakologický význam:Tradiční čínská medicína Cistanche deserticola YC Ma působí na „tonifikaci ledvin a posílení kostí“. Konkrétní aktivní extrakty C. deserticola a mechanismy léčby osteoporotiky však nejsou jasné.

Cíl studie:Chtěli jsme identifikovat účinné složky extraktů C. deserticola pro léčbu osteoporózy a potenciální mechanismy.

Materiály a metody:Naše skupina zkoumala extrakty C. deserticola s antiosteoporotickou aktivitou, včetně celkových glykosidů (TG), polysacharidů (PS) a oligosacharidů (OS) u myší náchylných k senescenci 6 (SAMP6). Goldnerův trichrom, Van Giesonův (VG), Safranin O-Fast Green a von Kossa barvení byly provedeny pro zkoumání tvorby kostní struktury a ukládání vápníku. Sérum bylo odebráno pro detekci biochemických markerů. Mikroarchitektura kosti byla detekována mikro-CT. Exprese kostního morfogenetického proteinu-2 (BMP-2), osteokalcinu (OCN), osteoprotegerinu (OPG), receptorového aktivátoru nukleárního faktoru-κ B ligandu (RANKL), p-glykogensyntetázové kinázy{{11 }} (p-GSK-3) a p- -catenin byly analyzovány westernovým přenosem a imunohistochemií.

Výsledek:TGs a PSs zlepšily kostní histopatologická poškození, podpořily tvorbu nové kosti, kolagenních vláken a chondrocytů a urychlily ukládání vápníku. Navíc pozoruhodně změnily biomarkery kostního obratu a účinně zlepšily kostní mikroarchitekturu. Další studie mechanismů ukázala, že TG a PS významně snížily expresi RANKL, p- -kateninu, a také zvýšily expresi BMP-2, OCN, OPG a p-GSK{{ 4}} (Ser9).

Závěr:Zjištění této studie naznačují, že TG a PS mohou podporovat tvorbu osteoklastogenní kosti a zlepšovat poškození kostní mikrostruktury u myší SAMP6 a jejich terapeutický účinek na osteoporózu je prostřednictvím aktivace signální dráhy Wnt/-catenin.

Cistanche umípodporovat osteoklastogenní kostformovat a zlepšovatpoškození kostní mikrostruktury.

1. Úvod

Osteoporóza je časté onemocnění starších jedinců, které vážně ohrožuje zdraví lidstva (Ye et al., 2020). Pacienti s osteoporózou mohou být před zlomeninou zcela asymptomatičtí, proto je prvořadá účinná prevence a léčba osteoporózy (Tella a Gallagher, 2014).

Výzkumy ukazují, že zvýšení kostní resorpce a snížení tvorby kosti vede k nerovnováze v kostní remodelaci, což vede k osteoporóze (Sims a Gooi, 2008). Osteoblasty a osteoklasty jsou dva typy buněk, které jsou rozhodující pro tvorbu a resorpci kosti. Dráha wnt/-catenin je nezbytná pro růst, vývoj a udržování kostní tkáně (Cadigan a Nusse, 1997) a také hraje klíčovou roli v regulaci diferenciace stromálních buněk kostní dřeně psa bígla (BMSC) (Jing et al. , 2018). GSK-3 zabraňuje degradaci -cateninu. -Catenin následně vstupuje do jádra a poté se může asociovat s vazebným faktorem T-buněčného faktoru/lymfoidního zesilovače a reguluje expresi cílových genů Wnt. Mezitím bylo zjištěno, že Wnt/-catenin signalizace snižuje diferenciaci osteoklastů stimulací produkce a sekrece OPG (Glass et al., 2005), který je přirozeným antagonistou RANKL (Lacey et al., 1998). OPG hraje důležitou regulační roli při tvorbě kosti a kostní resorpci. V každém případě delece -cateninu v osteoklastech zvyšuje počet osteoklastů a kostní resorpci a snižuje kostní hmotu (Wei et al., 2011). Při léčbě osteoporózy se používají především inhibitory kostní resorpce a stimulátory tvorby kosti. Vzhledem k tomu, že nežádoucí účinky v současnosti používaných léků s přesnou účinností jsou také zřejmé, je naléhavé hledat léky s méně vedlejšími účinky.

Cistanche deserticola YC Ma (C. deserticola) je jednou ze zdrojových rostlin široce používané tonické tradiční čínské léčivé byliny Cistanches Herba, čínsky Roucongrong, pro léčbu několika nemocí, jako je nedostatek ledvin, ženská neplodnost a stařecká zácpa. více než 1000 let v Číně (National Pharmacopoeia Committee, 2020). Podle teorií tradiční čínské medicíny (TCM), "kost dominující ledviny" a "tonifikace kosti posilující ledviny", se C. deserticola používala k léčbě osteoporózy. Studie ukázaly, že C. deserticola může zlepšit hladinu alkalické fosfatázy (ALP), osteokalcinu a vápníkových iontů v séru a podpořit expresi BMP-2 v osteoblastech potkanů ​​(Gang et al., 2018). Kromě toho studie ukázaly, že C. deserticola projevovala ochranné účinky proti osteoklastogenezi indukované RANKL (Zhang et al., 2019). Přestože C. deserticola působí léčebně na osteoporózu, její specifické aktivní složky nejsou příliš jasné. Je velmi důležité prozkoumat typy účinných složek C. deserticola pro léčbu osteoporózy a souvisejících mechanismů.

Proto jsme provedli tuto studii, abychom zjistili, zda existují nějaké příznivé účinky extraktů obsahujících různé typy chemických složek z C. deserticola na myši SAMP6. Výsledky nálezu mohou poskytnout přesné vodítko pro klinickou aplikaci C. deserticola a také odhalit materiálový základ C. deserticola pro léčbu osteoporózy.

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie a činidla

Cistanche deserticola YC Ma byla zakoupena od Mandela Biotechnology Co., Ltd (Alashan, Vnitřní Mongolsko, Čína) a poté je jedna osoba z autorů identifikovala (PF Tu). TG, PS a OS byly připraveny výše zmíněným způsobem (Gao et al., 2015). Analýza složek každého extraktu byla provedena pomocí HPLC podle zprávy. (Li a kol., 2019; Wang a kol., 2020). Sady H&E, Goldnerovo trichromové barvení, Van Giesonovo (VG) barvení a Safranin O-Fast Green byly zakoupeny od Boster (Hubei, Čína). Králičí anti-myší BMP-2 (ab14933), OCN (ab93876), OPG (ab183910) a RANKL (ab216484) byly zakoupeny od Abcam (Cambridge, Británie). Technologie buněčné signalizace byla zdrojem králičího anti-myšího p-GSK-3 (Ser9) (#5558), GSK3 (#12456), -cateninu (#13727) a p- -kateninu (# 4176). Sekundární protilátky byly zakoupeny od Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Čína).

Vysoce kvalitní extrakt z cistanchezChengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd

2.2. Zvířata

5-měsíční samice myší s urychleným stárnutím/rezistentní myši 1 (SAMR1) a SAMP6 byly získány od společnosti Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Čína). Všechny manipulace se zvířaty byly prováděny v souladu se směrnicemi vydanými Institutional Animal Care and Use Committee of Peking University Health Science Center.

2.3. Podávání léků

Myši byly náhodně rozděleny do následujících pěti skupin: skupina SAMR1 (normální fyziologický roztok, n=10); skupina SAMP6 (normální fyziologický roztok, n =10); skupina TGs (400 mg/kg, n=10); Skupina PSs (400 mg/kg, n=10) a skupina OS (400 mg/kg, n=10) (Gao et al., 2015). Všechny léky byly podávány ig a denně po dobu 12 týdnů.

2.4. Goldnerovo trichromové barvení, H&E barvení, SafraninO-Fast Green a Van Giesonovo (VG) barvení

Po 12 týdnech byly stehenní kosti rychle odstraněny a fixovány pomocí 10% kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) po dobu 7 dnů při 4 °C. Dále byly stehenní kosti rozřezány na řez (5 μm) a obarveny barvením Goldner Trichrome, Van Gieson (VG), SafraninO-Fast Green a H&E podle pokynů výrobce. Snímky byly pozorovány světelným mikroskopem (Leica, Solms, Německo).

2.5. Měření úrovní BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr a Pyr

Koncentrace kostního gla proteinu (BGP), kostně specifické alkalické fosfatázy (BALP), prokolagenu typu 1 N-terminálního propeptidu (P1NP), prokolagenu typu I C-terminálního propeptidu (PICP), alkalické fosfatázy (ALP), S–C -telopeptid kolagenu typu I (S-CTX), kyselá fosfatáza rezistentní vůči tatrátům (TRACP), U–C-telopeptid kolagenu typu I (U-CTX), U–N-telopeptid typu I- kolagen (U-NTX), D-pyridinolin (D-Pyr) a pyridinolin (Pyr) byly stanoveny enzymatickým imunosorbentním testem (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Jiangsu, Čína).

2.6. Barvení von Kossa

Plátky femuru byly ponořeny do 1% dusičnanu stříbrného na 30 min pod intenzivním slunečním paprskem a poté byly třikrát omyty deionizovanou vodou. Následně se na 5 minut přidal 5% thiosíran sodný, aby se odstranilo nezreagované stříbro. Soli fosforečnanu vápenatého byly vizualizovány jako černé zbarvení. Pro kvantitativní analýzu obsahu vápníku ve femuru byl použit software Image-Pro Plus verze 6.0 a Adobe Photoshop.

2.7. Analýza mikropočítačovou tomografií

Všechny vzorky stehenní kosti byly skenovány s rozlišením 9 μm mikro-CT skenerem (PerkinElmer, MA, USA). Další analýza byla provedena pomocí softwaru Analyze12.0 pro výpočet kostní minerální denzity (BMD), kostního objemu/celkového objemu (BV/TV), trabekulárního čísla (Tb. N), trabekulární separace (Tb. Sp), tloušťka trámčiny (Tb. Th) a minerální hustota tkáně (TMD). Trojrozměrné obrazy byly rekonstruovány pomocí softwaru CTVox (PerkinElmer, MA, USA).

2.8. Akumulace tetracyklinu a kalceinu

Každému zvířeti bylo intraperitoneálně podáno 25 mg/kg tetracyklinu a 5 mg/kg kalceinu 13. den a 3. den před eutanazií, v daném pořadí. Akumulace tetracyklinu a kalceinu byla zkoumána pomocí Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, MA, USA). Vzdálenost mezi tetracyklinem a kalceinem lze sledovat pomocí softwaru Image-Pro Plus verze 6.0.

2.9. Western blotting analýza

Tkáně femuru byly homogenizovány a lyžovány v RIPA lyzačním pufru. Koncentrace proteinu byla stanovena za použití reagenční soupravy pro proteinový test s kyselinou bicinchonovou (BCA) (Beijing TransGen Biotech, Beijing, Čína). Celkové proteiny byly naneseny na 10% nebo 12% SDS-PAGE gely a poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla blokována a poté inkubována přes noc s primárními protilátkami a GAPDH (Los Angeles, USA) při 4 °C s následnou inkubací se sekundární protilátkou. Pásy analýzy proteinů byly analyzovány pomocí Tanon 5200 Multi (Shanghai, Čína).

2.10. Imunohistochemická analýza

Řezy tkání femuru byly inkubovány s primárními protilátkami při 4 °C. Polyklonální protilátky proti BMP-2, OCN, OPG a RANKL byly naředěny na 1:200 a 1:100, v daném pořadí. Sekundární protilátka myší anti-králičí IgG (1:200) při 37 ◦C po dobu 1 hodiny. Použití automatizovaného systému kvantitativního zobrazování patologie Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, MA, USA). Pro kvantitativní analýzu exprese proteinu byl použit software Image-Pro Plus verze 6.0 a Adobe Photoshop.

2.11. Statistická analýza

Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Při porovnávání různých skupin byla provedena jednocestná ANOVA. Pro statistickou analýzu byl použit software SPSS verze 22.0 a P < 0.05="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="">

cistanche reddit

3. Výsledky

3.1. TG a PS zlepšují histopatologická poškození kostí a podporují tvorbu kolagenních vláken a chondrocytů u myší SAMP6

Patologické poškození femuru lze pozorovat barvením H&E. Histomorfologické struktury kosti ve skupině SAMR1 jsou uspořádány pravidelně. Struktury kostí uvedené výše však byly poškozeny ve skupině SAMP6. Morfologické změny ve skupinách TG a PS byly menší než ve skupině SAMP6. Avšak skupina léčená OS nevykázala žádné významné zlepšení morfologických změn (obr. 1A). K odhalení tvorby kostní struktury bylo provedeno barvení Goldnerovým trichromem, Van Giesonovým (VG) a barvením Safranin O Fast Green. Výsledky ukázaly, že nová kost, kolagenní vlákno a chondrocyty ve skupinách TG a PS byly ve srovnání se skupinou SAMP6 zlepšeny. Avšak skupina léčená OS nevykázala žádné významné zlepšení změn kostní struktury (obr. 1B–D).

Obr. 1. TG a PS zlepšují histopatologické poškození u myší SAMP6.

3.2. TG a PS mění biomarkery kostního obratu u myší SAMP6

Když dojde k osteoporóze, hladiny biomarkerů tvorby kostí, jako je sérový BGP a PICP, budou významně sníženy. Naproti tomu hladiny biomarkerů souvisejících s kostní resorpcí byly pozoruhodně zvýšeny, včetně sérových TRACP a S-CTX (obr. 2). Povzbudivé je, že skupiny TG a PS mohly zvrátit úrovně BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr a Pyr, ale OS to nedokázaly.

Obr. 2. Účinky TG a PS na biomarkery kostního obratu u myší SAMP6.

3.3. TG a PS podporují tvorbu nové kosti a ukládání vápníku u myší SAMP6

Aby se otestovalo, zda může být tvorba kosti a ukládání fosfátových minerálů podporováno léčbou TG, PS a OS, bylo provedeno značení tetracyklinem kalceinem a barvení Von Kossa. Výsledky ukázaly, že tvorba nové kosti u myší SAMP6 byla významně nižší než u myší SAMR1, zatímco TG a PS významně podporovaly tvorbu nové kosti (obr. 3A). Barvení Von Kossy odhalilo, že ve skupinách léčených TG a PS se ukládalo velké množství vápníku (obr. 3B).

Obr. 3. TG a PS podporují tvorbu nové kosti a ukládání minerálů u myší SAMP6.

3.4. TG a PS zlepšují kostní mikroarchitekturu u myší SAMP6

Mikroarchitektura kosti byla detekována pomocí micro-CT. Ve srovnání s myšmi SAMR1 měly myši SAMP6 více zhoršenou mikroarchitekturu, zatímco stav kostí u myší léčených TG a PS po 12 týdnů se zlepšil (obr. 4). Také jsme zjistili, že indexy BMD, BV/TV, Tb.N a Tb. Th byly sníženy a indexy Tb. Sp a TMD byly zvýšeny u myší SAMP6 ve srovnání s myší SAMR1. TG a PS významně zvýšily BMD, BV/TV, Tb. N, Tb. Th a snížené Tb. Sp a TMD ve srovnání s myšmi SAMP6. Ve skupině OS však nebyly pozorovány žádné významné změny.

3.5. TG a PS mění výrazy BMP-2, OCN, OPG a RANKL u myší SAMP6

Zkoumali jsme proteinové exprese BMP-2, OCN, OPG a RANKL. TG a PS vyvolaly pozoruhodnou upregulaci BMP-2, OCN a OPG, zatímco exprese RANKL byla snížena (obr. 5). Ve skupině s OSs však nebyl žádný významný rozdíl.

Obr. 4. Účinky TG a PS na kostní minerální hustotu a kostní mikroarchitekturu.

3.6. TG a PS mění výrazy p-GSK-3 (Ser9) a p- -kateninu u myší SAMP6

Pro pochopení mechanismů TG a PS podporujících osteoblastogenezi byly měřeny exprese p-GSK-3 (Ser9) a p- -kateninu v kostních tkáních myší SAMP6 pomocí Western blottingu (obr. 6). Výsledky ukázaly, že léčba TG a PS výrazně zlepšila expresi p-GSK-3 (Ser9) a snížila expresi p- -kateninu ve femuru ve srovnání se skupinou SAMP6. Avšak skupina léčená OS nevykázala žádnou významnou změnu.

4. Diskuze

V současné práci používají myši SAMP6 a SAMR1 k nalezení účinných složek z C. deserticola proti osteoporóze. Pro hodnocení léčebných účinků a možných mechanismů byly použity tři extrakty z C. deserticola. Kromě toho byly také analyzovány exprese RANKL, OPG, OCN a BMP-2 a dalších regulátorů kostní resorpce. Ve srovnání se skupinou SAMP6 mohou TG a PS zlepšit histopatologické poškození kosti a také podporovat tvorbu nové kosti, kolagenových vláken, chondrocytů a ukládání vápníku. Oba mohou mezitím změnit biomarkery kostního obratu a účinně zlepšit mikrostrukturu kosti. Při léčbě OS však nebyly pozorovány žádné ochranné účinky.

Obr. 5. TG a PS podporují expresi BMP-2, OCN a OPG a snižují expresi RANKL.

TCM byly široce používány ke zmírnění příznaků mnoha onemocnění, jako je osteoporóza. zmírňuje různé příznaky onemocnění včetně osteoporózy. Četné antiosteoporotické bioaktivní sloučeniny byly identifikovány z desítek přírodních čínských léčivých bylin, které se obvykle používají k tonizaci ledvin a také k zachování ledvinové esence (Xu et al., 2017; Liu et al., 2018). C. deserticola má relativně vysokou bezpečnost a širokou škálu terapeutických funkcí pro léčbu ledvinové nedostatečnosti. Mnoho výzkumných studií objevilo terapeutické účinky extraktů C. deserticola na osteoporózu (Li et al., 2012; Liang et al., 2013; Song et al., 2018).

Kostotvorné osteoblasty a kost resorbující osteoklasty, které byly z diferenciace multipotenciálních mezenchymálních kmenových buněk (MSC), jsou terminálně diferencované buňky s krátkým životem (Teitelbaum a Ross, 2003). Oba je potřeba průběžně nahrazovat novými pocházejícími z kmenových buněk (Long, 2011). Wnt/-catenin signální dráha, která hraje zásadní roli v diferenciaci kostních tkání, stimuluje produkci osteoblastů podporou orientace a diferenciace multipotenciálních MSC na osteoblasty (Rodda a McMahon, 2006). Kromě toho Wnt zabraňují apoptóze zralých osteoblastů a tím prodlužují jejich životnost jak na -catenin-dependentními, tak nezávislými cestami (Almeida et al., 2005). Signální dráha Wnt/-catenin proto hraje důležitou roli při objasňování patogeneze osteoporózy. V tomto experimentu byly myši SAMP6 použity ke zkoumání účinnosti antiosteoporotika z různých extraktů C. deserticola. TG a PS významně snížily hladiny RANKL a p- -kateninu a zvýšily expresi BMP-2, OCN, OPG a p-GSK-3. V souhrnu byl terapeutický účinek TG a PS na myši SAMP6 hlavně prostřednictvím aktivace signální dráhy Wnt/-catenin.

Protože nadměrná absorpce osteoklastů je důležitou příčinou osteoporózy, mohou být faktory spojené s aktivací a diferenciací osteoklastů považovány za důležité cíle k prevenci ztráty kostní hmoty (Takatsuna et al., 2005). V naší studii byla exprese RANKL výrazně down-regulována a zároveň hladina OPG mohla být up-regulována pomocí TG a PS. Bylo dobře zdokumentováno, že proces tvorby kosti a remodelace diferenciace osteoblastových buněk je charakterizován především zvýšenou expresí BMP-2 a OPN (Canalis, 2009). V této studii jsme zjistili, že TG a PS z C. deserticola zvýšily expresi BMP-2 a OPG a zvýšily mineralizaci kostí. Proto TG a PS zprostředkovávají tvorbu kosti upregulací BMP-2 a OPN a downgulací RANKL.

Markery tvorby kosti odrážejí aktivitu buněk tvořících kost, stejné markery kostní resorpce odrážejí aktivitu osteoklastů. Mikroarchitektura se zhoršuje v důsledku změněných markerů kostního obratu. V naší studii byly markery kostní resorpce (S-CTX, TRACP, U-CTX, D-Pyr, U-NTX, Pyr) významně sníženy ve skupinách TGs a PSs, naopak markery kostní tvorby (BGP, BALP , P1NP, PICP, ALP) se výrazně zvyšují. Lze tedy vidět, že TG a PS z C. deserticola podporují rekonstrukci osteoporotické kosti.

Dráha Wnt/ -catenin stimuluje expresi markerů diferenciace osteoblastů a mineralizaci, zároveň aktivuje expresi hlavního osteogenního faktoru BMP-2 v osteoblastech (Zhang et al., 2013). Navíc -catenin zvyšuje expresi OPG v osteoblastech, což nepřímo potlačuje diferenciaci osteoklastů inhibicí kostní resorpce (Baron a Kneissel, 2013). Naše současná studie ukazuje, že TG a PS významně zvyšují regulaci p-GSK-3 a snižují hladinu p- -kateninu. Tyto výsledky podporují závěr, že funkce TG a PS na antiosteoporotiku je regulována aktivací signální dráhy Wnt/-catenin.

Naše předchozí analýza HPLC ukázala, že pět fenylethanoidních glykosidů včetně echinakosidu, cistanosidu A, akteosidu, isoakteosidu a 2'-acetylakteosidu bylo hlavními složkami v TG (Li et al., 2019; Shi et al., 2019). Struktury výše uvedených pěti fenylethanoidových glykosidů byly všechny bohaté na fenolické hydroxylové skupiny, které jsou zodpovědné za antioxidační vlastnosti C. deserticola (Chen et al., 2016). Bylo publikováno, že zlepšení antioxidačního systému může zabránit ztrátě kostní hmoty, takže tyto fenylethanoidové glykosidy by mohly být potenciálními aktivními složkami C. deserticola odpovědnými za antiosteoporotický účinek. Existují zprávy, že echinakosid a akteosid mohou zlepšit typické patologické rysy osteoporózy, jako je zlepšení kvality kostí a celkové BMD femuru, podpora tvorby kosti a inhibice kostní resorpce (Chen et al., 2020). Kromě toho má echinakosid výrazný antiosteoporotický účinek (Li et al., 2013). Předchozí studie ukázaly, že cistanosid A by mohl podporovat tvorbu kosti a bránit kostní resorpci prostřednictvím inhibice NF-KB a aktivace drah PI3K/Akt (Xu et al., 2017). Antiosteoporotický účinek polysacharidů C. deserticola nebyl popsán. Jiné studie však ukázaly, že polysacharidy astragalus by mohly potlačit expresi RANKL, zvýšit hladinu OPG v séru a nakonec blokovat diferenciaci osteoklastů (Huo a Sun, 2016; Hwang et al., 2018). OS C. deserticola se skládá hlavně z mannitolu, betainu, fruktózy, glukózy a sacharózy (Shi et al., 2019), které nemají žádnou zprávu o antiosteoporotické aktivitě, a proto OS nemají žádný terapeutický účinek na osteoporózu. Stručně řečeno, TG a PS jsou aktivními složkami v C. deserticola pro účinek proti osteoporóze.

Cistanche herba doplňky prášekmáúčinek proti osteoporóze.

Pro více informací klikněte sem.

5. Závěry

Závěrem lze říci, že TG a PS z C. deserticola mohou zvýšit tvorbu kostí u myší SAMP6 prostřednictvím regulace signální dráhy Wnt/-catenin, ale nikoli OS. V budoucnu se TG a PS mohou stát slibnými kostně protektivními terapeutickými činidly pro osteoporózu.