Terapeutický účinek fenylethanoidových glykosidů na dyszoospermii vyvolanou cyklofosfamidem u myší a její mechanismus

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAO Dong-hail, ZHANG Lei?, ZHANG Yan², QI Ling', ZOU Xiang-ming'

Abstrakt: Cíl Prozkoumat terapeutický účinek fenylethanoidních glykosidů na dyszoospermii vyvolanou cyklofosfamidem (CTX) u myší a předběžně objasnit mechanismy, které se tohoto procesu účastní. Metody Fenylethanoidní glykosid byl extrahován ethanolovou extrakcí, 40 samců myší BALB/C bylo náhodně rozděleno do kontrolní skupiny, modelové skupiny, skupiny s nízkou dávkou fenylethanoidových glykosidů (50 mg·kg-I) a skupiny s vysokou dávkou fenylethanoidových glykosidů (100 mg ·kg-). S výjimkou kontrolní skupiny byl myší model dyszoospermie založen peritoneální injekcí CTX v denní dávce 80 mg·kg-i, jednou denně po dobu 5 dnů. Po modelování byly fenylethanoidové glykosidy intragastricky podávány v odpovídajících dávkách každé skupině fenylethanoidních glykosidů. Stejný objem normálního fyziologického roztoku byl podáván myším v kontrolní skupině a modelové skupině pomocí gastrogavage. Všechny léky byly podávány jednou denně po dobu 30 dnů. Tkáň varlat byla získána 24 hodin po posledním intragastrickém podání. Hladina testosteronu v homogenátu tkáně varlete byla stanovena pomocí enzymatického imunosorbentního testu. Byly porovnány počty spermií, rychlosti motility a míry teratozoospermie v různých skupinách. Morfologické změny tkáně varlete byly sledovány pomocí HE barvení. Výsledky Ve srovnání s kontrolní skupinou se u modelové skupiny snížil počet spermií a rychlost motility, zvýšila se míra teratozoospermie a snížila hladina testosteronu v homogenátu tkáně varlete (P<0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" counts="" and="" the="" motility="" rates="" were="" increased,="" the="" teratozoospermia="" rates="" were="" decreased,="" and="" the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testis="" tissue="" homogenate="" were="" increased="" in="" phenylethanoid="" glycosides=""><0.05 or=""><0,01). the="" histological="" results="" showed="" atrophy="" and="" degeneration="" of="" seminiferous="" tubule,="" thicker="" seminiferous="" epithelium,="" and="" azoospermic="" lumina="" in="" the="" model="" group;="" the="" number="" of="" seminiferous="" epithelial="" layers="" was="" increased="" and="" the="" seminiferous="" cells="" orderly="" arranged,="" and="" many="" sperms="" were="" found="" in="" the="" tubules="" in="" phenylethanoid="" glycosides="" groups.="" conclusion="" phenylethanoid="" glycosides="" have="" obviously="" therapeutical="" effects="" on="" ctx-induced="" dyszoospermia="" in="" mice,="" and="" their="" mechanisms="" might="" be="" correlated="" with="" recovering="" the="" testosterone="">

Klíčová slova: fenylethanoidní glykosidy; cyklofosfamid; spermatogenní poškození; myši, BALB/C

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

V důsledku zrychlení sociálního rytmu, špatných životních návyků a znečištění životního prostředí a dalších faktorů se abnormální kvalita spermií, jako je oligospermie a astenospermie, stala hlavní příčinou mužské neplodnosti [1]. V současné době existuje méně léků pro léčbu oligospermie a astenospermie a terapeutický účinek není zřejmý. Předpisy nebo aktivní složky tradiční čínské medicíny mají dobré účinky na zlepšení mužské reprodukční funkce [2-6]. Vzhledem k široké škále léků na předpis však není jasný vztah mezi farmakologickými účinky a účinnými složkami léku, což omezuje propagaci a aplikaci spermatogenních léků. Výzkum a vývoj účinných ingrediencí tradiční čínské medicíny a studium jejích léčebných účinků při poškození reprodukce má dobrou aplikační hodnotu. Thefenylethanoidové glykosidyv Cistanche cistanche jsou jednou z nejdůležitějších účinných látek v Cistanche. Jsou to obvykle přírodní glykosidy obsahující esterové a oxoglykosidové vazby s -glukózou jako jádrem. Hojně se vyskytují u dvouděložných rostlin 7]. Studie [8] prokázaly, že fenetanolové glykosidy Cistanche mohou chránit spermie krys před oxidačním poškozením in vitro, ale neexistují žádné zprávy o jejich spermatogenezi. Tento experiment studuje terapeutické účinky Cistanchefenylethanoidové glykosidyo spermatogenezi myší se spermatogenezí indukovanou cyklofosfamidem a poskytuje experimentální a teoretický základ pro aplikaci fenetylalkoholových glykosidů Cistanche při léčbě poruch spermatogeneze.

1 Materiál a metody

1.1 Pokusná zvířata, hlavní činidla a nástroje

40 dospělých myší BALB/C s SPF, stáří 6-8 týdnů, váha 20-22 g, zakoupeno od Animal Experimental Center of Jilin University School of Basic Medicine, číslo zvířecího certifikátu: SCXK ( Kyrgyzstán) {{3} }. Myši byly 5 dní před experimentem chovány adaptivně. Podmínky krmení: 22 stupňů -25 stupňů, cirkadiánní rytmus (12 h/12 ​​h), pitná voda a jídlo zdarma. Cistanche je produkt společnosti Xinjiang Dakang Trading Company, cyklofosfamid pro injekce byl zakoupen od společnosti Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (číslo šarže 11061921), souprava imunoanalýzy s testosteronem spojený s homogenátem testikulární tkáně byla zakoupena od společnosti Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (číslo šarže 20120812), ostatní činidla jsou všechna v tuzemsku vyráběná v analytické kvalitě. Čtečka mikrodestiček PLUS384 (MDC, USA), inverzní mikroskop TE2000U (Nikon, Japonsko), centrifuga J-26XP (Nanodrop, USA).

1.2 Příprava cistanchefenylethanoidové glykosidy

10 gCistanche tubulosaprášek byl refluxován se 70% ethanolem, dvakrát, pokaždé 2 hodiny, aby se získalfenylethanoidní glykosidsoustřeď se. Koncentrovaný roztok byl podroben sloupcové chromatografii na makroporézní pryskyřici D101 a eluován 70% ethanolem, aby se získalCistanche fenylethanoidní glykosidalkohol. UV spektrofotometr identifikoval extrakt při vlnové délce 333 nm.

1.3 Příprava zvířecího modelu a způsoby podávání

40 samců myší BALB/C bylo adaptivně krmeno po dobu 5 dnů a myši byly náhodně rozděleny do 4 skupin (10 myší v každé skupině): kontrolní skupina, modelová skupina, dávka nízkofenylethanoidních glykosidů Cistanche cistanche a dávka fenetylalkoholu Cistanche s vysokou dávkou glykosidová skupina. S výjimkou kontrolní skupiny byla dalším třem skupinám myší podávána intraperitoneální injekce cyklofosfamidu 80 mg·kg-1 každé myši po dobu 5 po sobě jdoucích dnů k přípravě zvířecích modelů poruchy spermatogeneze. Poté, co byl připraven model, myši ve skupinách s nízkou a vysokou dávkouCistanche fenylethanoidbylo podáno 50 a 100 mg.kg-'·d-'. , 1krát denně po dobu 30 po sobě jdoucích dnů. Všechny myši byly usmrceny 24 hodin po posledním podání a byly provedeny bilaterální testy. Pravé varle bylo fixováno ve formaldehydu. Epididymis a varle byly odebrány z levé strany. Varle byla homogenizována a centrifugována při 3,000 r·min po dobu 10 minut. Supernatant byl odebrán a uchováván v chladničce při 20 stupních pro testování. Levé nadvarle bylo testováno na hustotu spermií, motilitu spermií a míru deformace.

1.4 Stanovení hustoty spermií, motility spermií a míry deformace

Umístěte zkumavku obsahující 10 ml živného roztoku pro spermie do vodní lázně s konstantní teplotou, aby se předehřála na 37 stupňů, odstraňte pojivovou tkáň a tuk z jedné strany nadvarlete, odřízněte tkáň a vložte ji do zkumavky při teplotě 37 stupňů. po dobu 10 min. Poté, co jsou spermie zcela volné, kápněte 1 kapku na destičku pro počítání krvinek a vypočítejte hustotu spermií podle metody počítání buněk. Výsledek je vyjádřen jako počet spermií na mililitr; dále odeberte 5 μl suspenze spermatu ze zkumavky a smíchejte ji se stejným množstvím Eosin-Y rovnoměrně, umístěte ji na 10 minut při pokojové teplotě, přidejte krycí sklo a pozorujte světelným mikroskopem. Mrtvé spermie jsou obarveny růžově a živé spermie nejsou obarveny, ale cytoplazma je průhledná. Spočítejte 200 spermií na vzorek, vypočítejte životaschopnost spermií a výsledek se vyjádří v procentech, životaschopnost spermií=počet živých spermií/celkový počet spermií × 100 procent . Dalších 5 μl suspenze spermií bylo fixováno v methanolu po dobu 5 minut, vysušeno a obarveno 2% vodným roztokem eosinu po dobu 1 hodiny, opláchnuto a vysušeno fénem. Hledejte části s menším překrýváním spermií pod mikroskopem s nízkým výkonem a pomocí mikroskopu s vysokým výkonem postupně zkontrolujte morfologii spermií. Každá myš zkontrolovala 1000 kompletních spermií. Hlavičky spermií byly odpojené, ve tvaru banánu, amorfní, tlusté, dvouhlavé atd. byly posouzeny jako deformity. Byla vypočtena míra deformace spermií a výsledky byly vyjádřeny v procentech. Míra deformace spermií=počet deformovaných spermií/celkový počet spermií × 100 procent.

1.5 Stanovení reprodukčních hormonů

Varle byla odloupnuta a umístěna do misky s lahvičkou a předchlazené homogenizační médium (0.01 mol·L-sacharózy, 0,01 mol·L{{{{101} 6}}Tris-HCl, 0,1 mmol· L-1EDTA-Naz roztoky, pH 7,4), ořízněte tkáň varlat oftalmologickými nůžkami, nalijte do skleněné homogenizační zkumavky a homogenizujte, centrifugujte při 4 000 ×g po dobu 10 minut při nízké teplotě, odeberte supernatant a použijte imunosorbent s enzymem vázaným na reagencie. Hladina testosteronu v homogenátu testikulární tkáně byla stanovena boxem a pro každý vzorek byly testovány 3 paralelní vzorky. Experimentální kroky a metody byly dokončeny v souladu s pokyny kitu.

1.6 Morfologické pozorování tkáně varlat

Odeberte parafínové řezy myších varlat, HE skvrny a pod světelným mikroskopem pozorujte distribuci spermatogonie a spermatogenních buněk ve tkáni varlat.

1.7 Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí statistického softwaru SPSS 17.0. Hustota spermií, rychlost motility spermií, rychlost deformace spermií a hladina testikulárního testosteronu myší v každé skupině byly vyjádřeny jako z±s a srovnání mezi skupinami bylo provedeno jednosměrnou analýzou rozptylu.

2. výsledky

2.1 Hustota spermií, životaschopnost spermií a míra deformace spermií každé skupiny myší

Ve srovnání s kontrolní skupinou se u modelové skupiny snížila hustota spermií a rychlost motility spermií (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" increased=""><0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0.01). compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="">Glykosid fenethylalkoholu Cistancheskupina zvýšená hustota a pohyblivost spermií (P<0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><>

2.2 Hladiny testosteronu v tkáních varlat myší v každé skupině

Hladiny testosteronu v homogenátech testikulární tkáně kontrolní skupiny a modelové skupiny byly (10,26±00,57) a (5,33±0,84) nmol·L-', v daném pořadí. Hladina testosteronu u modelové skupiny byla významně nižší než u kontrolní skupiny (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="">Cystanche fenylethanoidový glykosidskupina byla (7,55±1,21) a (10,35±0,94) nmol·L-1. Hladiny testosteronu v nízké a vysoké dávce Cistanchefenylethanoidní glykosidskupiny byly významně vyšší než u modelové skupiny (P<0.05 or=""><0.01). the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" low-dose="" group=""><>

2.3 Morfologie varlat myší v každé skupině

Pozorováno světelným mikroskopem; spermatogenní tubuly ve varlatech normální skupiny jsou hustě uspořádány, počet a počet zárodečných buněk je mnoho, semenotvorný epitel je uspořádán úhledně a všechny semenotvorné tubuly jsou tvořeny spermiemi. V modelové skupině byly semenotvorné tubuly ve varlatech myší atrofované a degenerované, semenotvorný epitel byl významně ztenčen, počet vrstev epitelu byl snížen, uspořádání bylo neuspořádané a počet spermií v dutině byl snížen. Ve srovnání s modelovou skupinou, počet semenotvorných tubulů a semenotvorných epiteliálních vrstev v nízké dávceCystanche fenylethanoidový glykosidskupina se zvýšila, uspořádání epitelu bylo pravidelnější a poškození semenných tubulů se významně zlepšilo; vysoká dávkaCystanche fenylethanoidový glykosidskupina výrazně zlepšila strukturu semenotvorných tubulů, výrazně se zvýšil počet a počet semenotvorných epitelů, jsou přehledně uspořádány, v semenotvorných tubulech jsou zralé spermie a struktura se v podstatě vrátila do normálu. Viz obrázek 1 (vložka 6).