AbstraktníAčkoli je stárnutí největším rizikovým faktorem pro lidská chronická (rakovina, diabetická, kardiovaskulární a neurodegenerativní) onemocnění, je známo jen málo intervencí kromě kalorické restrikce a malého počtu léků (s podstatnými vedlejšími účinky), které přímo řeší stárnutí. Existuje tedy naléhavá potřeba nových možností, které mohou obecně oddálit procesy stárnutí a zabránit nemocem souvisejícím s věkem. Buněčné stárnutí je základem procesů stárnutí. Chronologická životnost (CLS) kvasinek Saccharomyces cerevisiae je dobře zavedený modelový systém pro zkoumání intervencí lidského postmitotického buněčného stárnutí. CLS je definován jako počet dní, po které buňky zůstávají životaschopné ve stacionární fázi. Vyvinuli jsme novou, levnou a rychlou kvantitativní metodu pro měření CLS v buněčných kulturách inkubovaných společně s různými chemickými činidly a kontrolami na 96-jamkových destičkách. Náš protokol PICLS s (1) použitím propidium jodidu pro fluorescenční čtení přežití buněk ve čtečce mikrotitračních destiček a (2) měřením celkového počtu buněk prostřednictvím absorpce OD600nm ze stejné destičky poskytuje skutečně vysokou kapacitu. V závislosti na logistice lze paralelně zpracovávat velké množství desek, takže prosévání tisíců sloučenin je možné v krátké době. Metoda byla ověřena měřením účinku rapamycinu a omezení kalorií na kvasinkový CLS. Tento přístup jsme použili pro screening chemických látek. Objevili jsme anti-aging/neuroprotektivní potenciál 2,5-anhydro-D-mannitolu (2,5-AM) a navrhli jsme jeho použití samostatně nebo v kombinaci s jinými intervencemi proti stárnutí.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý reparační účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Kliknutím zobrazíte produkty proti stárnutí

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slovaSaccharomyces cerevisiae · Chronologická životnost · Chemický screening · Sloučenina proti stárnutí · 2,5-anhydro-D-mannitol

Úvod

The growing fraction of the elderly (>65 let) mezi celkovou populací (od ~ 10 procent na celém světě (více než 20 procent v zemích prvního světa) v roce 2020 na extrapolovaných 16 procent v roce 2050), stejně jako jejich rostoucí střední délka života (o ~ 10 let od roku 1960 v zemích prvního světa ), konfrontuje svět se stále obtížnějšími problémy [1, 2]. Kromě obecného omezení životní aktivity zůstává stárnutí největším rizikovým faktorem pro rozvoj chronických onemocnění, které následně ohrožují nezávislý lidský život a nakonec vedou ke smrti [3–7]. Současné lékařské přístupy k prevenci patologií souvisejících s věkem jsou doporučeními pro zdravý životní styl, včetně cvičení a diety. Tyto intervence však samy o sobě nestačí k prevenci vzniku nemocí souvisejících s věkem.

Stárnutí je charakterizováno progresivní ztrátou fyziologické integrity, účinnosti buněčných funkcí a metabolické signalizace [8]. Stále větší úsilí je zaměřeno na pochopení procesů buněčného stárnutí, které ovlivňují vysoce propojenou a funkčně redundantní síť interakcí genů a proteinů [8, 9]. Navzdory složitosti stárnutí nedávný výzkum na různých modelových systémech, včetně savců, ukázal, že oddálení stárnutí a prodloužení zdravotního stavu jsou proveditelné intervencemi proti stárnutí, jako je aplikace léků s rapamycinem a omezení kalorií (glukózy) [10–15]. Rozšíření repertoáru sloučenin proti stárnutí, které lze využít jako geroprotektivní terapeutika a snížení jejich nežádoucích vedlejších účinků, je proto jednou ze slibných strategií, které mohou oddálit stárnutí a prodloužit délku zdraví.

Nedávný výzkum ukázal, že molekulární mechanismy pozorované při stárnutí člověka jsou zachovány v různých organismech, včetně jednobuněčných kvasinek [8, 10, 16, 17]. Pučící kvasinka Saccharomyces cerevisiae je jedním z nejvíce studovaných modelových organismů pro odhalování biologických procesů podílejících se na stárnutí buněk. Mezi výhody studia stárnutí v kvasinkách patří krátká generační doba, ovladatelná životnost a její přístupnost k vysoce výkonným testům. Proto se tento organismus stal mocným nástrojem pro identifikaci intervencí proti stárnutí. Kvasinky se běžně používají ke studiu stárnutí dvěma odlišnými způsoby: replikativní životnost (RLS) a chronologická životnost (CLS) [18]. RLS měří, kolikrát se jednotlivá buňka dělí, což je model stárnutí pro mitotické buňky, jako jsou kmenové buňky. CLS měří dobu, po kterou nedělící se buňka zůstává životaschopná ve stacionární fázi, což je model stárnutí pro postmitotické buňky, jako jsou neurony. Životaschopnost stárnoucích buněk kvasinek za podmínek stacionární fáze zbavené živin se snižuje a nakonec odumírají.

CLS se tradičně měří pomocí odhadu počtu jednotek tvořících kolonie (CFU) na agarové plotně [18]. Buňky kvasinek v baňce s celkovým médiem (Větším nebo rovným 20 ml) jsou vystaveny jediné chemické sloučenině. V různých časových bodech (např. po 2, 5 a 8 dnech) jsou malé alikvoty kultury chronologického stárnutí z fasku sériově zředěny, umístěny na plotny s živným agarem a inkubovány po dobu 2–3 dnů pro tvorbu a počítání kolonií. Frakce přežití se určuje z CFU pro každý chronologický věkový bod ve vztahu ke dni 1 (považováno za 100% přežití buněk). Přístup CFU je kvantitativní, ale je spojen s mnoha nevýhodami. Pro objevení se kolonií vyžaduje vícenásobná sériová ředění, kroky nanesení na plotny a inkubační doby. Počítání kolonií se provádí buď ručními nebo drahými přístroji. Navíc je tato metoda nevhodná a příliš drahá pro vysoce výkonný screening (HTS) tisíců sloučenin, protože vyžaduje značné množství testovaných léčiv, velkoobjemové kultury v baňkách a mnoho agarových ploten. Bohužel metoda CFU a všechny nedávné varianty pro měření CLS jsou kriticky závislé na schopnosti postmitotických buněk znovu vstoupit do mitotické fáze. Tato metodika v zásadě nedokáže odlišit kvasinky v mitotické zástavě od mrtvých buněk.

Současné technické pokroky v metodách odvozených od CFU měří přežití a růst buněk na základě růstu kvasinek ve stacionární fázi vystavených lékům v kultuře bohaté na živiny buď v kapalném médiu, nebo tečkováním na agarové plotně [17, 19–21]. . Po 24 hodinách se růst zestárlých buněk v kapalném médiu měří absorbancí při OD600 nm, zatímco v testu nanášení skvrn je růst tečkované zestárlé kultury na agarovém médiu vizuálně identifikován po 48 hodinách. Logistické vylepšení zahrnuje použití 96-jamkových destiček, které umožňují omezený skrínink chemických nebo genomových delečních kmenů. U spojených kmenů s delecí kvasinek je ke kvantifikaci životaschopnosti jednotlivých kmenů nutná průtoková cytometrie [22].

Propidium jodid (PI) je fluorescenční barvivo, které vstupuje pouze do mrtvých buněk, a je tedy silným markerem pro přímou kvantifikaci buněčné životaschopnosti [23–25]. Dříve studie využívaly přístup založený na PI pro měření CLS a kvantifikaci viability buněk analýzou snímků získaných fluorescenčním buněčným počítačem, UV transiluminátorem nebo průtokovou cytometrií [26, 27]. Požadavky na zpracování více vzorků, zobrazování a software pro analýzu dat jsou však drahé a časově náročné, což brání těmto metodám ve skutečných vysoce výkonných aplikacích. Zavedení alternativních barviv, jako je zelená SYTOX, má omezenou hodnotu ve vysoce výkonném prostředí kvůli neúměrným nákladům [26].

Proto jsou zapotřebí nové metody pro kvantifikaci životaschopnosti staré buňky, aby se předešlo omezením spojeným se stávajícími metodikami. V této práci popisujeme PICLS, metodu měření CLS založenou na PI, která je nezávislá na růstu. Náš nový přístup se opírá o inkubaci kvasinkových buněk s různými testovanými sloučeninami nebo odlišnými podmínkami testovacího média v 96-jamkových destičkách. PI používáme ke kvantifikaci přežití buněk. Rychlý a účinný odečet (do ~15 minut) zajišťuje čtečka mikrodestiček, levné zařízení snadno dostupné ve většině laboratoří. Tato levná metodika se dobře hodí pro plošný screening chemických činidel k identifikaci sloučenin proti stárnutí, protože mnoho různých sloučenin, kontrol nebo ředění lze pohodlně umístit na jednu desku a paralelně lze zpracovávat velké množství desek. Dále jsme ověřili naši metodu stanovením rozšíření CLS kvasinek pomocí známých intervencí proti stárnutí, jako je podávání rapamycinu a omezení kalorií. Rychlá kontrola dostupných chemikálií v naší laboratoři nečekaně odhalila 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM), který prodlužuje životnost kvasinek. Potvrdili jsme také antiagingovou aktivitu 2,{15}}AM pomocí tradičních metod růstu. Jiné testované analogy cukru nepřinesly žádný podobný účinek.

Výsledek

Vývoj metody pro kvantifikaci viability buněk pomocí měření fluorescence propidium jodidu ve čtečce mikrotitračních destiček

Náš nový protokol začíná vystavením buněk kvasinek divokého typu nebo jejich mutantů umístěných do média bohatého na živiny v 96-jamkových destičkách spolu se specifickou koncentrací požadovaných chemických sloučenin. Používáme PI jako marker buněčné smrti, protože toto fluorescenční barvivo vstupuje pouze do buněk, které nepřežívají [23–25]. Životaschopnost buněk v kultuře ve stacionární fázi je kvantifikována po specifikovaném počtu dnů odečtením PI fluorescence ve čtečce mikrodestiček, která zase poskytuje elektronicky čitelnou tabulku pro analýzu dat.

Jako první ověření ukazujeme, že práce s malými množstvími v jamkách mikrodestičky poskytuje výsledky podobné přístupům založeným na kyvetách a že čtečka mikrodestiček je dostatečně citlivá na zachycení údajů o přežití buněk. Proto jsme analyzovali PI barvení kvasinkových buněk. Buňky kvasinek byly pěstovány ve skleněné baňce a vařeny po dobu 15 minut při 10}0 stupni. Živé a mrtvé buňky byly promyty a inkubovány v 1 x PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátem) bez a s PI (5 ug/ml) po dobu 15 minut. Po inkubaci byly buňky promyty a resuspendovány v PBS. Buňky byly vizualizovány mikroskopií a intenzita fluorescence byla měřena čtečkou mikrodestiček (doplňkový obrázek S1). Po potvrzení, že PI je vhodný marker pro buněčnou smrt, byla provedena následná analýza pro vývoj metody. Mrtvé buňky obarvené PI byly resuspendovány v PBS na konečných 48 OD600nm měřených v kyvetě za použití spektrofotometru. Dále byly buňky sériově naředěny v PBS (OD600nm 48 až 0,05) a přeneseny na černou 96-jamkovou destičku (costar 3603). Je třeba poznamenat, že černé mikrodestičky jsou čtyřikrát dražší než čiré a hůře dostupné, ale použili jsme je, protože jsou vhodnější pro fluorescenční čtení kvůli tlumení autofluorescence pocházející ze vzorků a povrchů mikrodestičky. Pomocí zobrazovacího systému GelDoc (obr. 1A) jsme vizualizovali stupeň začlenění PI barvení do mrtvých kvasinkových buněk při různých ředěních. Pomocí stejné destičky jsme měřili intenzitu PI fluorescence čtečkou mikrodestiček při excitaci 535 nm a emisi 617 nm. Zjistili jsme vysokou lineární korelaci mezi intenzitou PI fluorescence a buněčnou absorbancí při OD600nm (obr. 1B). Tento výsledek ukazuje, že naše varianta metody založené na fluorescenci PI je účinná pro kvantifikaci životaschopnosti buněk.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 kyvety (obr. 1D). Dále jsme určili vztah mezi intenzitou PI fluorescence a OD600nm buněk 96-jamkové destičky v optimálním rozsahu OD600nm 0,05–12. Pozorujeme téměř dokonalou lineární korelaci (obr. 1E). Náš protokol tedy představuje robustní metodu pro kvantifikaci životaschopnosti buněk.

Vliv typů mikrodestiček na kvantifikaci viability buněk pomocí měření fluorescence propidium jodidu ve čtečce mikrodestiček

Vliv rapamycinu na chronologickou životnost kvasinek

Rapamycin je jednou z dobře známých intervencí proti stárnutí, u kterých bylo prokázáno, že prodlužují životnost několika modelových organismů, včetně kvasinek, háďátek, ovocných mušek a myší [10, 14, 15, 28–30]. Inhibuje komplex TORC1 citlivý na živiny (cíl komplexu rapamycinu 1). TORC1 je konzervovaný vícepodjednotkový proteinový komplex v eukaryotických buňkách, který spojuje živiny v prostředí s buněčným růstem a proliferací [19, 29, 31–34].

Zkoumali jsme účinek rapamycinu na chronologickou životnost (CLS) kvasinkového kmene, abychom ověřili náš nově vyvinutý protokol. Zde a níže jsme v našich experimentech použili prototrofní kvasinkový kmen (CEN.PK{0}}D), abychom se vyhnuli silným účinkům auxotrofie aminokyselin na přežití buněk v kultuře ve stacionární fázi [35, 36]. Buňky byly stárnuty s různými koncentracemi rapamycinu v syntetickém definovaném (SD) médiu. Růst buněk byl měřen v různých časových bodech (24 h, 48 h a 72 h). Zjistili jsme, že buněčný růst dosáhl saturace přibližně 24 hodin po inkubaci s 5 nM nebo méně rapamycinem (obr. 4A). Podání 10 nM rapamycinu však zpomalilo buněčný růst a saturace bylo dosaženo až po 48 hodinách (obr. 4A). Dříve byl podobný trend pozorován u buněk rostoucích s rapamycinem v experimentu CLS [37].

Jako další krok bylo měřeno CLS buněk pěstovaných v různých koncentracích rapamycinu. Stanovili jsme přežití buněk pomocí fluorescence PI v různých časových bodech chronologického věku. Časový bod růstu 72 h byl považován za den 1. Z grafu přežití můžeme odvodit, že různé koncentrace přídavku rapamycinu prodlužují CLS kvasinek (obr. 4B). Přežití stárnoucích buněk doplněných rapamycinem (5 nM a 10 nM) v den 4 bylo ~75 procent; avšak bez rapamycinu bylo ~ 50 procent. V den 7 bylo přežití starých buněk doplněných rapamycinem 70 procent; avšak bez rapamycinu byla snížena na méně než 20 procent. Rozšíření CLS stárnoucích buněk lze také pozorovat při nižších koncentracích (0,62–2,5 nM) rapamycinu (obr. 4B).

Náš protokol jsme ověřili přímým porovnáním se dvěma tradičními přístupy k růstu, které měří CLS kvasinek. Nejprve jsme provedli test růstu v kapalném médiu, abychom změřili účinek rapamycinu na délku života. Přežití chronologicky stárnoucích buněk bylo monitorováno v různých věkových bodech přenesením 3-µl kultury do 200µL média YPD v čerstvé 96-jamkové destičce. Růst odpovídá počtu životaschopných buněk v inokulu (obr. 4C). Růst starých buněk registrovaný prostřednictvím absorbance OD600nm byl stanoven pomocí čtečky mikrodestiček. Frakce přežití byla vypočtena z absorbance růstu OD600nm pro každý věkový bod ve vztahu ke dni 1 (považováno za 100% přežití buněk). Graf přežití je znázorněn na obr. 4D.

Podobně jsme provedli vyrůstání tečkováním na agarovém médiu. Na agarové plotně YPD jsme spatřili 3-µl stárnoucí kultury a inkubovali jsme ji po dobu 48 hodin. Růst starých buněk na agarové plotně YPD byl vizualizován zobrazovacím systémem GelDoc (obr. 4E). Jak se očekávalo, můžeme pozorovat trendy prodlužování životnosti rapamycinem jak při testech YPD na kapalině, tak na agaru, které jsou paralelní s těmi, které byly stanoveny s naším novým protokolem.

Tyto výsledky ukazují, že náš protokol HTS reprodukuje, že rapamycin prodlužuje životnost buněk. Dále posuzujeme Z-faktor pro hodnocení kvality této metody [38]. Obecně platí, že Z-faktory v rozsahu 0,5–1.0 jsou ukazatelem vynikajících testů HTS. Z-faktor byl stanoven pro různé koncentrace rapamycinu s PI fluorescencí stárnutých buněk (doplňkový obrázek S2). Naše financování, Z-faktor {{10}},70 pro 5 nM rapamycin a 0,74 pro 10 nM rapamycin řadí tuto metodu HTS do kategorie vysoké kvality. Náš protokol je tedy dostatečně robustní, aby identifikoval potenciální sloučeniny proti stárnutí.

Abychom prozkoumali, zda je metoda účinná v odlišném genetickém pozadí kvasinek, testovali jsme účinek rapamycinu na CLS kmene BY4743. Kmen Saccharomyces cerevisiae BY4743 je auxotrofní pro histidin, leucin a uracil. Kmen BY4743 byl pěstován v různých koncentracích rapamycinu v SD médiu doplněném auxotrofními složkami. Přežití stárnoucích buněk bylo kvantifikováno pomocí fluorescence PI (doplňkový obrázek S3). Zjistili jsme, že rapamycin kvantitativně zvyšuje životaschopnost buněk BY4743 podobným způsobem jako CEN.PK113-7D. Tyto výsledky tedy ukazují, že naše metoda je účinná u různých kmenů kvasinek.

Vliv glukózy na chronologickou životnost kvasinek

Také jsme ověřili naši metodu zkoumáním vlivu omezení kalorií na chronologickou životnost kvasinek. Omezení kalorií je jednou ze zavedených intervencí k oddálení stárnutí a prodloužení délky života napříč modelovým organismem, včetně buněk kvasinek a savců [11, 13, 16]. Abychom určili vliv omezení kalorií na CLS kvasinek, snížíme obsah glukózy v kultivačním médiu. Buňku jsme pěstovali ve třech různých podmínkách SD média obsahujícího 0,25 procenta, 0,5 procenta a 2 procenta glukózy. Měřili jsme buněčný růst v různých časových bodech (24 h, 48 h a 72 h). Všechny kultury dosáhly saturace růstu po 24 hodinách (obr. 5A). Růst buněk byl nižší při 0,25 procenta a 0,5 procenta ve srovnání s 2 procenty glukózy (obr. 5A). Měřili jsme přežití chronologického stárnutí u buněk pěstovaných při různých koncentracích glukózy pomocí PI fluorescenční metody (obr. 5B). Z grafu přežití usuzujeme, že omezení glukózy prodlužuje CLS kvasinek. Souběžně jsme také potvrdili rozšíření CLS pomocí testů růstu (obr. 5C, D a E), což dále potvrdilo naši novou metodu pro stanovení CLS kvasinek. Vliv restrikce glukózy na prodloužení CLS kmene BY4743 byl také ukázán metodou PICLS (doplňkový obrázek S3). Náš přístup k měření CLS kvasinek tedy představuje novou, rychlou a nízkonákladovou metodu pro screening chemických činidel a kultivačních podmínek pro identifikaci zásahů proti stárnutí.

Screening chemických látek pomocí nově vyvinuté metody identifikoval 2,5-bezvodý-D-mannitol jako novou sloučeninu proti stárnutí

Po vyvinutí a validaci nového protokolu jsme tuto metodu použili ke screeningu stovek chemických látek pro identifikaci sloučenin proti stárnutí (doplňkový obrázek S4 a doplňková tabulka 1). Jako jeden z překvapivých výsledků jsme zjistili, že sloučenina 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) prodlužuje CLS kvasinek. Na obr. 6 uvádíme výsledek podrobných následných experimentů pro tuto sloučeninu. Testovali jsme aktivitu proti stárnutí 2,5-AM při různých koncentracích na 96-jamkové destičce. Nejprve jsme určili účinek 2,{15}}AM na růst buněk. Kvasinkové buňky byly inkubovány s různými koncentracemi 2,5-AM v SD médiu. Růst buněk byl měřen v různých časových bodech (24 h, 48 h a 72 h). Zjistili jsme, že buněčný růst dosáhl stejné úrovně nasycení po 24 hodinách pro všechny testované koncentrace 2,5-AM (obr. 6A). Poté jsme měřili přežití chronologicky starých buněk doplněných o různé koncentrace 2,5-AM pomocí fluorescenční metody PI. Stejně jako dříve byla 72h růstová kultura považována za den 1 pro analýzu CLS. Graf přežití je vykreslen pro různé časové body chronologického věku (obr. 6B). Zjistili jsme, že 2,5-AM rozšiřuje CLS způsobem závislým na koncentraci. Přežití starých buněk doplněných 2,5-AM (8 mM) v den 4 bylo ~ 80 procent; avšak bez 25- AM bylo ~ 50 procent . V den 7 bylo přežití 25-AM doplněných starých buněk ~ 75 procent; bez 2 se však5-AM snížila na méně než 20 procent . Aktivita proti stárnutí 2,5-AM byla také ověřena testy růstu (obr. 6C, D a E).

2,5-AM je molekula cukru, která může vstoupit do dráhy glykolýzy. Hydrolyzuje se pouze v glykolytických krocích, které způsobují akumulaci nemetabolizovaného 2,5-AM-1,6-bisfosfátu (2,5-AMBP) v buňkách [39–41 ]. Abychom otestovali, zda 2,{11}}AM v koncentracích podobných experimentu CLS byl zpracován enzymy glykolýzy, zkoumali jsme rostoucí citlivost kmene s delecí genu SNF1. SNF1 je senzor buněčné energie a vysoce konzervovaná AMP-aktivovaná proteinkináza (AMPK) u eukaryot [42, 43]. Kvasinkové buňky, které postrádají aktivitu AMPK, jsou spojeny s hypersenzitivním růstovým fenotypem v přítomnosti nemetabolizovaných glykolytických meziproduktů [44]. Měřili jsme růst delečního kmene snf1Δ s různými koncentracemi 2,5-AM. Zjistili jsme, že 2,5-AM inhibuje růst delečního kmene snf1Δ ve srovnání s kmenem divokého typu (doplňkový obrázek S5). Tento pozorovaný růstový fenotyp ukazuje, že 2,{28}}AM podléhá glykolýze a hydrolyzuje se na nemetabolizované glykolytické meziprodukty.

2,5-AM je analogem cukerné skupiny fruktózy [39]. Abychom objasnili, zda i jiné cukry ovlivňují CLS, zkoumali jsme vliv fruktózy, mannitolu a maltózy na stárnutí kvasinek. Zahrnuli jsme také sorbitol, což je nemetabolizovaný cukr, o kterém se uvádí, že zvyšuje CLS kvasinkových buněk zvýšením osmolarity kultivačního média [20, 45]. Nejprve jsme testovali účinek fruktózy, mannitolu, maltózy a sorbitolu na buněčný růst. Kvasinkové buňky byly inkubovány s různými koncentracemi fruktózy, mannitolu, maltózy a sorbitolu podobnými 2,5-AM v SD médiu. Stejně jako 2,5-AM, buňky inkubované s fruktózou, mannitolem, maltózou a sorbitolem dosáhly saturace růstu po 24 hodinách (obr. 7A). Dále jsme měřili přežití chronologicky stárnutých buněk 1., 7., 14. a 21. den. Na rozdíl od 2.5- dopolední suplementace fruktózou, mannitolem, maltózou a sorbitolem neprodloužila životnost kvasinky (obr. 7B, C, D, E a doplňkový obr. S6). Je pozoruhodné, že 2,{21}}AM prodlužuje životnost i v pozdní fázi chronologického stárnutí. Stárnuté buňky doplněné 2,5-AM (8 mM) přežily (~65 procent) 21. den. Nicméně přežití starých buněk bez suplementace 25-AM bylo méně než 10 procent.

K našemu překvapení jsme zjistili, že sorbitol v nízkých testovaných koncentracích není schopen zvýšit CLS (obr. 7B, C, D, E a doplňkový obr. S6). Předpokládali jsme, že ke zvýšení CLS mohou být nutné vyšší koncentrace sorbitolu. Testovali jsme řadu vyšších koncentrací včetně 1 M sorbitolu, což je koncentrace dříve uváděná jako ovlivňující CLS (18 procent ekvivalentní 1 M) [20, 45]. V souladu s předchozími zprávami také zjišťujeme, že velmi vysoké koncentrace sorbitolu (mezi 0,5 a 1 M) zvyšují CLS kvasinek (doplňkový obr. S7), zřejmě zvýšením osmolarity média. Je zajímavé, že zvýšení CLS o 2,{12}}AM při velmi nízké koncentraci (2 mM) naznačuje, že mechanismus antiagingové aktivity je odlišný od osmotického. Tyto výsledky naznačují, že anti-aging aktivita 2,5-AM je specifická pro tuto cukernou sloučeninu a nebyla pozorována u několika dalších, podobně strukturovaných chemikálií.

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】