Perorální hypoxií indukovatelný faktor Inhibitor prolylhydroxylázy Enarodustat působí proti změnám v renálním energetickém metabolismu v časných stádiích diabetického onemocnění ledvin

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Úvod

Divize nefrologie a endokrinologie, The University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokio, Japonsko; Research Fellowship for Young Scientists, Japan Society for Promotion of Science, Tokio, Japan; Biologické a farmakologické výzkumné laboratoře,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japonsko; Ústav systémové farmakologie, Lékařská fakulta pro postgraduální studium Tokijské univerzity, Tokio, Japonsko; Laboratoř pro syntetickou biologii, Centrum RIKEN pro výzkum dynamiky biosystémů, Suita, Japonsko; a WPI International Research Center for Neurointelligence, The University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), The University of Tokyo, Tokio, Japan.

Inhibitory prolylhydroxylázy hypoxií indukovatelného faktoru (HIF), také známé jako stabilizátory HIF, zvyšují produkci endogenního erytropoetinu a slouží jako nová terapeutická činidla proti anémiichronickýledvinachoroba. HIF indukuje expresi různých genů souvisejících s energetickým metabolismem jako adaptivní odpověď na hypoxii. Zůstává však nejasné, jak metabolické přeprogramování vnitřní tkáně stabilizací HIF ovlivňuje patofyziologiiledvina nemocí. Předchozí studie naznačují, že systémové metabolické poruchy, jako je hyperglykémie a dyslipidémie, způsobují změny renálního metabolismu, což vede k renální dysfunkci včetně diabetického onemocnění ledvin. Zde analyzujeme účinky enarodustatu (JTZ-951), perorálního stabilizátoru HIF, na energetický metabolismus ledvin v časných stádiích diabetického onemocnění ledvin, a to pomocí diabetických potkanů ​​indukovaných streptozotocinem a diabetických myší indukovaných alloxanem. Analýza transkriptomu odhalila, že enarodustat působí proti změnám v diabetickém renálním metabolismu. Analýza transkriptomu ukázala, že metabolismus mastných kyselin a aminokyselin byl upregulován v diabetické renální tkáni a downregulován enarodustatem, zatímco metabolismus glukózy byl upregulován. Tyto symetrické změny byly potvrzeny metabolomovou analýzou. Zatímco glykolýza a metabolity cyklu trikarboxylových kyselin byly akumulovány a aminokyseliny redukovány v renální tkáni diabetických zvířat, tyto metabolické poruchy byly zmírněny enarodustatem. Kromě toho enarodustat zvýšil poměr glutathion k glutathion disulfidu a zmírnil oxidační stres v renální tkáni diabetických zvířat. Stabilizace HIF tedy působí proti změnám v renálním energetickém metabolismu, ke kterým dochází u incipientůdiabetikledvinachoroba.

Cistanche je velmi dobrý pro funkci ledvin

Překladové prohlášení

Inhibitory prolylhydroxylázy faktoru indukovaného hypoxií (HIF) (také známé jako stabilizátory HIF) zvyšují produkci endogenního erytropoetinu a slouží jako nová terapeutická činidla proti anémiichronickýledvinachoroba. Naše transkriptomové a metabolomové analýzy renální tkáně u potkaních a myších diabetických modelů odhalily, že enarodustat (JTZ{0}}), perorální stabilizátor HIF, působí proti změnám energetického metabolismu ledvin v časných stádiích diabetického onemocnění ledvin. Výsledky poskytují důležitá data pro extrapolaci účinků stabilizátorů HIF na energetický metabolismus ledvin v klinických podmínkách, i když jsou zapotřebí další studie k objasnění toho, jak toto přeprogramování metabolismu ledvin pomocí stabilizátorů HIF ovlivňuje progresidiabetikledvinachoroba.

Představení se

Inhibitory prolylhydroxylázy hypoxií indukovatelného faktoru (HIF) zvyšují endogenní produkci erytropoetinu a slouží jako nová terapeutická činidla proti anémii u chronickýchledvinachoroba. Buňky jsou vybaveny obranným mechanismem proti hypoxii a HIF je hlavním regulátorem této obrany. Ledviny jsou fyziologicky vystaveny hypoxii a chronická hypoxie je rozpoznána jako poslední běžná cesta vedoucí ke konečnému stádiu onemocnění ledvin. Vzhledem k tomu, že HIF indukuje expresi různých genů souvisejících s hypoxií, mohou mít stabilizátory HIF pleiotropní účinky na progresiledvinanemocístejně jako zlepšení anémie u chronickýchledvinachoroba. Je zajímavé, že HIF indukuje expresi glykolytických genů a pyruvátdehydrogenázové kinázy, která inhibuje pyruvátdehydrogenázu v používání pyruvátu jako paliva cyklu mitochondriálních trikarboxylových kyselin (TCA).6,7 Toto metabolické přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu potlačuje spotřebu kyslíku a je kritické pro adaptaci buněk vystavených hypoxickému prostředí. Zůstává však nejasné, jak metabolické přeprogramování renální tkáně stabilizací HIF ovlivňuje patofyziologiiledvina nemocí. Diabetické onemocnění ledvin (DKD) je hlavní příčinou konečného stádia onemocnění ledvin. Systémové metabolické poruchy, jako je hyperglykémie a dyslipidémie, způsobují změny metabolismu ledvin, což vede k renální dysfunkci včetně DKD. Předchozí studie ukázaly zvýšený metabolický tok a akumulaci glukózy a metabolitů cyklu TCA v diabetické renální kortikální tkáni, což může souviset s mitochondriální dysfunkcí a progresí DKD. Předpokládali jsme, že stabilizátory HIF mohou zvrátit změny metabolismu v diabetické renální kortikální tkáni, protože HIF jako adaptivní odpověď na hypoxii snižuje metabolický tok v buňkách, aby potlačila spotřebu kyslíku. S využitím transkriptomových a metabolomových analýz jsme tedy provedli studii proof-of-concept, abychom komplexně pochopili, jak enarodustat (JTZ-951), perorální stabilizátor HIF, ovlivňuje změny metabolismu ledvin, ke kterým dochází v časných stádiích DKD.

VÝSLEDKY: Enarodustat indukuje metabolické přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu v buňkách renálního proximálního tubulu

Vzhledem k tomu, že kůra ledvin je složena převážně z proximálních tubulů, zkoumali jsme nejprve účinky enarodustatu na metabolický tok buněk renálního proximálního tubulu in vitro. Nejprve byly provedeny zátěžový test Mito (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) a test glykolytické rychlosti (Agilent) na kultivovaných buňkách HK{0}}, což je buněčná linie epiteliálních buněk lidského proximálního tubulu (obrázek 1a). Enarodustat významně snížil mitochondriální dýchání (cyklus TCA) a zvýšil bazální glykolýzu, což naznačuje metabolické přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu (obrázek 1; doplňkový obrázek S1). Provedli jsme také experiment s použitím malé interferující RNA (siRNA) pro HIF-1 (obrázek 2; doplňkový obrázek S2). Knockdown HIF-1 pomocí siRNA zvrátil metabolické změny (bazální dýchání, maximální dýchání, rezervní respirační kapacitu a produkci adenosintrifosfátu [ATP]) vyvolané enarodustatem, což ukázalo, že metabolické přeprogramování bylo hlavně prostřednictvím HIF-1 stabilizace (obrázek 2; doplňkový obrázek S2). Aktivita pyruvátdehydrogenázy, důležitý faktor pro to, aby buňky využívaly pyruvát k pohonu cyklu TCA, byla také snížena enarodustatem (obrázek 2f), který byl kompatibilní s dříve publikovanými pozorováními.

Základní údaje o streptozotocinem indukovaných diabetických krysách

Z výsledků experimentů in vitro jsme předpokládali, že stabilizátory HIF mohou zmírnit změny metabolismu v diabetické renální kortikální tkáni prostřednictvím metabolického přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu. Nejprve jsme vybrali streptozotocinem (STZ) indukované diabetické krysy jako model pro experiment proof-of-concept k testování výše uvedené hypotézy. V tomto modelu je diabetes rychle indukován, což nám umožňuje pozorovat čisté účinky diabetu a stabilizátorů HIF na energetický metabolismus v renální tkáni během krátké doby. Protokol studie a základní data z experimentů na STZ-indukovaných diabetických krysách jsou ukázány na obrázku 3a. Potkany jsme rozdělili do 3 skupin: skupina A (sham), skupina B (DKD) a skupina C (DKD þ enarodustat). Hladiny glukózy v krevní plazmě, glykosylovaného hemoglobinu HbA1c, triglyceridů a celkového cholesterolu v den 14 byly významně zvýšeny u diabetických skupin ve srovnání se skupinou A, zatímco mezi skupinami B a C nebyly žádné významné rozdíly (obrázek 3d–g). Přestože se hladiny kreatininu v plazmě mezi skupinami nelišily, vylučování albuminu močí bylo významně zvýšené a glomerulomegalie byla patrná ve skupině B ve srovnání se skupinou A a enarodustat měl tendenci tyto změny zvrátit (obrázek 4). Hladiny dusíku močoviny v krvi byly vyšší u diabetických skupin, což odráželo dehydrataci způsobenou cukrovkou. Stručně řečeno, ledviny potkanů ​​léčených STZ v naší studii představují raná stádia DKD. Transkriptomové a metabolomové analýzy byly provedeny za použití renální kortikální tkáně těchto krys.

Transkriptomová analýza renální kortikální tkáně

Výsledky transkriptomové analýzy renální kortikální tkáně jsou znázorněny na obrázcích 5 a 6. Analýza hlavní složky a analýza hierarchického shlukování ukázaly, že skupiny A, B a C byly rozděleny do různých shluků (obrázek 5a a b). Diferenciálně exprimované geny byly vybrány pomocí │log2 násobné změny (FC) │ větší nebo rovné 0,5 a hodnota Q < 0,05.="" genová="" ontologie="" a="" analýzy="" kanonických="" drah="" odhalily,="" že="" geny="" související="" s="" metabolismem="" mastných="" kyselin="" byly="" upregulovány="" ve="" skupině="" b="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" a.="" naproti="" tomu="" geny="" související="" s="" metabolismem="" glukózy="" a="" hypoxickou="" reakcí="" včetně="" sítě="" hif-1="" byly="" upregulovány="" ve="" skupině="" c="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" b="" (obrázek="" 5c="" a="" d).="" provedli="" jsme="" také="" analýzu="" obohacení="" genové="" sady="" (gsea)="" pomocí="" transkriptomických="" dat="" (obrázek="" 6,="" tabulky="" 1="" a="" 2).="" genové="" sady="" metabolismu="" mastných="" kyselin="" a="" aminokyselin="" byly="" upregulovány="" ve="" skupině="" b="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" a="" (obrázek="" 6).="" naproti="" tomu="" tyto="" genové="" sady="" byly="" downregulovány="" a="" genové="" sady="" metabolismu="" glukózy="" byly="" upregulovány="" ve="" skupině="" c="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" b,="" což="" ukazuje,="" že="" enarodustat="" zvrátil="" změny="" metabolismu="" vyvolané="" diabetem="" (obrázek="" 6).="" navíc="" genové="" sady="" cyklu="" tca="" byly="" downregulovány="" ve="" skupině="" c="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" b="" (tabulka="" 2),="" což="" je="" kompatibilní="" s="" představou="" metabolického="" přeprogramování="" indukovaného="" enarodustatem="" v="" proximálních="" tubulech="" pozorované="" v="" naší="" studii="" in="" vitro.="" stručně="" řečeno,="" enarodustat="" působil="" proti="" změnám="" diabetického="" renálního="" metabolismu="" z="" transkriptomického="">

Metabolomová analýza renální kortikální tkáně

Měřili jsme absolutní koncentrace 116 metabolitů souvisejících s energií v renální kortikální tkáni krys (n =4, pro každou skupinu) náhodně vybraných z každé skupiny (doplňková tabulka S1; doplňkový obrázek S3). Byla provedena částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců (PLS-DA) k posouzení významnosti třídní diskriminace (obrázek 7). Provedli jsme analýzu obohacení sady metabolitů (MSEA) s použitím metabolitů s proměnnou důležitostí PLS-DA v projekci (VIP) skóre $ 1. Rozdíly v metabolismu aminokyselin, jako je glycin, serin, methionin, aspartát, glutamát, arginin, prolin, a b-alanin mezi skupinami A a B byly zaznamenány. Rozdíly v metabolismu aminokyselin byly také pozorovány mezi skupinami B a C. Navíc procesy metabolismu glukózy, jako je glykolýza a glukoneogeneze, vykazovaly různé trendy mezi skupinami B a C (obrázek 7).

Vizualizace dat transkriptomu a metabolomu na mapě energetické metabolické dráhy

Pro komplexní pochopení změn energetického metabolismu jsme vizualizovali data transkriptomu a metabolomu (obrázek 8). Bylo zjištěno, že glykolýza a metabolity cyklu TCA jsou akumulovány ve skupině B ve srovnání se skupinou A, což může být způsobeno nadměrným přítokem glukózy a upregulací metabolismu mastných kyselin v DKD. Koncentrace aminokyselin byla snížena ve skupině B ve srovnání se skupinou A, což odráží upregulaci metabolismu aminokyselin (obrázek 8a). Naproti tomu akumulace metabolitů glykolýzy byla zmírněna enarodustatem díky usnadnění toku glykolýzy. Enarodustat také zvrátil diabetem vyvolané změny v metabolitech cyklu TCA a aminokyselinách (obrázek 8b). Navíc enarodustat zmírnil akumulaci glutathiondisulfidu (GSSG) v diabetické renální tkáni, a tak vykázal vyšší poměr glutathion/GSSG, což naznačuje, že enarodustat zmírnil oxidační stres u DKD (obrázek 8a a b). Snížení oxidačního stresu bylo potvrzeno hladinami lipidového peroxidačního markeru malondialdehydu v renální kortikální tkáni: enarodustat zvrátil akumulaci malondialdehydu v diabetické renální kortikální tkáni (doplňkový obrázek S4). Souhrnně, integrace transkriptomových a metabolomových dat prokázala, že enarodustat působí proti změnám renálního energetického metabolismu, ke kterým dochází v časných stádiích DKD.

Symetrické změny metabolismu (diabetes vs. enarodustat) jsou potvrzeny v alternativním modelu

Provedli jsme transkriptomovou analýzu u alloxanem indukovaných diabetických myší, dalšího zvířecího modelu diabetu, abychom potvrdili naše zjištění na potkaním modelu. Protokoly studie a základní údaje pro myší model jsou uvedeny na obrázku 9. Vylučování albuminu močí bylo významně zvýšeno ve skupině B ve srovnání se skupinou A, což bylo zvráceno enarodustatem (obrázek 9d). Kromě toho jsme použili komplexní 3-rozměrovou analýzu (Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails a Computational analysis [CUBIC] – ledviny)16 k vizualizaci glomerulů v ledvinách. Glomerulomegalie byla patrná ve skupině B ve srovnání se skupinou A, kterou zvrátil enarodustat (obrázek 9e). Transkriptomová analýza renální tkáně u myší s cukrovkou indukovanou alloxanem prokázala symetrické změny metabolismu (diabetes vs. enarodustat) stejným způsobem jako v modelu diabetické krysy indukované STZ (obrázek 10): metabolismus mastných kyselin byl upregulován diabetem, zatímco glukóza metabolismus byl upregulován enarodustatem. Kromě toho byl metabolismus aminokyselin upregulován diabetem a downregulován enarodustatem. Enarodustat tedy působil proti změnám renálního energetického metabolismu, ke kterým dochází v časných stádiích DKD v alloxanem indukovaném diabetickém myším modelu, stejně jako v STZ indukovaném diabetickém potkaním modelu.

DISKUSE

V této studii jsme prokázali, že enarodustat (JTZ{0}}), perorální stabilizátor HIF, působí proti změnám renálního energetického metabolismu, ke kterým dochází v časných stádiích DKD u potkaních a myších modelů diabetu. Analýzy transkriptomu a metabolomu ukázaly symetrické změny metabolismu v renální tkáni (diabetes vs. enarodustat): metabolismus mastných kyselin a aminokyselin byl upregulován v DKD, zatímco enarodustat tyto dráhy downreguloval a navíc reguloval metabolismus glukózy (obrázky 5–10).

Nebylo zcela objasněno, zda má stabilizace HIF protektivní účinky na patofyziologii DKD či nikoliv. Předchozí studie ukázaly, že diabetická renální tkáň je vystavena hypoxii17 a exprese HIF v diabetické renální tkáni je nedostatečná v reakci na jejich hypoxické podmínky, což je částečně způsobeno oxidačním stresem.18 Stabilizace HIF chloridem kobaltnatým zlepšila stav oxidačního stresu a snížila proteinurii a tubulointersticiální poškození u DKD vyvolané STZ.19 Výsledky studie na zvířatech také ukázaly, že stabilizace HIF chránila před rozvojem obezity,20 zlepšila citlivost na inzulín,20 a snížila hladiny cholesterolu v séru.21 Tyto výsledky naznačují ochranné účinky stabilizace HIF při rozvoji obezity. DKD. Naproti tomu bylo popsáno, že suprafyziologická stabilizace HIF von Hippel-Lindauovou delecí indukuje renální fibrózu.22 Role stabilizace HIF v progresi DKD může být závislá na kontextu vzhledem k pleiotropním účinkům HIF a existenci různých fenotypů DKD. Cílem této studie bylo objasnit čisté účinky stabilizace HIF na energetický metabolismus v diabetické ledvině. Předchozí zprávy naznačovaly, že u DKD dochází ke změnám energetického metabolismu. Sas et al.10 prokázali zvýšený energetický metabolický tok a akumulaci metabolitů glukózy v diabetické renální kortikální tkáni, což může souviset s mitochondriální dysfunkcí. You et al.23 uvedli, že fumarát, metabolit cyklu TCA, se akumuloval v diabetické renální tkáni a přímo přispěl k progresi DKD. Již dříve jsme ukázali, že metabolity cyklu TCA se akumulovaly v diabetické renální tkáni, což bylo zvráceno inhibicí sodno-glukózového kotransportéru 2 nebo omezením kalorií.11 Qi et al.24 navíc ukázali, že enzymy v glykolytických drahách včetně pyruvátkinázy M2 (PKM2), byly upregulovány u pacientů s diabetem 1. typu bez DKD ve srovnání s pacienty s DKD. Aktivace PKM2 zvrátila akumulaci glykolýzových metabolitů a obnovila mitochondriální funkci, částečně zvýšením glykolytického toku.24,25 Tyto předchozí zprávy naznačují, že akumulace glykolýzy a metabolitů cyklu TCA by mohla ovlivnit progresi DKD, kterou lze zmírnit usnadněnou glykolýzou včetně PKM2 aktivace. V naší studii stabilizace HIF enarodustatem zvrátila změny energetického metabolismu a zmírnila akumulaci glykolýzy a metabolitů cyklu TCA v diabetické renální kortikální tkáni (obrázek 8). Exprese glykolytických enzymů včetně PKM2 byla také upregulována enarodustatem (doplňkový obrázek S4B). Navíc enarodustat zmírnil akumulaci GSSG a zvýšil poměr glutathion/GSSG, což naznačuje, že enarodustat zmírnil oxidační stres v DKD (obrázek 8). Toto snížení oxidačního stresu vyvolané enarodustatem bylo také potvrzeno změnami hladin malondialdehydu v renální kortikální tkáni (doplňkový obrázek S4A). Tyto výsledky naznačují, že stabilizace HIF by měla mít ochrannou roli v patofyziologii DKD alespoň z metabolického hlediska. Je jisté, že nemůžeme zkoumat, zda metabolické přeprogramování stabilizací HIF má přímé účinky na progresi DKD, protože může být nemožné rozpoznat čisté účinky změn metabolismu na renální výsledek kvůli pleiotropní roli HIF. V naší studii však mírné vylučování albuminu močí a renální patologické abnormality (glomerulomegalie a ztluštění bazální membrány glomerulů) vyvolané diabetem byly zmírněny enarodustatem ve spojení s normalizací energetického metabolismu ledvin. Extrahovali jsme geny, jejichž změny exprese korelovaly s hladinami albuminu v moči (257 sond; 232 genů) z dat microarray v modelu diabetické myši indukované alloxanem a provedli jsme analýzu obohacení dráhy (doplňkový obrázek S5). V důsledku toho jsou dráhy související s mitochondriální membránou a respiračním transportem elektronů upregulovány v souvislosti s hladinami albuminu v moči, což ukazuje, že mitochondriální zátěž úzce souvisí s vylučováním albuminu močí. Existuje tedy možnost, že metabolická normalizace diabetické renální tkáně pomocí stabilizátorů HIF by mohla snížit mitochondriální zátěž a zmírnit progresi DKD. Naše data naznačují patofyziologii DKD z metabolických hledisek následovně: Hyperglykémie vytváří potřebu energie pro reabsorpci glukózy v renálních proximálních tubulech; tak je TCA cyklus v mitochondriích násilně aktivován, aby pokryl energetický požadavek v raných stádiích DKD (upregulace metabolismu mastných kyselin a aminokyselin). A stabilizátory HIF by mohly zmírnit tuto mitochondriální zátěž metabolickým přeprogramováním z cyklu TCA na glykolýzu (snížení regulace metabolismu mastných kyselin a aminokyselin a upregulace glykolýzy), která by mohla mít ochranné role proti progresi DKD. K objasnění toho, jak mitochondriální zátěž v renální tkáni přímo ovlivňuje patofyziologii DKD, jsou zapotřebí další studie zahrnující jednobuněčné omiky. Další zajímavou otázkou je, zda stabilizátory HIF přímo ovlivňují absorpci glukózy v proximálních tubulech. Naše data in vitro ukázala, že produkci ATP významně snižuje enarodustat prostřednictvím metabolického přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu (obrázky 1 a 2). Vzhledem k tomu, že ATP je nutný pro reabsorpci glukózy kotransportérem sodíku a glukózy 2, nejprve jsme předpokládali, že reabsorpce glukózy může být inaktivována enarodustatem. Hladiny glukózy v moči se však významně nelišily mezi skupinou B a skupinou C v obou zvířecích modelech (doplňkový obrázek S6). Pravděpodobně je snížení produkce ATP enarodustatem mnohem mírnější ve fyziologické situaci ve srovnání s jeho účinkem in vitro; stabilizace HIF tedy neovlivňuje absorpci glukózy prostřednictvím sodno-glukózového kotransportéru 2, alespoň v našich experimentech na zvířatech. Naše studie měla 2 omezení. Nejprve jsme použili STZ indukované diabetické krysy a alloxanem indukované diabetické myši jako modely DKD v raném stadiu a pozorovali jsme krátkodobé účinky diabetických stavů. V klinickém prostředí by však HIF stabilizátory byly podávány pacientům s anémií v pozdním stadiu DKD. K pochopení účinku stabilizace HIF na změny renálního metabolismu v pozdním stadiu DKD je zapotřebí více studií. Za druhé, studie postrádala dostatečnou statistickou sílu s ohledem na rozptyl koncentrací metabolitů v metabolomových datech, zatímco transkriptomová data měla statistickou sílu dostatečně velkou na to, aby objasnila celkový obraz energetického metabolismu. Protože ne mnoho metabolitů vykazovalo významný rozdíl mezi skupinami, provedli jsme PLS-DA a vybrali jsme metabolity s PLS-DA VIP skóre vyšším nebo rovným 1 pro MSEA. Ačkoli je obtížné křížově ověřit metabolickou změnu pomocí samotných metabolomických dat, výsledky metabolomové analýzy byly kompatibilní s transkriptomickými daty (obrázky 7 a 8), což poskytlo další podporu pro pozorované účinky změn transkriptomu na energetický metabolismus ledvin. Závěrem lze říci, že enarodustat (JTZ-951), perorální stabilizátor HIF, působí proti změnám renálního energetického metabolismu v časných stádiích DKD. Naše studie naznačuje, že stabilizace HIF může sloužit jako potenciální intervence, která se zaměřuje na dysregulovaný renální energetický metabolismus v DKD.

METODY

Zátěžový test Mito a test glykolýzy

HK-2 buňky byly nasazeny na 96-jamkovou mikrodestičku v hustotě 1 x 10⁴buňky/jamka. Následující den byl metabolický tok měřen v reálném čase pomocí analyzátoru Seahorse XFe96 (Agilent) pomocí sady Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) nebo sady Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Koncentrace glukózy, pyruvátu a glutaminu v kultivačních médiích byly 10 mmol/l, 1 mmol/la 2 mmol/l.

transfekce siRNA

Knockdown HIF-1 provedla Stealth RNAi pro lidský HIF1A (HSS104774 [#1] a HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA Negativní kontrola Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) byla použita jako negativní kontrola.

Western blotting

Primární protilátky použité pro barvení byly anti-lidská HIF{1}} protilátka (králičí polyklonální, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) a anti-lidská aktinová protilátka (králičí polyklonální, 1:1000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Sekundární protilátkou byla kozí anti-králičí IgG protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Pokusy na zvířatech

Krysy Crl: CD (Sprague Dawley) a myši Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) byly získány od Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Japonsko). Všechny experimenty byly schváleny Institucionální revizní radou University of Tokyo (číslo schválení P17-110). Všechny postupy na zvířatech byly prováděny podle pokynů National Institute of Health (Guide for the Care and Use of the Laboratory Animals). Protokoly studie jsou uvedeny na obrázcích 3 a 9.

Analýza transkriptomu

Celková RNA z renální kortikální tkáně byla izolována pomocí GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Celková RNA (100 ng) byla označena pomocí Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) a poté hybridizována na SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (pro krysy; Agilent) a SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (pro myš). Všechny mikročipové experimenty byly provedeny společností DNA Chip Research Inc. (Tokio, Japonsko). Nezpracovaná data byla zpracována pomocí R package limma v Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) pro provedení korekce pozadí a normalizace dat pomocí kvantilové normalizační metody. Dávkové efekty byly odstraněny pomocí ComBat (Bioconductor) v experimentu na krysách. Diferenciálně exprimované geny byly stanoveny pomocí│log2 FC│ větší nebo rovné 0,5 a hodnota Q < 0,05.="" genová="" ontologie="" a="" analýzy="" kanonických="" drah="" byly="" prováděny="" pomocí="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" microarray="" data="" byla="" uložena="" v="" národním="" centru="" pro="" biotechnologické="" informace="" gene="" expression="" omnibus="" jako="" série="" gse131221="" (krysa)="" a="" gse139317="">

Analýza obohacení genové sady

GSEA je výpočetní metoda, která určuje, zda a priori definovaný soubor genů vykazuje statisticky významné, souhlasné rozdíly mezi 2 biologickými stavy. GSEA byla provedena pomocí GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Cesty s falešnou mírou objevení < 0,25="" byly="" považovány="" za="">

Metabolomová analýza

Metabolomová měření byla provedena společností Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japonsko). Koncentrace metabolitů byly vypočteny normalizací plochy píku každého metabolitu s ohledem na plochu vnitřního standardu a použitím standardních křivek, které byly získány z 3-bodových kalibrací. Viz také doplňkové metody.

Analýza obohacení metabolitů

Analýza metabolomických dat byla provedena pomocí integrované webové platformy MetaboAnalyst 4.0. Bylo provedeno PLS-DA a byla vypočtena související VIP skóre. Metabolity s PLS-DA VIP skóre vyšším nebo rovným 1 byly použity pro MSEA.

Kvantifikace glomerulárních oblastí u renálních patologií

Náhodně jsme pořídili 3 patologické snímky z každého vzorku ze snímku barvení kyselinou periodickou – Schiff a změřili každou glomerulární oblast pomocí Fidži (distribuce ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

KUBICKÁ-ledvina

Komplexní 3-dimenzionální zobrazení glomerulů v renální tkáni bylo provedeno pomocí CUBIC podle našich předchozích prací. Stručně řečeno, fixované myší ledviny byly ponořeny do CUBIC-L pro delipidaci a poté podrobeny imunofluorescenčnímu barvení. Nakonec byl index lomu přizpůsoben umístěním vzorků v CUBIC-R plus. Komplexní 3D-rozměrné snímky z průhledných ledvin byly pořízeny na zakázku vytvořenou fluorescenční mikroskopií se světelným listem (MVX10-LS; Olympus, Tokio, Japonsko). Primární protilátka použitá pro barvení byla anti-podocinová protilátka (králičí polyklonální, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Sekundární protilátkou byl Alexa Flour 555- konjugovaný oslí anti-králičí IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Statistická analýza

Pro vícenásobná srovnání byla použita {{0}}cestná analýza rozptylu následovaná post hoc Tukeyho vícenásobnými srovnávacími testy, pokud to bylo vhodné. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0,05="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="" významné.="" data="" jsou="" prezentována="" jako="" průměr="" ±="">

ZVEŘEJNĚNÍ

MN obdržel honoráře, poplatky za poradenství nebo financování výzkumu od KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim a Alexion. TT získala výzkumný grant od JT. Enarodustat (JTZ-951) poskytla společnost JT, Tokio, Japonsko. EAS a HRU jsou spoluvynálezci patentů vlastněných společností RIKEN. Část této studie byla provedena ve spolupráci s Olympus Corporation a laskavým softwarem podporovaným Bitplane. Druhý autor neuvedl žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

Jsme vděční Dr. Shuhei Yao a Dr. Shinji Tanaka za cenné diskuse. Děkujeme také Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda a paní Kahoru Amitani za jejich technickou podporu. Tato práce byla částečně provedena za podpory Isotope Science Center, University of Tokyo. Tato práce byla podpořena výzkumným pracovníkem Grant-in-Aid pro Japonskou společnost na podporu vědy (JSPS) (Grant JSPS KAKENHI 19J11928 pro SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant JSPS KAKENHI 18H02824 pro MN ), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (grant JSPS KAKENHI 17K09688 pro TT) a Grant-in-Aid pro vědecký výzkum v inovativních oblastech (grant KAKENHI 26111003 pro MN).