Rychlá a spontánní poporodní clearance Plasmodium Falciparum souvisí s vypuzením placenty

Parazitémii u těhotných žen s protektivní imunitou vůči malárii Plasmodium falciparum často dominují VAR2CSA-pozitivní infikované erytrocyty (IE). VAR2CSA zprostředkovává sekvestraci IE v placentě. Předpokládali jsme, že dříve pozorované spontánní poporodní vymizení parazitémie u těchto žen souvisí s vypuzením placenty, což odstraňuje sekvestrační zaměření VAR2CSA-pozitivních IE. Hodnotili jsme parazitémie a genovou transkripci před a krátce po porodu u 17 ghanských žen. Strmý pokles poporodní parazitémie byl doprovázen selektivním snížením transkripce genu kódujícího VAR2CSA. Naše zjištění poskytují mechanické vysvětlení dřívějšího pozorování.

Klíčová slova.

získaná imunita; VAR2CSA; pfEMP1; placentární malárie; Plasmodium falciparum; těhotenství; var geny; variantně specifická imunita.

Obyvatelé oblastí se stabilním přenosem parazitů Plasmodium falciparum získávají značnou ochrannou imunitu vůči malárii v dětství, jak je uvedeno v odkazu [1]. P. falciparum erytrocytární membránový protein 1 (PfEMP1) je rodina parazitních antigenů, kódovaných přibližně 60 geny var na genom a zprostředkovávající sekvestraci zralých infikovaných erytrocytů (IE) na hostitelské vaskulární receptory, shrnuto v odkazu [2]. Navzdory důležitosti PfEMP1 v získané ochranné imunitě se ženy v těchto oblastech stávají během těhotenství vysoce náchylné k malárii. To souvisí s infekcemi parazity exprimujícími PfEMP1 typu VAR2CSA, což vede k akumulaci IE v intervilózním prostoru, což způsobuje placentární malárii [2, 3].

VAR2CSA zprostředkovává adhezi IE na nízkosulfatovaný chondroitin sulfát (CSA), hostitelský receptor, který je normálně omezen na placentu [4]. Receptorově specifická sekvestrace IE je důležitou strategií přežití parazitů, protože zabraňuje destrukci sleziny zralých IE [2]. VAR2CSA-pozitivní IE mají proto obrovskou nevýhodu v přežití u netěhotných hostitelů a VAR2CSA-specifický imunoglobulin G (IgG) není získán před prvním těhotenstvím [2, 3]. To vysvětluje vysokou vnímavost těhotných žen (a zvláště primigravidae) k malárii P. falciparum, a to i v oblastech se stabilním přenosem parazitů, kde je značná ochranná imunita získána dlouho před dosažením plodného věku [3]. Infekcím P. falciparum u těhotných žen skutečně často dominují parazité exprimující VAR2CSA [5], ačkoli běžně se vyskytují i ​​parazité exprimující jiné typy PfEMP1 (a pravděpodobně sekvestrující mimo placentu) [6]. Na tomto základě navrhujeme, že lze definovat 2 zásadně odlišné typy malárie u těhotných žen. Jedním z nich je placentární malárie, která je způsobena parazity exprimujícími VAR2CSA a která se vyskytuje hlavně u žen s nízkou paritou bez podstatné ochranné imunity specifické pro VAR2CSA. Druhým typem je malárie způsobená parazity, kteří exprimují jiné typy PfEMP1 a kde se IE sekvestrují v neplacentárních tkáních. Tento druhý typ není omezen na těhotné ženy a může se vyskytnout u žen jakékoli parity. Jednoduše odráží mezery ve variantě (hlavně PfEMP1) specifické imunitě obecně [7].

S ohledem na tyto body jsme předpokládali, že dřívější zprávy o spontánním vymizení parazitémie P. falciparum u těhotných žen v Africe během několika dnů po porodu [8, 9] odrážejí náhlé vymizení sekvestračního zaměření VAR2CSA-pozitivních IE jako placenta je vypuzena během porodu.

METODY

Místo studie a účastníci

Studie byla provedena v 5 zdravotnických zařízeních (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree a Saltpond) v centrální oblasti Ghany. Přenos P. falciparum ve studované oblasti je stabilní, ale se značnými sezónními výkyvy.

Mezi listopadem 2020 a únorem 2021 byly přijaty ženy s jakoukoli formou těhotenských komplikací, které písemně souhlasily s účastí ve studii po obdržení ústních a písemných informací o jejích cílech. Ačkoli většina žen dostávala přerušovanou preventivní léčbu jako součást současné politiky předporodní péče v Ghaně (doplňková tabulka 1), žádná z nich nedostala žádnou formu antimalarické léčby po dobu trvání studie (tj. krátce před porodem až do konce jejich účast o několik dní později). Studie byla schválena institucionálním kontrolním výborem Noguchi Memorial Institute for Medical Research (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) a etickou komisí výzkumu Ghana Health Service (GHS-ERC 005/08/20).

Detekce a kvantifikace infekce P. falciparum

Infekce parazity P. falciparum byla stanovena rychlým diagnostickým testem, mikroskopií krevních nátěrů obarvených Giemsou a kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (qPCR) v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve [10, 11] s použitím odebraných vzorků periferní krve. DNA extrahovaná ze šesti 10-násobných ředění in vitro kultury kruhového stádia P. falciparum IT4 při 1% parazitémii byla použita k vytvoření standardní křivky umožňující qPCR kvantifikaci parazitémie.

Analýza transkripce genu var

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 stupně od očekávané hodnoty. Množství transkriptu bylo vypočteno pomocí 2-ΔCt, kde střední ΔCt=střední Ctvar pár primerů – průměrná Ctendogenní kontrola.

Statistická analýza

Asociace mezi transkripcí var2csa a klinickými proměnnými byly testovány pomocí Spearmanovy rank korelace s korekcí pro vícenásobné testování. Korelace mezi parazitémiemi detekovanými mikroskopicky a pomocí PCR byla hodnocena Pearsonovým testem korelace produkt-moment. Data získaná v různých časových bodech byla porovnána analýzou rozptylu s opakovaným měřením (RM-ANOVA) nebo pomocí RM-ANOVA na řadách (RM-ANOVA-R), podle potřeby, následovaným post hoc testováním na párové rozdíly. K analýze dat a hodnot P byl použit software SigmaPlot verze 14 (Systat Inc).<.05 were considered significant.

VÝSLEDEK

Účastníci studie

Celkem 377 souhlasných žen bylo během porodu vyšetřeno na infekci P. falciparum. Z nich bylo 15 (4.0 procenta) parazitárních podle mikroskopie krevního nátěru z periferního bodnutí prstu, 24 (6,4 procenta) podle rychlého diagnostického testu a 50 (13,3 procenta) podle PCR. Na základě těchto výsledků bylo zařazeno 17 rychlých diagnostických testů pozitivních a vybráno ke kontrole 8–16 hodin po porodu, 24–48 hodin po porodu a 48–72 hodin po porodu. Klinické informace účastníků studie jsou shrnuty v doplňkové tabulce 1. Nebyly zjištěny žádné statisticky významné souvislosti mezi podílem parazitů přepisujících var2csa a žádnou z uvedených klinických proměnných.

Poporodní odstranění parazitémie

V době porodu byli všichni účastníci studie parazitičtí krevním nátěrem a/nebo qPCR (doplňková tabulka 1). 8 až 16 hodin po porodu se mikroskopicky detekovatelná parazitémie spontánně snížila (tj. bez terapeutického zásahu) u 14/17 žen (obrázek 1A). 24–48 hodin po porodu se parazitémie dále snížily a byly velmi nízké nebo nedetekovatelné u většiny žen (P=0,03 ve srovnání s před porodem, Friedman RM-ANOVA-R). O dalších 24 hodin později byly všechny ženy kromě 1 bez detekovatelné parazitémie (P=0,005 ve srovnání s před porodem, RM-ANOVA-R). Pokud jde o parazitémie detekované pomocí PCR (obrázek 1B), poporodní parazitémie byly významně nižší o 24–48 hodin a 48–72 hodin než před porodem (P < 0,001, RM-ANOVA-R). Hladiny byly také významně nižší 48–72 hodin po porodu než 8–16 hodin po porodu (P < 0,001, RM-ANOVA-R). Parazitémie odhadnuté mikroskopicky a qPCR významně korelovaly (P < 0,001). Tato data potvrzují předchozí zprávy o rychlém a spontánním poporodním vymizení parazitémie P. falciparum u žen žijících v oblastech se stabilním přenosem tohoto parazita [8, 9].

Transkripce parazitů var Genes

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90 procent celkové transkripce var) u 9/17 žen a transkripce var2csa mohla být detekována u všech (obrázek 2 a doplňkový obrázek 1). Transkripce var genů, které nejsou spojeny s placentární malárií, byla tedy detekována (kromě var2csa) u všech účastnic před porodem a dominovala u některých žen, v souladu s předchozími pozorováními [6].

Podíl transkriptů var2csa se snížil během poporodního sledování u všech žen (obrázek 2 a doplňkový obrázek 1), paralelně s poklesem parazitémií (obrázek 1). Došlo tedy k výraznému posunu od transkripce var2csa před dodáním k transkripci jiných genů var po porodu. Jedinými výjimkami (mezi těmi ženami, kde byly k dispozici údaje o poporodní transkripci), byly účastnice B213, S003, S001 a B201 (doplňkový obrázek 1). Nicméně na základě pozorování, že poporodní parazitémie u těchto žen také výrazně poklesly (obrázek 1), považujeme za pravděpodobné, že by byl patrný odpovídající posun od transkripce var2csa, kdyby byla k dispozici data z pozdějších časových bodů. Celkově jsou data plně v souladu se selektivním vymizením VAR2CSA-pozitivních IE, jak jsme předpokládali.

DISKUSE

PfEMP1 je rodina proteinů exportovaných intraerytrocytárními parazity P. falciparum na povrch IE, kde fungují jako adhezní ligandy pro různé vaskulární receptory hostitele [2]. Tyto ligandy jsou kódovány klonálně variantní genovou rodinou var s přibližně 60 členy na genom haploidního parazita. Geny jsou transkribovány a translatovány vzájemně se vylučujícím způsobem, což zajišťuje, že na povrchu IE je v daném okamžiku exprimován pouze jeden PfEMP1. Každý parazit má však potenciál přepínat mezi svými různými geny var, což umožňuje změny v IE adhezní specificitě a antigenních vlastnostech [2].

Proteiny PfEMP1 mohou být seskupeny a podskupiny podle souboru strukturních kritérií, která ovlivňují jejich funkční charakteristiky [2]. Skupina A PfEMP1 (kódovaná asi tuctem genů var na genom) tedy zprostředkovává adhezi IE k hostitelským receptorům, jako je EPCR a ICAM-1, a je zapojena do patogeneze těžké dětské malárie obecně a mozkové malárie konkrétně [2]. Naproti tomu se zdá, že transkripce genů patřících do skupiny B a C je spojena s nekomplikovanou malárií a asymptomatickými infekcemi. A konečně, PfEMP1 typu VAR2CSA, kódovaný pouze jedním nebo několika geny var2csa na genom parazita, je funkčně a antigenně zcela odlišný od všech ostatních PfEMP1 a je silně zapojen do patogeneze a také do získané imunity vůči placentám. malárie [2, 3, 13].

Kromě toho většina dostupných důkazů ukazuje na VAR2CSA jako na hlavní a pravděpodobně jediný bona fide ligand CSA. Konečně bylo již dříve prokázáno, že periferní parazitémie u těhotných žen s celoživotní expozicí P. falciparum zahrnuje a často v ní dominují IE, které jsou VAR2CSA-pozitivní a mají obecný charakteristický fenotyp placentárních infekcí P. falciparum [5, 13– 15]. Na tomto základě jsme předpokládali, že nejpřesvědčivějším vysvětlením pro spontánní vymizení parazitémie u těhotných žen během několika dnů po porodu [8, 9] je selektivní destrukce sleziny VAR2CSA-pozitivních IE po vypuzení placenty během porodu, která účinně odstraňuje jejich příbuzný adhezní receptor.

Zde prezentované výsledky potvrzují dříve uváděnou [8, 9] rychlou poporodní clearance periferní parazitémie P. falciparum (obrázek 1). Dále podporují pozorování, že periferní parazitémie u afrických těhotných žen zahrnuje a často je ovládána parazity přepisujícími var2- csa [6, 15] (obrázek 2 a doplňkový obrázek 1). Nejdůležitější však je, že naše data rozšiřují tato dřívější pozorování tím, že poskytují poprvé přesvědčivé důkazy pro mechanické vysvětlení rychlého poporodního vymizení periferních parazitů u žen s přirozeně získanou imunitou vůči malárii P. falciparum. Kromě numericky velmi malého a pouze hraničně významného rozdílu v transkripci var skupiny A1 (doplňkový obrázek 2), jedinou velkou a statisticky významnou změnou v transkripci genů var po porodu byla snížená relativní transkripce var2csa (obrázek 2B a doplňkový Obrázek 2).

Naše studie má omezení. Velikost vzorku je malá. Důvodem je především úspěšná implementace intermitentní preventivní léčby malárie u těhotných žen, která snížila výskyt placentární malárie a vyžádala si screening mnoha žen, aby se našly vhodné účastnice. Kromě toho omezená zařízení na našem studijním místě bránila přímému posouzení specifity adhezního receptoru odebraných IE nebo jejich imunologického fenotypu. Současné důkazy a dřívější nálezy se však hladce spojují.

Na závěr jsme předložili důkazy o tom, že náhlé vymizení sekvestračního ohniska VAR2CSA-pozitivních IE při vypuzení placenty významně přispívá k rychlému a spontánnímu poporodnímu vymizení parazitémie P. falciparum u žen s přirozenou expozicí těmto parazitům. Paraziti, kteří přepisují jiné geny var a vykazují na povrchu IE PfEMP1 jiného typu než VAR2CSA, často nejsou schopni prospívat a způsobit onemocnění u dospělých v endemických oblastech kvůli ochranné PfEMP1-specifické imunitě vůči malárii získané v dětství [2] . Pokračující přežití non-VAR2CSA IE po porodu může být dále ohroženo fyziologickými procesy spojenými s porodem, jako jsou prozánětlivé imunitní reakce. Konečně by mohl přispět nezveřejněný příjem antimalarických léků bezprostředně před porodem. Ať už byl důvod jakýkoli, parazitémie u některých žen po porodu výrazně poklesla, přičemž var2csatranskribující parazité tvořili pouze menšinu parazitémie před porodem, a toto zjištění si zaslouží další studium. Naše studie podporuje klíčovou roli PfEMP1 v získané imunitě vůči malárii obecně, a konkrétně VAR2CSA v patogenezi a imunitě placentární malárie.

Doplňkové údaje

Doplňkové materiály jsou k dispozici v The Journal of Infectious Diseases online. Publikované materiály se skládají z údajů poskytnutých autory ve prospěch čtenáře. Publikované materiály nejsou kopírovány a jsou za ně výhradně odpovědní autoři, takže dotazy nebo komentáře by měly být adresovány příslušnému autorovi.

Poznámky

Autorské příspěvky.

Koncepcí a designem studie přispěly NGA, MPQ, MFO a LH. NGA provedl odběr vzorků. NGA, MPQ a LH provedly analýzu dat. NGA, MPQ a LH připravily rukopis. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi rukopisu.

Poděkování.

Jsme vděční všem ženám, které souhlasí s účastí v naší studii. Děkujeme také všem porodním asistentkám, lékařům, lékařským asistentům a sestrám v různých zdravotnických zařízeních za pomoc při odběru vzorků.

Zřeknutí se odpovědnosti.

Investoři nehráli žádnou roli v návrhu studie, sběru a analýze dat, rozhodování o publikaci nebo přípravě rukopisu. Finanční prostředky na zaplacení poplatků za publikaci Open Access za tento článek poskytla Danida.

Finanční podpora.

Tuto práci podpořila Danida (číslo grantu 17-02-KU do projektu MAVARECA-II), včetně doktorandského studia na NGA Výkonná agentura pro výzkum Evropské komise podpořila MPQ (číslo grantu 101028915, Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship 2020 , projekt PAMSEQ).

Možné střety zájmů.

Všichni autoři: Žádné hlášené střety zájmů. Všichni autoři zaslali formulář ICMJE pro zveřejnění potenciálního střetu zájmů. Rozpory, které redakce považuje za relevantní pro obsah rukopisu, byly odhaleny.

Reference