Cesta k pokroku Preklinické studie věkem podmíněných neurodegenerativních onemocnění: Pohled na hlodavce a modely odvozené od HiPSC, část 2

Kromě transgenních modelů vyvinutých jednotlivými akademickými laboratořemi vede National Institutes of Health (NIH) v současné době projekt Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD) Target Discovery and Preclinical Validation Project, což je konsorcium multiinstitucionálních a multidisciplinárních grantů. které společně zamýšlejí urychlit kanály pro objevování drog pro AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

S rychlým rozvojem biotechnologie se transgenní technologie postupně uplatňují v biologické oblasti. Transgenní technologie je technologie genetického inženýrství, která zavádí cizí geny do organismů, aby vykazovaly specifické vlastnosti. Existuje však spor o vztah mezi transgenními modely a pamětí.

Někteří vědci se domnívají, že transgenní modely mohou mít pozitivní vliv na paměť. Některé pokusy s transgenními zvířaty například ukázaly, že změnou určitých genů lze zlepšit schopnost zvířat učit se a paměť. Tyto experimentální výsledky ukazují, že transgenní technologie může potenciálně zlepšit lidské kognitivní schopnosti.

Přestože jsou tyto výsledky výzkumu velmi zajímavé, musíme být také opatrní, protože výsledky po těchto experimentálních procesech nejsou výsledkem lidské povýšení nebo unáhlené aplikace. Musíme provést další výzkum této technologie, abychom pochopili její potenciální rizika pro životní prostředí a lidi a změřili její možný sociální dopad. Zároveň musíme také přiznat, že zlepšení paměti nezávisí pouze na genech, ale také na fyzickém zdraví a zdravými životními návyky lze dosáhnout dobrého stavu paměti normálními kanály.

Zkrátka bychom se měli těšit na pozitivní aspekty transgenní technologie a správně ji regulovat a vyhodnocovat. Prostřednictvím racionálního využití transgenní technologie můžeme změnit náš genom, což nám pomůže vyřešit některé lékařské a environmentální problémy a zároveň podpoří lidský pokrok v mnoha oblastech, včetně zlepšení paměti. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože má antioxidační, protizánětlivé a anti-aging účinky, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví nervový systém. Kromě toho může Cistanche také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, schopnost učení a rychlost myšlení a mohou také zabránit výskytu kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit funkci mozku

Pro tento přehled je zvláště důležitá část AMP-AD, nazvaná iniciativa Model Organism Development and Evaluation for LOAD (MODEL-AD). MODEL-AD si klade za cíl vytvořit nové transgenní myší linie, které přesně modelují fenotypy AD a slouží jako vylepšená platforma pro vývoj léčiv a více přeložitelné a biologicky relevantní modely pro předklinickou validaci DMT.

Iniciativa MODEL-AD se skládá z Centra na lékařské fakultě Indiana University, The Jackson Laboratory, Sage Bionetworks, University of Pittsburgh School of Medicine a centra na University of California Irvine.

Toto konsorcium má v úmyslu společně vytvořit další generaci in vivo modelů AD založených na lidských datech přísným a vysoce kontrolovaným způsobem. Cílem je přitom sladit patofyziologické rysy ADmodelů s odpovídajícími stádii klinického onemocnění pomocí translatovatelných biomarkerů jako prostředku ke zvýšení translatability preklinických nálezů.57

K dnešnímu dni bylo vygenerováno 54 modelů myší AD, včetně myší fAD, APOE, APP, MAPT/tau a také LOADmodelů založených na akumulaci Ab a dalších dříve identifikovaných variantách souvisejících s LOAD (https://www.model-ad.org /strain-table/), které jsou dostupné prostřednictvím JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Chemicko-toxinové modely AD

Kromě novějších transgenních modelů byly modely AD hlodavců historicky založeny na expozici toxickým sloučeninám, které způsobují selektivní neurodegeneraci vedoucí ke kognitivním a behaviorálním poruchám podobným těm, které byly pozorovány u pacientů s AD.

Zatímco při studiu AD i PD byly použity různé modely expozice toxinům, modely AD byly z velké části nahrazeny novějšími transgenními modely diskutovanými výše.

Chemicky založené modely AD indukují patologii podobnou AD pomocí buď sloučenin, které selektivně a reverzibilně narušují aktivitu cholinergních neuronů, nebo toxinů, které trvale narušují procesy buněčné homeostázy vedoucí k buněčné smrti, jako je kyselina okadaová a různé třídy těžkých kovů 58 (tabulka 2). Ačkoli tyto modely produkují určité neurologické a behaviorální deficity, které se podobají symptomům AD, včetně zhoršeného učení a paměti, do značné míry jim chybí patologické léze AD (tj. Ab plaky a NFT).

Zvířecí modely, které se výslovně zaměřují na narušení cholinergních neuronů, jsou založeny na nyní poněkud zastaralé cholinergní hypotéze AD.59 V takových modelech jsou antagonisté muskarinových receptorů, například sloučenina skopolamin, dodáváni do cílových oblastí mozku, jako je HP, aby blokovali endogenní aktivitu acetylcholinu a navozují kognitivní poruchy učení a paměti.60

Jiné modely chemické intervence AD ​​zahrnují lokální nebo periferní podávání neurotoxinů vedoucí k nespecifické smrti neuronových buněk61–64 (tabulka 2).

Transgenní modely PD

Stejně jako v případě AD, transgenní myší modely PD umožňují studium klinických rysů onemocnění vyvolaných manipulací genetických lokusů spojených s mendelovskými formami onemocnění a stovky jedinečných linií jsou nyní komerčně dostupné ke koupi.

Stejně jako AD je většina klinických případů PD klasifikována jako sporadická, přičemž dědičné formy onemocnění představují méně než 1 % všech případů.89 Genetické změny v genech SNCA, LRRK2 a UCH-L1 jsou spojeny s autozomálně dominantními formami PD, zatímco alternace v genech PRKN, PINK1 a DJ-1 jsou spojeny s autozomálně-recesivními formami90 (tabulka 1).

Dva geny nejčastěji zacílené na transgenní modely PD jsou SNCA a LRRK2.91,92 Mutace v těchto genech způsobují familiární PD a byly také spojeny se sporadickou formou PD prostřednictvím GWAS.93

Kromě toho byla dobře prokázána role nadměrné exprese SNCA u familiární (tri/duplikační případy) a sporadické PD.94

K dnešnímu dni většina transgenních modelů manipulujících se SNCA nejen zavádí familiární missense mutace, ale také využívá strategii nadměrné exprese vložením více kopií lidského nebo myšího genu SNCA k napodobení zvýšené produkce a-synukleinu (a-syn), buď samostatně nebo v kombinaci s familiární missense mutace.95–97

Missense mutace v LRRK2 je nejčastěji uváděnou mutací spojenou s familiární PD98 a na základě různých známých mutací LRRK2 bylo vytvořeno několik transgenních myších linií.

Mutace GS2019S například vede k mutaci zesílení funkce se zvýšenou aktivitou kinázy.99 Jiné modely, jako jsou mutace R1441C/G, T1348N a A2016T, hlásí změny ina-syn exprese nebo agregace a v některých případech, nominální motorické deficity; přesné deficity a klinické rysy se však mezi modely podstatně liší.89,92,100

Kromě genů SNCA a LRRK2 bylo vytvořeno mnoho dalších transgenních linií, ve kterých jsou cíleny další geny spojené s PD (tabulka 1). Zatímco mnoho z těchto modelů úspěšně mění expresi a agregaci a-syn, většina z nich vykazuje malou až žádnou neurodegeneraci, a v důsledku toho zůstávají motorické funkce relativně nepoškozeny92 (tabulka 1).

Pečlivá analýza agregátů a-syn produkovaných v mnoha z těchto transgenních linií dále odhalila, že vytvořené inkluze nepřipomínají přirozeně se vyskytující Lewyho tělíska (LB) pozorovaná v posmrtných mozcích PD, ale místo toho vykazují unikátní strukturní složení.101

Selhání transgenních modelů reprodukovat jak molekulární, tak neurodegenerativní aspekty PD je pravděpodobně způsobeno kombinací několika faktorů. Hlavní z těchto obav je, že povaha a rozsah postižení familiárně spojených genů a běžnější sporadická forma onemocnění zůstávají nejasné, což zpochybňuje relevanci modelů založených na manipulaci s těmito geny pro velkou většinu případů PD.

Dalším omezením je, že transgenní modely mají za následek nadměrnou expresi transgenu, který nenapodobuje fyziologické hladiny, a tak mohou zavádět artefakty. Kromě toho sporadická forma onemocnění pravděpodobně zahrnuje změny v mnoha genech, přičemž náchylnost je dále ovlivněna složkami životního prostředí, což naznačuje, že monogenní transgenní modely mohou mít omezenou využitelnost.

Celkově lze říci, že mnoho stejných problémů, které trápí AD transgenní modely, platí pro modely PD: v současnosti chybí pochopení přesné role familiárně vázaných genů v etiologii PD a rozsahu, v jakém přispívají ke sporadickým formám onemocnění.

Tyto problémy mimořádně znesnadnily vytvoření atransgenního modelu PD, který věrně reprodukuje akumulaci a-syn a tvorbu LB, což vede k modelu neurodegenerace a poruch chování, které odpovídají těm, které byly pozorovány v klinických populacích.

Současné transgenní modely rekapitulují pouze některé z těchto vlastností a v důsledku toho se ukázalo, že mají malou prediktivní platnost pro hodnocení účinnosti potenciálních DMT. Na rozdíl od toho jsou chemicko-toxinové modely PD stále široce využívány kvůli jejich schopnosti věrně reprodukovat selektivní DA neurodegenerační charakteristiku PD.

Chemicko-toxinové modely PD

Během posledního půlstoletí byla k modelování vzoru neurodegenerace pozorované u PD použita široká škála toxických sloučenin. Z nich se čtyři modely chemického poškození ukázaly jako nejpoužívanější pro preklinický výzkum a jejich účinky byly rozsáhle charakterizovány.

Patří mezi ně 6-hydroxydopamin (6-OHDA), analog katecholaminu; 1-methyl-4-fenyl1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), syntetický analog opioidu;rotenon, pesticid; a paraquat, herbicid102 (tabulka 2). Další netransgenní PD model je založen na injekci preformovaných fibril (PFF; rekombinantní monomerní a-syn proteiny převedené na fibrilární agregátovou formu) do mozků zvířat, což spouští hyperfosforylaci endogenních a-syn proteinů a vyvolává patologii podobnou LB v SN. pars compacta (SNpc)87,88 (tabulka 2).

Tyto modely založené na toxinu mohou v různé míře indukovat a-syn agregaci a selektivní neurodegeneraci DA neuronů v nigrostriatální dráze, což je významný nedostatek jejich transgenních modelových protějšků.

Dráhy zapojené do spouštění buněčné smrti a rozsah ztráty DA neuronů se však mezi modely, které byly podrobně přezkoumány jinde, podstatně liší.103 Výsledkem ztráty buněk DA u PD je nakonec to, že motorická jádra striata již nelze udržet. normální fyziologické funkce, což způsobuje širokou škálu zhoršených motorických schopností.

Ztráta nigrostriatálních DA neuronů však sama o sobě není modelem PD jako takovým, ale spíše napodobuje obecnější parkinsonismus charakterizovaný širším spektrem motorických symptomů.104

Zatímco některé modely založené na toxinech, včetně PFF, chronického MPTP a podávání rotenonu, mohou indukovat agregáty a-syn a tvorbu podobnou LB, liší se od charakteristických inkluzí LB v PD a celkové distribuce těchto agregátů neodráží vzor pozorovaný u PDbrains.102

Tyto modely jsou také omezené ve své schopnosti modelovat progresivní povahu PD a šíření patologie do jiných oblastí mozku, protože pacienti s PD také trpí neurodegenerací v subkortikálních a případně kortikálních oblastech v pozdějších stádiích onemocnění.105

Stručně řečeno, modely založené na expozici toxinům demonstrují některé podobnosti s patologickými stavy pozorovanými u PD; mechanismus buněčné smrti vyvolaný toxiny se však pravděpodobně liší od mechanismů, které jsou základem ztráty neuronů u PD.106,107 Je třeba poznamenat, že typické dávkovací režimy pro modely PD s chemickými toxiny se vyskytují během dnů až týdnů, zatímco průběh PD se vyvíjí po desetiletí a postupuje v průběhu let.

Tato omezení naznačují, že modely založené na expozici toxinům zaměřené na vyvolání selektivní smrti DA neuronů v nigrostriatální dráze představují neúplný obraz PD a poskytují vysvětlení, proč snahy o identifikaci DMT v takových modelech nebyly v klinických studiích účinné.12

Virové vektorové modely pro PD a ADVýhody virových vektorových systémů

Systémy pro dodávání virových vektorů nabízejí několik výhod, kterých je obtížné dosáhnout jinými přístupy.108 Za prvé, systémy virových vektorů poskytují silnou kontrolu nad dočasnou expresí požadovaného genu.

Za druhé, stárnutí je primárním rizikovým faktorem poruch AD-PD spektra a možnost dodání vektoru v kterémkoli okamžiku života zvířete představuje hlavní výhodu pro design studie. Za třetí, virové vektory podporují lokální přenos a expresi transgenu, čímž umožňují přesné a specifické zacílení na zájmové oblasti mozku.

Za čtvrté, přesné manipulace s dávkováním lze snadno dosáhnout s použitím virových vektorů. Za páté, model zájmu může být vytvořen u různých druhů zvířat, od malých hlodavců až po velké primáty kromě člověka.

Za šesté, pro získání požadovaného fenotypu lze snadno vytvořit různé variace genů. Za sedmé, všestrannost a flexibilita různých vektorových platforem používaných pro virově zprostředkovaný přenos genů do centrálního nervového systému je obrovská.

Virové systémy, včetně rekombinantních adeno-asociovaných vektorů (UAV) a lentivirových vektorů (LV), účinně a robustně podporují krátkodobou nebo dlouhodobou genovou expresi, a to jak lokálně, tak globálně. A konečně, systémy založené na virových vektorech jsou výrazně ekonomičtější , a to jak úsilí, tak náklady ve srovnání s jinými modely onemocnění.

AD a PD virové vektorové modely: AAV a LV

Přístup virového vektoru k modelování fenotypů AD a PD in vivo byl využit několika různými skupinami s použitím buď rAAV nebo LV. Od jejich prvního použití na začátku tisíciletí byla vyvinuta a využita řada modelů založených na virech pro AD.

Počáteční modely AAV-tauopatie využívaly AAV2/2 k expresi lidského proteinu P301L v mozcích myší a potkanů.109,110 V těchto studiích byl vektor AAV-tau-P301L injikován do bazálního předního mozku dospělých potkanů, což vedlo ke zvýšeným hladinám tau po dobu nejméně 8 měsíců po transdukci. Je signifikantní, že hyperfosforylované agregáty tauand připomínající NFT byly nalezeny 3 až 4 týdny po transdukci.110,111

Tyto studie poskytly první důkaz konceptu, že injekce AAV-P301L tau by mohla vést k přetrvávající expresi proteinu a jeho agregaci u myší a potkanů.

V souladu s tím injekce AAV divokého typu (WT) nebo trojitého mutantu APP vedla k tvorbě Ab plaků, ale žádné zjevné neurodegeneraci. Tato zjištění jsou v rozporu s výše uvedenými pozorováními, že AAV-WTtau nebo AAV-P301L tau byly schopny způsobit významnou neurodegeneraci HP pyramidálních neuronů.112

V novějších experimentech byl AAV2/5 použit k dodání WT tau a kontrolního vektoru GFP do dorzální HP starých potkanů ​​Fischer 344.113 Oba viry byly robustně exprimovány v HP neuronech a vedly k aberantní axonální struktuře, axonální degeneraci a fragmentaci tau v HP axony ve srovnání s kontrolními axony exprimujícími GFP, které se zdály normální.

V jiném modelu byl tau P301L exprimovaný z promotoru lidského synapsinu I dopraven vektorem AAV2/9 do laterálního entorinálního kortexu, což autorům umožnilo detekovat více forem fosforylovaných a agregovaných variant tau před ztrátou synapsí perforující cesty a neurodegenerací.114

Tato data podporují užitečnost přístupů založených na AAV u AD, zejména při modelování časných patologických změn, jako je axonální degenerace a degradace. Několik studií použilo virové modely zaměřené na vyvolání dalších patologických aspektů LOAD.115,116 Například AAV-BRI-Ab42 a AAV-BRI-Ab40 vektory byly použity pro řízenou expresi a sekreci Ab peptidů u hlodavců HP.116

Je pozoruhodné, že zvířata s injekcí AAV-BRIAb42- prokázala, že tyto vektory byly schopny vyvolat tvorbu plaků, ale to nebylo pozorováno u exprese rAAV2/1-BRIAb40.

V jiné studii byl AAV2/2 použit k dodáníAb40 a Ab42, C-koncového fragmentu APP obsahujícího Ab peptidy (C100) a V717F mutantu C100 do HP a cerebellum myší.

Je zajímavé, že mutanty Ab42 a V717F prokázaly větší indukci mikrogliózy a narušení hematoencefalické bariéry (BBB) ​​ve srovnání s formami Ab40, ale neaktivovaly tvorbu plaků, indukci astrocytů nebo neurodegeneraci. Použití technologie AAV a LV k expresi různých forem Ab a jejich prekurzorů bude i nadále základní metodou studia jejich role v LOAD.117

Nedávno byl LV použit k expresi TDP-43, Ab42 nebo obou v motorickém kortexu potkanů, což odhalilo, že ztráta TDP-43 implikuje mikroglie jako příčinu synaptické degenerace pozorované u LOAD. 118

Kromě toho lenti-TDP-43 spustil změny ve zpracování APP spojené s produkcí Ab42 a indukoval aktivitu kaspázy a neurozánět, který byl podobně pozorován u lenti-Ab42.

Kombinovaná exprese TDP-43 a Ab42 proteinu vedla k výsledku podobnému samotnému TDP-43, ale s přidanou vlastností neuronální ztráty, což naznačuje možný synergický účinek mezi těmito dvěma faktory. Jiná studie využívající LV k expresi TDP-43 v motorickém kortexu zjistila změněný metabolismus aminokyselin, oxidační stres a smrt neuronů.119

Tyto výsledky společně demonstrují užitečnost systémů AD na bázi LV k objasnění klíčových patogenních faktorů souvisejících s dysfunkcí proteinů zapojených do AD, zatímco Ab a tau byly rozsáhle testovány v LOAD, což je v souladu s dlouhotrvající představou, že Ab je klíčovým podezřelým v patogenezi AD. . Nicméně pokračující neúspěchy ve studiích zaměřených na snížení hladin amyloidu vyžadují nové zaměření úsilí na další potenciální viníky.

Několik nedávných studií prokázalo, že APOEε4 může přispívat k toxicitě spojené s fenotypem AD, a k dnešnímu dni zůstává APOE nejvýznamnějším a replikovatelným genetickým rizikovým faktorem pro AD.120

Vzhledem k úloze APOEε4 v patogenezi AD a potenciálnímu ochrannému účinku izoformy ε2 vytvořili Hu a kolegové121 myší modely pomocí izoforem AAV8-APOE řízených promotorem GFAP specificky exprimovaným v astrocytech ve všech oblastech mozku, což vedlo k celkovému zvýšení v úrovních APOE v celém myším mozku.

Virem zprostředkovaná nadměrná exprese APOEε4 u APOEε4-TR myší zvýšila špatně lipidované lipoproteinové částice APOE a snížila APOE-asociovaný cholesterol u APOEε4-TR myší. Naopak nadměrná exprese APOEε2 u APOEε4-TR myši zlepšily lipidaci APOE a související cholesterol.

Nadměrná exprese APOEe4 dále zvýšila hladiny endogenní Ab, zatímco nadměrná exprese APOE2 měla tendenci snižovat endogenní Ab. Na základě těchto údajů autoři navrhují, že zvýšení APOEε2 u přenašečů APOEε4 je prospěšnou strategií pro léčbu AD, zatímco zvýšení APOEε4 u přenašečů APOEε4 je škodlivé. V jiné studii byla provedena přímá intracerebrální injekce s použitím AAV k expresi APOEε2.

Studie uvádí, že nadměrná exprese APOEε2 výrazně snížila hladiny v mozku rozpustných (včetně oligomerních) a nerozpustných Ab, stejně jako amyloidní zátěž, ve dvou myších modelech mozkové amyloidózy, u níž je patologie závislá buď na expresi myší nebo lidských izoforem APOEε4.122

Zhao et al.122 dále ukázali, že rozsáhlé redukce mozkových Ab lze dosáhnout pomocí jediné injekce viru prostřednictvím intrathalamického podání AAV exprimujícího APOEε2.

Souhrnně tato data naznačují, že AAV genová dodávka APOEe2 pomocí AAV může zachránit škodlivé účinky APOEe4 na mozkovou amyloidní patologii; tento přístup tedy může představovat životaschopnou terapeutickou cestu pro léčbu nebo prevenci LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com