Program renální fibrogeneze je řízen mikroRNA regulujícími oxidační metabolismus

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc,d

Santiago Lamesa**

Program fyziologických a patologických procesů, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Španělsko

b Genomic Facility, Parque Científico de Madrid, Madrid, Španělsko

c Ústav patologie, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Španělsko

d Ústav lékařství a lékařských oborů, Výzkumná nadace Fakultní nemocnice "Principe de Asturias," IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Španělsko

Klíčová slova: MicroRNAS, Fibróza ledvin, Oxidace mastných kyselin, Extracelulární matrix, CPT1A, Mitochondrie

cistanche kulturistika je velmi dobrá pro funkci ledvin

A B S T R A C T

Nadměrná akumulace extracelulární matrix (ECM) je charakteristickým znakem fibrotických onemocnění. V ledvinách je to poslední běžná cesta převládajících onemocnění, která vede k chronickému selhání ledvin. Zatímco cytokiny jako TGF- hrají zásadní roli v transformaci myofibroblastů, nedávná práce ukázala, že mitochondriální dysfunkce a defektní oxidace mastných kyselin (FAO), které ohrožují hlavní zdroj energie pro renální tubulární epiteliální buňky, byly navrženy jako zásadní přispěvatelé. k rozvoji a progresi fibrózy ledvin. Bylo popsáno, že mikroRNA (miRNA), které regulují genovou expresi post-transkripčně, řídí renální fibrogenezi. Abychom identifikovali miRNA zapojené do metabolické poruchy renální fibrózy, provedli jsme screening miRNA čipu na myším modelu unilaterální ureterální obstrukce (UUO). MiR-150-5p a miR-495-3p byly vybrány pro jejich vazbu na lidskou patologii, jejich roli v mitochondriálním metabolismu a jejich zacílení na enzym CPT1A zajišťující přeměnu mastných kyselin. Zjistili jsme 2- a 4-násobnou upregulaci miR-150-5p a miR{8}}p, v tomto pořadí, v obou modelech UUO i v modelech nefropatie vyvolané kyselinou listovou (FAN). , zatímco TGF- 1 upreguloval jejich expresi v lidské renální tubulární epiteliální buněčné linii HKC-8. Tyto miRNA synergizovaly s TGF-, pokud jde o jeho profibrotický účinek, posílením markerů spojených s fibrózou Acta2, Col1 1 a Fn1. Bioenergetické studie prokázaly snížení rychlosti spotřeby kyslíku spojené s FAO (OCR) v buňkách HKC-8 v přítomnosti obou miRNA. V souladu s tím byly hladiny exprese jejich mitochondriálně souvisejících cílových genů CPT1A, PGC1 a mitochondriálního transkripčního faktoru A (TFAM) sníženy na polovinu v renálních epiteliálních buňkách vystavených těmto miRNA. Naproti tomu jsme nezaznamenali změny v mitochondriální hmotě a transmembránovém potenciálu (ΔѰm) ani v produkci mitochondriálních superoxidových radikálových aniontů. Naše data podporují, že miR-150 a miR- 495 mohou přispívat k renální fibrogenezi tím, že zhoršují metabolické selhání kriticky zahrnuté v tubulárních epiteliálních buňkách, což nakonec vede k fibróze.

1. Úvod

Chronické onemocnění ledvin (CKD) je klinický stav, kdy je snížená funkce ledvin udržována. Obecně je považován za nevratný a progresivní. Představuje závažný problém veřejného zdraví, který může postihnout 12–14 procent běžné populace [1]. Může být přítomen asi u 30–40 procent pacientů s vysoce převládajícími patologiemi, jako je diabetes mellitus a hypertenze, kde přispívá k určování vývoje a prognózy. Bez ohledu na etiologii onemocnění vede progrese CKD k tubule-intersticiální a glomerulární fibróze [2]. Tubulo-intersticiální fibróza zahrnuje expanzi prostoru mezi tubulární bazální membránou a peritubulárními kapilárami prostřednictvím ukládání matricových proteinů (ECM) (především kolagen typu I a III a fibronektin) ve spojení se zánětlivými buňkami, ztrátou tubulárních buněk a akumulací myofibroblastů [3].

Transformující růstový faktor- (TGF- ) je považován za klíčový všudypřítomný profibrotický cytokin a hlavní regulátor diferenciace myofibroblastů u fibrózy [4]. Nedávné studie prokázaly, že globální defekt oxidace mastných kyselin (FAO), vedoucí ke kompromisu v hlavním zdroji energie pro tubulární epiteliální buňky, hraje důležitou roli ve vývoji fibrózy ledvin [5,6]. TGF- potlačuje FAO způsobem závislým na SMAD3-a PGC1A, a tudíž ovlivňuje transkripční regulátory vychytávání a oxidace mastných kyselin, včetně CPT1A [5]. Změny FAO nakonec vedou k intracelulární akumulaci lipidů a depleci ATP, což vede k fibróze [5,7]. Terapeutické možnosti tedy mohou poskytnout strategie zaměřené na obnovení metabolické poruchy působící u CKD [8].

MikroRNA (miRNA) se ukázaly jako kritické regulátory genové exprese díky jejich působení na posttranskripční regulaci. V ledvinách bylo prokázáno, že miR hrají kritickou roli v nefrogenezi, homeostáze a onemocnění [9]. MiRNA jsou také schopny regulovat fibrotické procesy a byly označeny jako „fibróza“ [10]. Navíc, vzhledem k nedostatku účinné terapie k prevenci nebo zvrácení renální fibrogeneze [11], byla jako slibná terapeutická strategie pro CKD navržena manipulace exprese miRNA in vivo dodáním mimetik nebo inhibitorů miRNA [12]. Kromě toho mohou cirkulující miRNA představovat diagnostické a dokonce prognostické biomarkery [13].

Ke kontrole fibrózy ledvin zprostředkované miRNA dochází především prostřednictvím regulace signalizace TGF- 1 buněčně závislým a kontextově závislým způsobem, přičemž se jako jeden z hlavních cílů využívá Smadova dráha [14]. V předchozí práci jsme identifikovali několik miRNA, které mají vliv na renální fibrózu regulací specifických metabolických drah [15,16]. Nadměrná exprese miR-9-5p zabraňuje dediferenciaci tubulárních epiteliálních renálních buněk a přeprogramovává metabolickou poruchu související s fibrózou [16], zatímco ztráta funkce miR-33, ať už genetická nebo farmakologická, vede ke zvýšení FAO a prevence akumulace lipidů v buňkách tubulárního epitelu. To je spojeno se zvýšeným přísunem energie, zlepšenou mitochondriální bioenergetikou a prevencí experimentální renální fibrózy [15]. MiRNA regulující buněčnou bioenergetiku jsou tedy také schopné regulovat renální fibrogenezi. V této studii jsme použili strategii založenou na miRNA array v modelu chronického poškození ledvin jednostranné ureterální obstrukce (UUO) k identifikaci miRNA zapojených do renálního fibrotického fenotypu prostřednictvím modifikace metabolických drah. Výběrem několika genů souvisejících s mitochondriální funkcí (CPT1A, TFAM, PGC1A) jsme identifikovali miR-150 i miR{19}} jako miRNA schopné snižovat rychlost spotřeby kyslíku spojenou s FAO (OCR) a podporovat TGF{ {21}}indukovaná fibrogenní transformace v lidské renální tubulární epiteliální epiteliální linii HKC-8. Naše zjištění zdůrazňují význam miRNA jako mitochondriálních metabolických regulátorů zapojených do renální fibrogeneze.

2. Materiál a metody

Buněčné linie a kultivační podmínky. Lidské renální proximální tubulární epiteliální buňky (HKC -8) byly kultivovány v DMEM/F12 (Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) doplněném 15 mM HEPES, 5 procent (objem/objem) fetální hovězí sérum (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Inzulin-Transferin-Selen (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0,5 ug/ml hydrokortizon (Sigma, St. Louis, MO), 50 jednotek/ ml penicilinu a 50 ug/ml streptomycinu (Gibco, Rockville, MD) při 37 °C a 5 procentech CO2. Tato buněčná linie byla laskavě poskytnuta laboratoří Dr. Susztaka (Philadelphia, Pennsylvania, USA). Ošetření lidským rekombinantním 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) bylo provedeno po bezsérovém hladovění buněk HKC-8 po dobu 12 hodin.

Postup transfekce. Buňky byly naočkovány do 60 mm kultivačních misek k dosažení konfluence 70 procent. Byly transfekovány 40 nM buď mirVana™ miRNA mimika miR-150, miR-495, nebo negativní kontroly miRNA miRNA mirVana™ (Ambion company, USA) pomocí lipofektaminu 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Buňky byly inkubovány s lipofektaminem-pre-miRNA 37 ◦ C po dobu 6 hodin. Následně bylo do kultivačních misek přidáno 5 ml čerstvého média obsahujícího 10 procent FBS a buňky byly udržovány v kultuře po dobu 6 hodin, dokud nebyly použity pro následující experimenty. V případě kombinace s ošetřením TGF- 1 byl aplikován na buňky po nadměrné expresi miRNA podle předchozí části.

Imunoblot. Buňky byly promyty v PBS, homogenizovány a lyžovány v 10}0 μl RIPA lyzačního pufru obsahujícího 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % deoxycholátu sodného, ​​1 % NP-40 a 25 mM Tris– HCl pH 7,6, v přítomnosti proteázy (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) a inhibitorů fosfatázy (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a sklizeno seškrabáním. Čtvrtina kusu každého vzorku ledviny (získaného po disekci na polovinu jak podélně, tak příčně) byla homogenizována ve 300 ul RIPA pufru s 5 mm kuličkami z nerezové oceli (Qiagen, Valencia, CA) za použití TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) vibrujícím při 50 Hz po dobu 15 minut při 4 °C. Vzorky byly vyčeřeny centrifugací při 10,000 g po dobu 15 minut při 4 °C. Peleta byla poté odstraněna a supernatant byl uchováván jako proteinový lyzát. Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) a byly měřeny v systému Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Stejná množství proteinu (10–50 ug) z celkového extraktu byla oddělena na 8–10% SDS-polyakrylamidových gelech a přenesena na nitrocelulózové blotovací membrány (GE Healthcare, Chicago, IL) při 12 V po dobu 20 minut v polosuchém Systém Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, Kalifornie).

Membrány byly blokovány inkubací po dobu 1 hodiny s 5% odtučněným mlékem v PBS obsahujícím 0,5% Tween-20 a blotovány přes noc se specifickými protilátkami: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C přes noc), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C přes noc), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 h, pokojová teplota ). Po inkubaci s IRDye 800 kozími anti-králičími a IRDye 600 kozími anti-myšími (1:15 000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundárními protilátkami byly membrány zobrazeny v triplikátech pomocí Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Pásová denzitometrie byla provedena pomocí softwaru ImageJ 1.48 (http://rsb.info.nih.gov/ij) a relativní proteinová exprese byla stanovena normalizací na GAPDH. Záhybové změny byly normalizovány na hodnoty kontrolních podmínek.

Extrakce RNA. Celková RNA byla extrahována z buněk HKC{0}} nebo myších ledvin pomocí miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) podle pokynů výrobce. Množství a kvalita RNA byly stanoveny při 260 nm spektrofotometrem Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analýza exprese mRNA. Reverzní transkripce (RT) byla provedena s 500 ng celkové RNA za použití iScript™ cDNA Synthesis kitu (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT–PCR byla provedena pomocí iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) za použití 96-well Bio-Rad CFX96 RT–PCR systému s C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) podle pokynů výrobce. Hodnota Ct byla získána z každé amplifikační křivky pomocí analytického softwaru CFX96 poskytnutého výrobcem. Relativní exprese mRNA byla stanovena pomocí metody 2 − ΔACt [17]. Pro účely normalizace byl použit gen 18S. Sekvence primerů použité pro kvantifikaci mRNA byly: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAGAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1:GGATTGTTGCCGATTGCCGATTGCCGATTGACCCC GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGCATCC, RVCTACT-CCCTACTGCCGCTCC,CCTACTCATCTACTGCCGCTCC Záhybové změny byly normalizovány na hodnoty kontrolních podmínek.

Kvantifikace exprese miRNA. Kvantifikace exprese miRNA byla provedena pomocí miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Dánsko). Po RT byl templát cDNA amplifikován pomocí mikroRNA-specifických LNA primerů pro zralé miR150-5p nebo miR{2}}p (Exiqon, Feedback, Dánsko). qRT–PCR byla provedena v 96-jamkovém systému Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System s termocyklerem C1000 s použitím iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) podle pokynů výrobce . Hodnota Ct pro trojité jamky byla získána z každé amplifikační křivky pomocí softwaru CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Hodnoty Ct byly normalizovány na endogenní kontrolní 5S rRNA. Plazmatické hladiny miRNA byly normalizovány na miR-103a-5p. Relativní exprese miRNA byla stanovena pomocí metody 2 − ΔACt [17]. Záhybové změny byly normalizovány na hodnoty kontrolních podmínek.

Myší modely fibrózy ledvin. Myši byly umístěny v zařízení pro zvířata bez specifických patogenů (SPF) v CBMSO v souladu s předpisy EU pro všechny postupy. Se zvířaty bylo zacházeno v souladu s Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat obsaženou ve směrnici Evropského parlamentu 2010/63/EU. Schválení bylo uděleno místním etickým kontrolním výborem Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" v Madridu, Etickou komisí v CSIC a Regulační jednotkou pro experimentální postupy na zvířatech z Comunidad de Madrid.

Unilaterální ureterální obstrukce (UUO): UUO chirurgický výkon byl proveden, jak bylo popsáno dříve [18]. Stručně řečeno, myši byly anestetizovány isofluranem (3–5 procent pro indukci a 1–3 procenta pro udržování) a rozděleny do dvou experimentálních skupin: skupina UUO a skupina s falešnou operací. Ve skupině UUO byly myši oholeny na levé straně břicha, byl proveden vertikální řez kůží skalpelem a kůže byla stažena. Druhý řez byl proveden přes pobřišnici, aby se odhalila ledvina. Levý močovod byl podvázán dvakrát 15 mm pod ledvinnou pánvičkou chirurgickým hedvábím a močovod byl poté přerušen mezi dvěma ligaturami. Poté byla podvázaná ledvina opatrně umístěna zpět do své správné anatomické polohy a byl přidán sterilní fyziologický roztok, aby se doplnila ztráta tekutiny. Řezy byly sešity a myši byly jednotlivě umístěny do klecí. Simulovaná operace byla provedena podobným způsobem, ale bez podvázání močovodu. Buprenorfin byl použit jako analgetikum. První dávka byla podána 30 min před operací a poté každých 12 hodin po dobu 72 hodin v dávce 0,05 mg/kg subkutánně. V tomto modelu se renální průtok krve a rychlost glomerulární filtrace významně sníží během 24 hodin a intersticiální zánět (vrchol za 2–3 dny), tubulární dilatace, tubulární atrofie a fibróza jsou patrné po 7 dnech. Ucpaná ledvina dosáhne maximální dysfunkce kolem 2 týdnů po výkonu. Myši byly usmrceny předávkováním CO2 a kontrolní vzorky a vzorky ucpaných ledvin a krve byly odebrány po perfuzi PBS ve 3, 5, 7, 10 a 15 dnech po UUO.

Kyselina listová indukovaná nefropatie (FAN): V tomto modelu byla fibróza ledvin indukována intraperitoneální (ip) injekcí 250 mg kyseliny listové (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) na kg tělesné hmotnosti rozpuštěné v 0.3 M hydrogenuhličitan sodný (vehikulum), jak bylo popsáno dříve [19]. Kontrolní zvířata dostala 0,3 ml vehikula (ip). Myši byly usmrceny předávkováním CO2 a vzorky ledvin a krve byly odebrány po perfuzi PBS po 15 dnech podávání FA.

profilování mikroRNA. K identifikaci specifických miRNA, které regulují fibrotický výsledek, bylo jako platforma pro profilování mikroRNA vybráno vlastní pole mikroRNA miRCURY LNA (Exiqon, Feedback, Denmark). Tato platforma sestávala z celkem 175 unikátních testů specifických pro myší miRNA přítomné v Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK). Pro každou mikroRNA byl pro analýzu vybrán převažující řetězec. Výběr MiR byl založen na předpokládaných cílových genech souvisejících s renální fibrózou, mitochondriálním metabolismem, redoxními procesy a cirkadiánním rytmem. Tato analýza byla provedena pomocí bioinformatických nástrojů pro predikci cíle miRNA na základě sekvence, mikrokosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) a miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Po extrakci RNA ze vzorků ledvin po 7 dnech UUO byla frakce miRNA přítomná ve 20 ng celkové RNA podrobena reverzní transkripci pomocí miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Denmark) podle pokynů výrobce. Výsledné cDNA byly analyzovány pomocí miRCURY miRNA PCR panelů v systému Roche LightCycler 480 Real-Time PCR s použitím miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Dánsko). Každý vzorek byl analyzován v duplikátech. Tento postup byl proveden v Genomics Facility Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Španělsko). K získání hodnot Cq (Cq) pro každou miRNA byl použit software LC480. Hodnota delta Ct (ACt) byla vypočtena normalizací hodnot Ct na endogenní housekeeping snRNAU6. Tepelná mapa byla vytvořena s daty PCR v reálném čase prezentovanými jako ACt. Hierarchické shlukování bylo sestaveno podle hodnot ΔCt. Hodnota delta Ct (ACt) byla vypočtena odečtením ACt skupiny referenčního vzorku (kontrolní ledvina) od ACt každého vzorku s neprůchodnou ledvinou. Relativní kvantifikace (RQ) nebo násobná změna každé miRNA byla vytvořena pomocí metody 2 − ΔACt [17]. Diferenciálně exprimované miRNA byly identifikovány parametrickým Limma testem. Aby bylo možné vzít v úvahu testování více hypotéz, byly P-hodnoty upraveny (adj.) pomocí Benjamini-Hochbergovy korekce míry falešných objevů (FDR) [25]. Výsledky byly vyneseny do grafu vulkánu.

analýza miRNA v krevní plazmě pacientů s CKD. Hladiny vybraných miRNA byly analyzovány ve vzorcích plazmy od kohorty 100 pacientů s CKD, což je podrobně popsáno níže. Periferní žilní krev byla odebírána do vakuových nádob potažených EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Pro získání plazmy byla krev centrifugována při 40}0 g po dobu 20 minut, supernatant byl přenesen do nové zkumavky a centrifugován při 800 g po dobu 20 minut. Plazma byla odebrána a skladována zmrazená v alikvotech při − 80 ◦ C. Plazmatická miRNA byla extrahována z krve pomocí miRCURYTM RNA Isolation Kit—Biofluids a UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Dánsko). Analýzy hladin miR-150 v těchto vzorcích byly provedeny tak, jak je popsáno v sekci procedury kvantifikace miRNA exprese. Měření spotřeby kyslíku. Rychlost spotřeby kyslíku spojená s oxidací mastných kyselin (OCR) (ligovaná s oxidativní fosforylací) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR) (spojená s produkcí laktátu a glykolýzou) byly studovány pomocí metabolického analyzátoru Seahorse Bioscience podle pokynů výrobce [26]. Buňky HKC-8 byly nasazeny na plotnu p60 a byla provedena transfekce mikroRNA, jak je popsáno výše, když dosáhly konfluence 70 procent o 48 hodin později, buňky HKC-8 byly ošetřeny 10 ng/ml TGF{{ 18}} po dobu 48 hodin. Poté byly buňky nasazeny v množství 2 x 104 buněk na jamku na mikrodestičku pro buněčné kultury Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Po přilnutí buněk bylo růstové médium nahrazeno médiem s omezeným substrátem, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) doplněným 0,5 mM glukózou a 1 mM glutamátem. Jednu hodinu před měřením testu byly buňky inkubovány s Krebs-Henseleit Buffer (KHB) testovacím médiem doplněným 0,2 procenta karnitinu při 37 °C bez CO2. Patnáct minut před testem byl do odpovídajících jamek přidán CPT1 inhibitor Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM a buňky byly inkubovány při 37 °C bez CO2. Nakonec byl bezprostředně před testem přidán BSA nebo 200 uM palmitát-BSA FAO substrát (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Okamžitě byl proveden zátěžový test XF Cell Mito v energetickém analyzátoru Seahorse XFe24 přidáním postupně několika modulátorů mitochondriální funkce. Nejprve byl po bazálním měření použit inhibitor ATP syntázy oligomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). To snižuje tok elektronů přes ETC, což vede ke snížení mitochondriálního dýchání. Dále bylo přidáno oddělovací činidlo kyanid 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), které kolabuje protonový gradient a narušuje potenciál mitochondriální membrány. Výsledkem je, že tok elektronů přes ETC není inhibován a spotřeba kyslíku komplexem IV dosahuje svého maxima. Třetí a poslední injekce je směs inhibitorů komplexu III a I anti-mycin/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Tato kombinace vypíná mitochondriální dýchání a umožňuje výpočet nemitochondriálního dýchání řízeného procesy mimo mitochondrie. Substráty/inhibitory byly připraveny ve stejném médiu, ve kterém byl prováděn experiment, a byly vstřikovány automaticky z portů pro činidla v uvedených časech. Měření byla registrována po 3-min časová období (po celkové období 2 h) a hodnoty byly normalizovány pro celkový obsah bílkovin. Protein byl extrahován z jamek 0,1% roztokem NP-40-PBS a kvantifikován pomocí BCA proteinového testu (Thermo Scientific, Rockford, IL). Pro každou experimentální skupinu byly použity čtyři jamky. K určení klíčových parametrů mitochondriální funkce byl použit mořský koník XFp Cell Mito Stress Test: bazální mitochondriální dýchání, dýchání vázané na ATP, únik protonů (--spotřeba kyslíku nespojená s ATP), maximální dýchání, nemitochondriální dýchání a rezervní dechovou kapacitu, jak bylo popsáno dříve [27].

Luciferázový test. K charakterizaci miRNA{0}} a miRNA{1}} kandidátních vazebných míst v lidském CPT1A 3′-UTR byl použit luciferázový reportérový test obsahující CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347). Místně cílené mutace v seed oblastech předpokládaných miR-150 a miR{12}} míst v rámci 3′ – UTR byly vytvořeny pomocí Multisite-QuikChange sady pro řízenou mutagenezi (Stratagene, La Jolla, CA) podle podle protokolu výrobce. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Všechny konstrukty byly před použitím sekvenovány, aby se potvrdilo, že mají správnou strukturu. Buňky HKC-8 byly nasazeny na destičku s jamkami a byly přechodně kotransfekovány 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (intaktní nebo mutované konstrukce) a 4 ng pGL3-promotor (luciferáza světlušek pod kontrolou promotoru SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) reportérové ​​plazmidy a 40 nM buď miRVana™ napodobující miR-150, miR -495 nebo mimická negativní kontrola miRNA mirVana™ (společnost Ambion, USA) s použitím lipofektaminu 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), když dosáhly konfluence 70 procent, jak je popsáno výše. Pro každou experimentální skupinu byly použity čtyři jamky. Luciferázové testy byly provedeny o 24 hodin později za použití duálního luciferázového reportérového systému (Promega, Madison, WI). Signály luciferázy vanilky a světlušky byly detekovány pomocí multidetekčního systému Glomax (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Aktivita renilla luciferázy byla normalizována aktivitou luciferázy světlušky.

Mitochondriální membránový potenciál (MMP). Změny v MMP byly stanoveny jako rozdíly ve fluorescenci tetramethylrhodamin methylesteru (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Hromadí se v záporně nabitých polarizovaných mitochondriích a fluoreskuje oranžově. Když se mitochondriální membránový potenciál zhroutí v apoptotických nebo metabolicky stresovaných buňkách, reagencie TMRM je rozptýlena v buněčném cytosolu a hladiny fluorescence dramaticky klesnou. Buňky HKC-8 byly kultivovány a transfekovány, jak je popsáno v části o buněčné kultuře a postupu transfekce. Dále bylo růstové médium nahrazeno Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS) bez obsahu fenolové červeně s 10 mM Hepes. Ošetření oligomycinem (5 uM) a FCCP (4 uM) po dobu 5 minut bylo použito jako pozitivní a negativní kontrolní podmínky. Dále byly buňky barveny 250 nM TMRM po dobu 30 minut při 37 °C. Buňky byly sklizeny trypsinem, centrifugovány (3000 rpm, 5 min) a peleta byla resuspendována ve 200 ul HBSS s 1 procentem Bovinní sérový albumin (BSA) a 5 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA). Intenzita fluorescence byla měřena průtokovou cytometrií s použitím emisní vlnové délky 570 nm pro TMRM (FL2) [28] v systému BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) a analyzována pomocí softwaru FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland , NEBO). Pro každou experimentální podmínku bylo analyzováno alespoň 20 000 singletů v triplikátech.

Produkce mitochondriálních superoxidových radikálových aniontů. Hodnocení produkce aniontu superoxidových radikálů bylo provedeno pomocí indikátoru mitochondriálního superoxidového radikálového aniontu Mito-SOX™ Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), vysoce selektivního fluorogenního barviva pro mitochondriální superoxidový radikálový anion v živých buňkách, podle údajů výrobce. instrukce. Buňky HKC-8 byly kultivovány a transfekovány tak, jak je popsáno v části o buněčné kultuře a postupu transfekce. Dále bylo růstové médium nahrazeno Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS) bez obsahu fenolové červeně s 10 mM Hepes. Působení antimycinem A (150 μM) a karbonylkyanidem m-chlorfenylhydrazonem (CCCP) (50 μM) po dobu 5 minut byly použity jako pozitivní a negativní kontrolní podmínky. Dále byly buňky barveny 5 μM MitoSOX™ Red po dobu 30 minut při 37 °C. Buňky byly sklizeny, jak je popsáno v části Potenciál mitochondriální membrány. Intenzita fluorescence byla měřena průtokovou cytometrií s použitím emisní vlnové délky 580 nm pro MitoSOX™ Red (FL2) v systému BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) a analyzována pomocí softwaru FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, NEBO). Pro každou experimentální podmínku bylo analyzováno alespoň 20,{18}} singletů v triplikátech.

Mitochondriální značení. Vyhodnocení mitochondriálního obsahu bylo provedeno pomocí MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), který pasivně difunduje přes plazmatickou membránu a akumuluje se v aktivních mitochondriích bez ohledu na potenciál mitochondriální membrány, podle pokynů výrobce. Buňky HKC-8 byly kultivovány a transfekovány, jak je popsáno v části o buněčné kultuře a postupu transfekce. Dále bylo růstové médium nahrazeno Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS) bez obsahu fenolové červeně s 10 mM Hepes. Buňky byly obarveny 150 nM pomocí MitoTracker™ green FM po dobu 30 minut při 37 °C. Pro analýzu průtokovou cytometrií byly buňky sklizeny tak, jak je popsáno v části potenciálu mitochondriální membrány. Intenzita fluorescence byla měřena pomocí emisní vlnové délky 516 nm pomocí MitoTracker™ green FM (FL1) v systému BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) a analyzována pomocí softwaru FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, OR). Pro každou experimentální podmínku bylo analyzováno alespoň 20{14}} singletů v triplikátech. Pro fluorescenční zobrazování byla jádra také barvena pomocí DAPI (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Živé buňky byly vizualizovány inverzním konfokálním mikroskopem Zeiss LSM 710 s pozorovanou buňkou, objektivem 63X/1,2 Water C-Apo-chromat Corr UV-VIS-IR M27 a analyzovány softwarem Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Německo) .

Stanovení počtu kopií mitochondrií. Genomová DNA byla extrahována z buněk HKC{0}} pomocí soupravy DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) podle pokynů výrobce. Mitochondriální abundance byla stanovena pomocí sady Human Mitochondrial DNA Copy Number Assay Kit (Detroit R&D, Detroit, MI). Relativní počet kopií mtDNA byl prezentován jako poměr mtDNA k jaderné DNA.

Vzorky pacientů s lidským CKD. Pro analýzu plazmatických hladin miRNA byla vybrána kohorta 100 pacientů s CKD (stadium 3–4) z Hospital Principe de Asturias. Zahrnoval dvě různé podskupiny klasifikované podle vývoje jejich renálních funkcí na základě ukazatele GFR MDRD [29] po dobu 24 měsíců: 50 pacientů představovalo méně než 10 procentledvinazhoršení funkce, zatímco u ostatních došlo k alespoň 40procentnímu snížení funkce ledvin nebo k němu došloledvinovésubstituční terapie (dialýza). Také jsme kvantifikovali stupeň fibrózy vledvinanásledují biopsie z jiné kohorty 26 pacientů s dysfunkcí štěpuledvinatransplantace z nemocnice Ramn y Cajal. Všechny biopsie byly hodnoceny podle kritérií Banff 2007 [30].

Statistická analýza. Data byla analyzována pomocí neparametrických testů, pokud není uvedeno jinak. Rozdíl mezi dvěma nezávislými skupinami byl zkoumán Mann-Whitney testem, zatímco více než dvě skupiny byly srovnávány s Kruskall-Wallis testem. P-hodnota 0.05 nebo méně byla považována za statisticky významnou (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" data="" byla="" analyzována="" pomocí="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" data="" jsou="" uvedena="" jako="" průměr="" ±="" standardní="" chyba="" průměru="">

3. Výsledky

Data exprese miRNA v UUO-indukovaných fibrotickýchledviny. Dešifrovat příspěvek miRNA k metabolické regulaciledvinovéfibrogeneze byl 7denní model UUO proveden u WT myší. RNA byla izolována z kontroly a fibrotickéledvinavzorky a profil exprese miRNA byl analyzován v upraveném mikroRNA poli. Výběr miRNA byl založen na jejich potenciálním zacílení na klíčové enzymy zapojené do mitochondriálního metabolismu, redoxních procesů a cirkadiánního rytmu po analýze „in silico“ (podrobněji v sekci Metody). Tepelná mapa odhalila jasně odlišné vzorce exprese v některých miRNA při srovnání fibrotických a kontrolníchledvinavzorky (obr. 1A). Analýza sopečného grafu ukázala, že 73 ze 175 miRNA bylo odlišně exprimováno, 17 up- a 56 down-regulováno, ve vzorcích fibrotických ledvin ve srovnání s kontrolními (obr. 1B, doplňková tabulka 1). Mezi nimi byly vybrány specifické miRNA, které by mohly regulovat fibrotický výsledek v ledvinách prostřednictvím metabolických drah. Za tímto účelem byla provedena in silico analýza 3′UTR (nepřekládaná oblast) specifických genů zapojených do metabolických a mitochondriálních funkcí CPT1A, TFAM, PGC1A pomocí tří nezávislých predikčních nástrojů (Targetscan, miRWalk a miRanda). Kritéria výběru také zahrnovala úroveň renální exprese, novost cílů, stupeň znalostí o metabolické cestě a biologickou významnost. Vazba na lidskou patologii, úroveň exprese ledvinové tkáně, jejich roli v mitochondriálním metabolismu a jejich potenciální cílení na enzym CPT1A přenášející mastné kyseliny nás povzbudilo, abychom se zaměřili na tři miRNA, miR-150-5p, miR{16}}p a miR-33-5p, jako kandidáty schopné regulovat metabolické změny spojené s renální fibrogenezí (obr. 1C). Za zmínku stojí, že CPT1A 3′-UTR obsahuje jedno počáteční místo pro miR-150 a dvě počáteční místa pro miR-495. Pozorovali jsme, že miR-150 a miR{26}} snížily aktivitu luciferázového reportérového testu obsahujícího CPT1A 3′-UTR o ~15 procent, respektive o 25 procent. Tato downregulace byla zcela zrušena v případě bodových mutací (PM) v 3′-UTR CPT1A pro miR-150 vazebné místo (PM2) a částečně chyběla v obou miR-495 vazebných místech (PM1 a PM3) (doplňkový obr. 1A a B). Tato data naznačují přímou interakci CPT1A s miR-150 a miR-495. MiR-33-5p byl předmětem samostatné studie [15]. MiR-150-5p a miR-495-3p byly upregulovány ve vzorcích fibrotických ledvin ve srovnání s kontrolními, s násobnou změnou 3,69 (P-hodnota: 0.012 ) a 1,95 (P-hodnota: 0,012).

MiR-150 a miR{1}} zvyšují profibrotickou odpověď TGF u člověkaledvinovétubulárních epiteliálních buněk. Byla provedena kvantitativní reverzní transkripce – polymerázová řetězová reakce (qRT–PCR), aby se potvrdila změna exprese miR-150-5p a miR{1}}p, která byla identifikována profilováním exprese miRNA v UUOledvinavzorky (obr. 2A a B). Kromě toho byla pomocí qRT-PCR analyzována kinetika exprese miR-150-5p a miR{2}}p v ledvinách 3, 5, 7, 10 a 15 dnů po zákroku UUO. Exprese těchto miRNA byla významně zvýšena 2-krát 5 dní po UUO a zůstala zvýšená 15 dní po UUO (obr. 2C a D). Úroveň exprese těchto miRNA byla také hodnocena v modelu nefropatie kyseliny listové (FAN). Zjistili jsme 4- a 2-násobnou upregulaci miR-495-3p a miR-150-5p, v tomto pořadí, u fibrotickýchledvinaukázky z modelu FAN (obr. 2E). TGF- 1, jeden z hlavních regulátorů fibrogeneze, také indukoval expresi miR-150 a miR-495 v buňkách HKC-8 více než 2-násobně a {{ 6}}krát po 48 hodinách, což podporuje potenciální roli těchto miRNA v událostech souvisejících se signalizací TGF (obr. 3A a B). Aby bylo možné posoudit, zda se miR-150 a miR-495 podílely na profibrotické transformaci tubulárních epiteliálních buněk působením TGF- 1, byla lidská buněčná linie HKC-8 transfekována miR -150-5p nebo miR-495-3p a léčených TGF- 1 po různé doby. Zvýšení hladin miR-150-5p a miR{20}}p významně zvýšilo expresi hladiny mRNA indukované TGF{21}} u markerů souvisejících s fibrózou Acta2, Col1 1 a Fn1 ( obr. 3C a D). Podobně nadměrná exprese miR-150-5p nebo miR-495-3p silně snížila CPT1A a zvýšila hojnost proteinu -SMA (obr. 3E a F). Tato data naznačují, že tyto miRNA se mohou podílet na patogeneziledvinovéfibrózy podporou TGF- 1-dependentní epiteliální dediferenciace tubulárních buněk a také kompromitováním exprese kritického enzymu účastnícího se FAO.

MiR-150 a miR{1}} indukují mitochondriální bioenergetické změny a snižují expresi genů zapojených do klíčové mitochondriální funkce. Abychom získali přehled o metabolických důsledcích vyvolaných podáváním miR-150-5p nebo miR-495-3p, studovali jsme bioenergetický profil člověkaledvinovétubulárních epiteliálních buněk.

Obr. 1. Data exprese miRNA u fibrózy indukované UUO. (A) Tepelná mapa ukazující relativní miRNA expresi kontralaterální a obstrukceledvinymyší C57/BL6-J podrobených postupu UUO po dobu 7 dnů (n=6). Stupnice měřítka se pohybuje od zelené po červenou (od vysokého k nízkému vyjádření) a čísla představují hodnoty ΔCt. Na levé straně jsou označeny miRNA vybrané pro studium. (B) Analýza sopečného grafu miRNA modulovaných UUO. Log10 relativní kvantifikace (RQ) a negativní (−) log10 upravené (adj.) P-hodnoty jsou vyneseny na ose x a y. Každá miRNA je znázorněna tečkou. 73 ze 175 miRNA vykazovalo změněnou expresi ve fibrotických vzorcích (adj. P-hodnota větší nebo rovna 0,05). Vybrané miRNA pro další analýzu jsou zvýrazněny. (C) miR-150-5p a miR-495-3p byly vybrány na základě jejich schopnosti in silico cílení genů CPT1A, TFAM a PGC1A. Pro každou vybranou mikroRNA jsou uvedena konzervovaná cílová místa semen v 3'UTR těchto genů, jejich násobná změna a význam (adj. P-value).

Obr. 2. Úrovně exprese miR-150-5p a miR-495-5p inledvinyz modelů UUO a FAN. (A, B) qRT-PCR analýza exprese miR-150-5p (A) a miR-495- 3p (B) vledvinyz myší 7 dní po UUO ve vzorcích dříve analyzovaných pomocí mikroRNA čipu. (C–E) qRT-PCR analýza exprese miR-150-5pa miR-495-3p po modelu FAN (C) a 3, 5, 7, 10 a 15 dnů po UUO pro miR-150-5p (D) a miR{{10}}p (E). Sloupcové grafy představují průměr úrovní exprese násobné změny ± sem od 6 (A, B, E) a 3 (C a D) myší na skupinu. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" ve="" srovnání="" s="" odpovídajícími="" kontrolními="" podmínkami;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" ve="" srovnání="" s="">ledvinyod myší se stejnou experimentální léčbou.

TGF- 1 byl použit jako modelový cytokin zapojený do profibrotických změn. K určení bioenergetického stavu těchto buněk byla měřena rychlost spotřeby kyslíku spojená s FAO (OCR) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR) buněk HKC-8 během sekvenčního ošetření sloučeninami, které modulují mitochondriální aktivitu v přítomnosti palmitátu. pomocí analyzátoru extracelulárního toku Seahorse XF24 (více podrobností v části Metody). Po 48 hodinách s TGF- 1 buňky HKC-8 v přítomnosti miR-150-5p vykazovaly konzistentní pokles bazálního OCR spojený s tvorbou ATP, dýcháním spojeným s ATP a maximálním dýcháním, což se týká FCCP-senzitivního OCR (obr. 4A). Poškození OXPHOS se odráželo ve snížení obsahu ATP v buňkách HKC-8 nadměrně exprimujících miR-150-5p (obr. 4C). Nepozorovali jsme, že tyto miRNA indukovaly variace v ECAR (data nejsou uvedena). V souladu s tím jsou hladiny exprese mRNA jejich mitochondriálních

související cílové geny CPT1A, PGC1 a mitochondriální transkripční faktor A (TFAM) byly sníženy na polovinu v buňkách ošetřených miR-150 mimikem ve srovnání s miRNA mimickými buňkami ošetřenými NC (obr. 4E). Studie využívající stejný experimentální přístup s miR-495-3p přinesly podobné výsledky (obr. 4B, D, F). Mitochondriální hmota, určená počtem kopií mtDNA a mitochondriálním barvením pomocí MitoTrackerTM green FM, však nebyla významně modulována miRNA-150 a miRNA- 495 jak v bazálních podmínkách, tak při léčbě TGF. V tomto parametru byl bazálně pozorován klesající trend (doplňkový obr. 2A, B, C). Celkově tato data podporují propagaci miR-150 a miR{12}}

pro-fibrotické působení v tubulárních epiteliálních buňkách prostřednictvím poškození mitochondriální funkce.

MiR-150 a miR-495 nemění mitochondriální transmembránový potenciál (ΔѰm) a mitochondriální superoxidový radikál

Obr. 3. MiR-150 a miR-495 zvyšují profibrotickou odpověď závislou na TGF- 1- u člověkaledvinovétubulárních epiteliálních buněk. (A, B) RT–PCR analýza exprese miR{{0}}p (A) a miR{1}}p (B) v buňkách HKC-8 ošetřených 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 po uvedené časy. (C, D) hladiny mRNA alfa-aktinu hladkého svalstva (-SMA), kolagenu alfa 1 typu -1 (Col1 1), fibronektinu (FN) z buněk transfekovaných miR-NC a napodobující miR -150-5p (C) nebo miR-495-3p (D) byly stanoveny pomocí qRT-PCR pomocí Sybr green. Buňky byly ošetřeny TGF- 1 (10 ng/ml) po nadměrné expresi miRNA tam, kde je to indikováno (viz také část metod). (E, F) Imunobloty znázorňující hladiny proteinů CPT1A a -SMA v buňkách transfekovaných miR-NC a napodobují miR-150-5p (E) nebo miR{{20}}p (F) pro uvedené časové body. GAPDH byl použit pro účely normalizace. Sloupcové grafy (pravé panely) představují průměr exprese násobné změny ± sem ze 3 nezávislých experimentů. *P < {{30}}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" ve="" srovnání="" s="" odpovídajícími="" kontrolními="" podmínkami;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" mir-nc="" za="" stejných="" experimentálních="">

Obr. 4. MiR-150 a miR-495 zvyšují TGF 1-indukovanou FAO represi v HKC-8 buňkách. (A, B) Rychlost spotřeby kyslíku (OCR) buněk HKC-8 transfekovaných

40 nM miR-NC a napodobující miR-150-5p (A) nebo miR-495-3p (B) a vystavené 10 ng/ml TGF{{5} } po nadměrné expresi miRNA (viz také část metod). Sloupcové grafy (pravé panely) ukazují míry OCR spojené s bazálními, protonovými úniky, ATP-vázanými, maximálními a rezervními kapacitami a nemitochondriálními respiračními stavy. Data jsou po normalizaci reprezentována množstvím proteinu. (C, E) Hladiny ATP v HKC-8 buňkách transfekovaných miR-NC a napodobují miR-150-5p (C) nebo miR{12}}p (E). (D, F) hladiny mRNA CPT1A, PGC1A a TFAM v buňkách HKC-8 transfekovaných miR-NC a napodobující miR-150-5p (D) nebo miR-495-3p (F) byly stanoveno pomocí qRT-PCR pomocí Sybr green. Sloupcové grafy ukazují průměr ± sem ze 4 nezávislých experimentů. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" ve="" srovnání="" s="" odpovídajícími="" kontrolními="" podmínkami;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" mir-nc="" za="" stejných="" experimentálních="">

produkce aniontů. Potenciál mitochondriální membrány (ΔΨm) generovaný protonovými pumpami (komplexy I, III a IV) je základní složkou v procesu ukládání energie během oxidativní fosforylace. Zvýšený ΔѰm může vést k mitochondriální redoxní perturbaci, zatímco jeho snížení způsobuje snížení produkce ATP, což ohrožuje životaschopnost buněk [254]. Aniont superoxidového radikálu (O2•− ) je volný radikál, který se může generovat v mitochondriích v důsledku úniku elektronů, ke kterému může dojít v několika krocích ETC. Tvorba O2•− v mitochondriální matrix také kriticky závisí na poměrech NADH/NAD plus a CoQH2/CoQ a lokální koncentraci O2 [255]. Jeho nadprodukce může vést ke ztrátě mitochondriální redoxní homeostázy prostřednictvím různých mechanismů, což je stav, který souvisí s mnoha patologickými stavy včetně AKI a CKD [201]. ΔѰm byla zkoumána s barvivem TMRM a produkce superoxidových radikálových aniontů s barvivem MitoSOX. Nejprve jsme tyto testy ověřili ošetřením buněk FCCP a CCCP jako negativní kontroly pro TMRM a MitoSOX a Oligomycin a Antimycin A jako pozitivní kontroly pro TMRM a MitoSOX v lidské buněčné linii HKC{{7} }. V případě testu TMRM vyvolalo ošetření oligomycinem 3-násobné zvýšení průměru fluorescence TMRM ve srovnání s kontrolním barvivem, zatímco ošetření FCCP vedlo k 9-násobnému snížení. Antimycin A a CCCP produkovaly 35-násobné zvýšení a 2-násobné snížení v tomto pořadí v testu MitoSOX (doplňkový obrázek 3A a B). Aby bylo možné určit, zda účinky miR-150 a miR{14}} na mitochondriální metabolismus vyvolaly změny těchto parametrů, byly buňky HKC-8 transfekovány miR-150-5p nebo miR{{17} }p mimic nebo odpovídající miR-NC. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly ve fluorescenční kvantifikaci sond TMRM nebo MitoSOX mezi podmínkami léčby s vybranými miRs a miR-NC (doplňkový obrázek 3C).

Hladiny MiR-150 a miR-495 nejsou ve vzorcích plazmy a ledvin od pacientů s CKD ovlivněny. Hodnotili jsme expresi vybraných miRNA v biopsiích plazmy a ledvin od pacientů s CKD. Analýza biopsií ledvin od 26 pacientů (Hospital Ramn y Cajal) neprokázala korelaci mezi stupněm fibrózy a hladinami miR-150-5p a miR{4}}p (doplňkový obr. 4A a B) . U kohorty 100 pacientů s CKD (Hospital Príncipe de Asturias) byly také stanoveny cirkulující plazmatické hladiny miR-150-5p, miRNA s nejvyšší expresí v ledvinách. Kvůli omezení dostupnosti vzorků jsme nebyli schopni určit sérové ​​hodnoty miR- 495-3p v této kohortě. Tito pacienti byli dříve rozděleni do dvou podskupin na základě vývoje jejich funkce ledvin v průběhu 24 měsíců, takže 50 pacientů vykazovalo méně než 10% zhoršení funkce ledvin, zatímco u ostatních došlo k alespoň 40% snížení ledvin. funkce. Kvantifikace qRT-PCR plazmatických hladin miR-150-5p neukázala jasný trend k rozdílné expresi ve dvou podskupinách pacientů (doplňkový obr. 4C).

4. Diskuze

Objev miRNA jako klíčových regulátorů patofyziologických procesů podpořil výzkum jejich použití jako terapeutických činidel v téměř každém klinickém prostředí, včetně onemocnění ledvin [31]. Renální fibróza je vysoce převládajícím výsledkem chronického onemocnění ledvin (CKD) s nezávislostí na etiologii a její přítomnost je jasným prediktorem evoluce. Proto bylo značné úsilí věnováno identifikaci miRNA spojených s fibrózou ledvin [32,33]. V této studii jsme se zaměřili na stále důležitější roli metabolické poruchyledvinovépoškozenía identifikovali jsme dvě miRNA, miR-150 a miR-495, které byly dříve neznámými aktéry ve scéně. Navíc jsme zjistili, že mají hluboký účinek na buněčnou bioenergetiku tím, že synergizují s TGF- a modifikují klíčové metabolické cesty související skyselina oxidace.

Poranění epitelu koexistuje s defektem tukukyselinaoxidace, hlavní zdroj energie pro tubulární epiteliální buňky [5]. Vede k jejich dediferenciaci, která indukuje poškození tubulární funkce, spouští zástavu buněčného cyklu a podporuje uvolňování kritických profibrotických cytokinů, které mohou přispívat k aktivaci intersticiálních myofibroblastů [5,34]. Exprese MiR-150 a miR-495 byla u myši zvýšenafibrotickýledvinya dovnitřčlověk ledvinaepiteliálních buněk (HKC-8) po léčbě TGF-, což naznačuje jejich zapojení do profibrotické odpovědi. Zajímavé je, že in silico analýza genomových oblastí kódujících miR-150 a miR{4}} umožňuje identifikaci vazebných míst pro transkripční faktory související se signalizací TGF a dalšími cestami zapojenými do poškození UUO (hledání v genecards.org pro miR-150 a miR-495). Jak miR{8}}, tak miR-495 snížily hladinu exprese svých cílových genů CPT1A, PGC1 a TFAM, což se projevilo ve sníženém bazálním, na ATP spojeném a maximálním obsahu OCR a ATP po léčbě miR-150 a miR-495. Tento účinek byl doprovázen zesílenou profibrotickou odpovědí TGF v buňkách HKC-8. Zjistili jsme, že TGF-snižoval mitochondriální hmotu a mitochondriální DNA. Po léčbě miRNA-150 a miRNA-495 byl pozorován klesající trend v mitochondriálním obsahu v bazálních podmínkách, i když nedosáhl významnosti. To ukazuje na mechanismus nezávislý na úloze PGC1 nebo TFAM a nejpravděpodobněji související s metabolickým účinkem spojeným s downregulací CPT1A jako hlavní proměnnou ovlivněnou přítomností miRNA. Změny mitochondriální bioenergetiky jsou u onemocnění ledvin kritické [35]. V souladu s tím jsme nedávno ukázali, že CPT1A je kritickým enzymem pro zachování zdravého tubulárního kompartmentu, protože jeho nadměrná exprese chrání před fibrózou ledvin [6]. Nicméně PGC1

a TFAM geny také úzce souvisí s mitochondriální funkcí a biogenezí [36]. Porucha exprese těchto genů je spojena s CKD, zatímco její zachování přispívá k integritě ledvin, jak je ukázáno na několika modelech poškození. Han a kol. zjistili, že tubulární zesílení funkce PGC1 chránilo myši proti fibróze ledvin vyvolané Notch a zvrátilo mitochondriální dysfunkci spojenou s tímto modelem [37]. Podobně reexprese Tfam v buňkách tubulů zabránila Notch-indukovanému metabolickému a profibrotickému přeprogramování [38]. Je tedy možné, že snížená exprese mRNA těchto mitochondriálních genů, indukovaná miR-150 a miR-495, také přispívá k poškozenému epiteliálnímu fenotypu.

Pokles, který jsme pozorovali u OCR spojeného s poškozením epiteliálních buněk, je v souladu s předchozími zprávami, včetně našich studií s miR-33 a miR{1}} [15,16]. Zatímco Kang a kol. také uvedli, že oxidace glukózy byla nižší u lidských a myších modelů fibrózy ledvin [5], naše data ukazují, že snížení OCR zprostředkované mikroRNA nevyvolává samo o sobě variace v ECAR, což naznačuje, že glykolytické vypnutí u fibrotických stavů s největší pravděpodobností závisí na fibrotické podněty spíše než na narušenou oxidativní fosforylaci. Několik miRNA bylo identifikováno jako hlavní modifikátory mitochondriální funkce, včetně archetypální pro-fibrotické miRNA, miR-21 [39]. Potlačení exprese PPAR pomocí miR-21 bylo uplatňováno jako mechanismus, kterým tato miRNA uplatňuje svůj profibrotický účinek. Kromě inhibice FAO cílové geny pro miR-21 naznačovaly, že tato miRNA umlčuje širokou škálu mitochondriálních procesů. Mezi další příklady patří mir-9 [16], miR-33 [15] a miR{17}}e [40,41]. Nicméně, pokud je nám známo, existuje jen málo zpráv, které se zabývají regulací mikroRNA genů CPT1A, PGC1 a TFAM v souvislosti s fibrózou ledvin. Je zajímavé, že mikroRNA-214, která podporuje přechod z epitelu na mezenchym (EMT) během renální fibrózy, přímo cílí na TFAM v buňkách rakoviny tlustého střeva [42]. Tato represe byla také hlášena pro miR-590-3p [43]. Rodina miR-29, jeden z nejlépe charakterizovaných regulátorů produkce ECM při orgánové fibróze, přímo cílí na PGC1 a zachovává srdeční homeostázu. Patologické umlčování miR-29 tedy vede k upregulaci PGC1, což vede k hlubokým změnám v mitochondriální biogenezi, které přispívají k onemocnění srdce [44]. Zatímco naše údaje jasně podporují roli miR-150 a miR-495 při fibróze ledvin, k potvrzení tohoto tvrzení by byly nutné další studie in vivo.

Abychom vyhodnotili integritu mitochondriálního elektronového transportního řetězce (ETC), zaměřili jsme se na dva rysy: ΔѰm a produkci superoxidových radikálových aniontů. Zjistili jsme, že miR-150 a miR-495 tyto parametry nezměnily. Stabilní ΔѰm je vyžadována pro životaschopnost buněk a její velikost se u různých typů buněk liší [45]. Jeho udržování je přísně vyladěno, protože zvýšení ΔѰm může vést k poruchám v redoxním stavu, zatímco jeho snížení způsobuje snížení produkce ATP a může spustit apoptózu. V naší studii byly změny v ΔѰm kvantifikovány pomocí kationtového fluorescenčního barviva TMRM, zatímco produkce mitochondriálních superoxidových radikálových aniontů byla měřena pomocí fluorogenního barviva MitoSOX Red. Použití těchto nástrojů u stavů ovlivňujících funkci ledvin není v literatuře nápadné. Nicméně, tváří v tvář absenci změn v naší studii, jsme se nezabývali hloubkovými dalšími strategiemi pro hodnocení redoxní hormeze, a proto nemůžeme vyloučit, že tyto miRNA mohou změnit nukleofilní tón nebo funkci několika složek. ETC.

V klinickém prostředí byla miR-150 navržena jako profibrotická miRNA u lupusové nefritidy tím, že moduluje signalizaci TGF [46,47], zatímco miR-495 byla spojována s protektivní rolí u diabetických srdečních onemocnění fibróza [48]. Abychom zjistili jejich potenciální zapojení do CKD, hodnotili jsme jejich sérové ​​a parenchymální hladiny u dvou různých kohort pacientů. Sérové ​​hladiny miRNA byly navrženy jako potenciální biomarkery progrese CKD [49,50]. Hladiny miR-21 v séru a hojnost miR{10}}c v exozomech moči tedy korelují s fibrózou ledvin, což naznačuje jejich potenciální roli jako biomarkerů [51, 52]. Hladiny miR-150 a miR{14}} se však nelišily ani ve vzorcích plazmy ani ve vzorcích ledvin od pacientů s CKD. Rozdílné vzorce exprese mikroRNA mezi druhy a typy buněk mohou vysvětlit tuto absenci rozdílů v hladinách miR-150 a miR-495 ve fibrotické tkáni [53]. Zatímco v některých případech by udávané hladiny mikroRNA v plazmě mohly odrážet hladiny v ledvinové tkáni, měly by být zváženy i další mechanismy související se sekrecí miRNA do oběhového systému nebo protiváhou této sekrece jinými orgány [13,54].

Celkově naše výsledky podporují propagaci miR-150 a miR-495ledvinovéepiteliálníbuňkadediferenciace nejpravděpodobněji prostřednictvím energetické deprivace, zprostředkované represí genů souvisejících s mitochondriální funkcí CPT1A, PGC1 a TFAM. Poskytují také základ pro plnění své role in vivo, stejně jako jejich potenciální užitečnost jako diagnostické nebo prognostické biomarkery.

Autorské příspěvky

SL koncipoval a řídil výzkum. VM navrhl, provedl a analyzoval většinu experimentů. RR asistovala s analýzou pole microRNA. DRP a LGB provedly studie u dvou různých kohort pacientů s CKD. Všichni autoři pomohli s diskusí o výsledcích a SL a VM napsali rukopis.

Prohlášení o konkurenčním zájmu

Autoři nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty španělského ministerstva vědy SAF2015-66107-R a PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) spolufinancované Evropskou Fond regionálního rozvoje, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 a RD16/ 0009/0016 (SL a DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL a DRP), grant od Španělské nefrologické společnosti (Fundacin Senefro 2017) pro SL a FundacionRenální"Iigo Alvarez de Toledo" (SL), všichni ze Španělska. CBMSO dostává institucionální podporu od Fundacion „Ramn Areces“. VM byl podpořen předdoktorským stipendiem programu FPI (BES- 2013-065986) od španělského ministerstva vědy.