Hippocampus, prefrontální kůra a perirhinální kůra jsou kritické pro paměť náhodného řádu

Pro více informací:ali.ma@wecistanche.com

Abstraktní

Značný výzkum na hlodavcích a lidech ukazuje, že hipokampus a prefrontální kůra jsou nezbytné pro zapamatování časových vztahů mezi podněty a hromadící se důkazy naznačují, že může být zapojen i perirhinální kortex. Experimentální parametry se však napříč studiemi podstatně liší, což omezuje naši schopnost plně porozumět základním přínosům těchto struktur. Předchozí studie se liší v typu časovéhoPaměťzdůrazňují (např. pořadí, posloupnost nebo oddělení v čase), podněty a reakce, které používají (např. jedinečné nebo opakované sekvence a náhodné nebo odměňované chování), a míru, do jaké kontrolují potenciální matoucí faktory ( např. primární a aktuální efekty nebo pořadípaměťové deficitysekundární k položceporuchy paměti)Abychom pomohli integrovat tato zjištění, vyvinuli jsme nové testování paradigmatunáhodná vzpomínkapro zkušební unikátní sérii událostí a souběžně hodnocené pořadí a paměť položek u zvířat s poškozením hipokampu, prefrontálního kortexu nebo perirhinálního kortexu. Zjistili jsme, že tento nový přístup vedl k robustnímu pořádku apaměť položkya že hipokampální, prefrontální a perirhinální poškození selektivněpostižený paměť objednávky. Tato zjištění naznačují, že hippocampus, prefrontální kůra a perirhinální kůra jsou součástí široké sítě struktur nezbytných pro náhodné učení pořadí událostí vepizodická paměť.

Leila M.Allen, RachelA.Lesyshyn, Steven J.O'Dell, Timothy A. Allen, Norbert J. Fortin

1Centrum pro neurobiologii učení a paměti, University of California, Irvine, CA 92697 2Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, CA 92697 3Program kognitivní neurovědy, Katedra psychologie, Florida International University , Miami, FL 33199

ÚVOD

Schopnost časově organizovat osobní zážitky v paměti je určujícím aspektem epizodické paměti. Bylo vyvinuto několik přístupů ke zkoumání paměti, „kdy“ se události vyskytují u hlodavců a lidí (např. Hannesson et al., 2004a,b; Dere et al., 2005; Babb a Crystal, 2006; Kart-Teke a kol., 2006; Barker a kol., 2007; Fouquet a kol., 2010; Allen a kol., 2014) a značné důkazy naznačují, že hippocampus (HC) hraje v této funkci ústřední roli (Eichenbaum, 2013; Davachi & DuBrow, 2015). Například u hlodavců léze HC zhoršují paměť časového řádu, ale ne paměť položek (Chiba a kol. 1994; Fortin a kol. 2002; Kesner a kol. 2002; DeVito & Eichenbaum, 2011;Barker&Warburton, 201l; 2013). HC neurony posilují a přehrávají prostorové sekvence v pořadí, v jakém se spouštěly během učení, což naznačuje paměť pro sekvence prostorových umístění (Skaggs & McNaughton, 1996; Farooq et al., 2019). Bylo také zjištěno, že HC neurony spolehlivě spouštějí v určitých okamžicích. během mezer mezi stimuly („časové buňky“; Pastalková et al., 2008; MacDonald et al., 2013) a rozlišovat mezi položkami prezentovanými ve správné nebo nesprávné sekvenční poloze („sekvenční buňky“; Allen et al..2016) . Podobně u lidí studie MRI ukázaly, že HC je významně aktivována během kódování nebo získávání různých forem časových informací o vlastních zkušenostech (Cabeza et al., 1997; Hayes et al., 2004; Kumaran & Maguire, 2006; Lehn , a kol., 2009; Ross a kol., 2009; Ekstrom a kol., 2011; Tubridy & Davachi, 2011; Hsieh a kol., 2014; Davachi& Dubrow, 2015; Reeders a kol., 2018).

Klikněte na představec Cistanche a pro paměť Cistanche

Prefrontální kůra (PFC) je další strukturou, o které se předpokládá, že hraje klíčovou roli v časové organizaci vzpomínek. U hlodavců narušují léze a dočasné inaktivace mediálního PFC časové rozlišení objektů a prostorových umístění (Mitchell & Laiacona, 1998; Hannesson, a kol. 2004a, b; Barker, a kol., 2007; DeVito & Eichenbaum, 2011; Jayachandran a kol., 2019). Mediální PFC neurony dále vykazují trvalé vystřelování v mezeře mezi stimuly, což může pomoci překlenout asociace stimulů v čase (např. Cowen & McNaughton, 2007; Gilmartin & McEchron, 2005). Existuje také dostatek důkazů ze studií na lidech, které implikují srovnatelné funkce PFCin (viz St. Jacques a kol., 2008; Jenkins & Ranganath, 2010; Preston & Eichenbaum; 2013; Hsieh & Ranganath, 2015; Reeders a kol., 2018).

Kromě HC a PFC může hrát důležitou roli také perirhinální kortex (PER). Ačkoli PER byla nejčastěji spojována s pamětí položek (Murray a kol., 2000, Bussey a kol., 2002; Murray a kol., 2007; Barker& Warburton, 2011; Feinberg a kol., 2012), hromadící se důkazy naznačují, že může také přispívat k pořádku. Paměť. Předpokládá se například, že PER usnadňuje sjednocené reprezentace událostí, ke kterým dochází v průběhu času, a kombinuje časově nespojité rysy do jediného percepčního objektu v paměti (Allen et al, 2007; Kholodar-Smith et al, 2008a; Kent & Brown, 2012). Neurony PER vykazují trvalé spouštění vyvolané synaptickou stimulací ve Vitře a mohou trvat déle než minutu po zastavení stimulace, což naznačuje, že neurony PER jsou schopné spojovat události napříč časovými mezerami (Navaroli et al., 2012). V poslední době se ukázalo, že umlčení synaptické aktivity v mediálních PFC-PER projekcích ruší paměť pro dobře trénované sekvence pachů (Jayachandran et al, 2019).

Je však důležité poznamenat, že existují značné rozdíly v paradigmatech použitých ve výše uvedených experimentech, což ztěžuje úplné pochopení konkrétních příspěvků HC, PFC a PER. Za prvé, paradigmata se liší v typu časové paměti, na kterou kladou důraz, včetně paměti pro relativní pořadí událostí (např. B nastaly před D) pro konkrétní sekvenci, ve které se vyskytly (např. po A následovalo B, poté C, pak D)nebo pro časové oddělení mezi položkami (např. A došlo před ~5 min, B~l min před; viz Friedman,1993; Allen & Fortin,2013). Za druhé, některá paradigmata zahrnují nahodilost

učení, což je klíčový aspekt epizodické paměti (Zhou et al., 2012), zatímco jiní (především u hlodavců) odměňují prezentace podnětů nebo rozkazy. Za třetí, některá paradigmata zahrnují sérii jedinečných událostí, což je klíčový rys epizodické paměti, zatímco jiná zahrnují opakované prezentace stejných událostí. Konečně, některá paradigmata, také typicky u hlodavců, zahrnují užší seznam podnětů (2 nebo 3 položky), takže sondy objednávky musí zahrnovat první a/nebo poslední položky vzorku. V takových případech nemohou soudy časové paměti ovlivnit efekty prvenství nebo aktuálnosti, což může vést k rozdílům v síle paměti mezi položkami, a skutečnost, že by mohly vyřešit zapamatování pouze jedné z položek vzorku (např. zvíře si mohlo zapamatovat pouze poslední položku a pak se jí vyhněte v testu sondy).

Cílem této studie je pomoci integrovat předchozí zjištění současným hodnocením příspěvku HC, PFC a PER k paměti objednávek a položek pomocí nového paradigmatu u potkanů. Za prvé, na základě předchozích spontánních preferenčních přístupů, jsme vyvinuli úlohu, která testuje náhodné pořadí a paměť položek na zkušební sérii událostí. Je pozoruhodné, že úkol využívá dlouhou řadu událostí (5 prezentací pachu), což zmírňuje vliv efektů prvenství a aktuálnosti, snižuje možnost použití paměti pouze pro jednu položku v úsudcích o pořadí a také nabízí lepší paralelu se studiemi na lidech. Za druhé jsme provedli selektivní poškození HC, PFC nebo PER a přímo porovnali výkon každé skupiny v paměti objednávek a položek pro stejnou sérii událostí. Zjistili jsme, že náš nový přístup vedl k robustní paměti objednávek a položek a že poškození HC, PFCor PER selektivně narušilo paměť objednávek. Tato zjištění naznačují, že pro náhodné učení pořadí událostí v epizodické paměti je kritická široká síť struktur.

METODY

Předměty

Subjekty byli samci krys Long Evans o hmotnosti 250-300 g při příjezdu (n= 52). Krysy byly jednotlivě umístěny v průhledných obdélníkových polykarbonátových klecích a udržovány v cyklu světlo-tma po dobu 12 hodin (světla vypnuta v 8:00 ráno). Veškeré behaviorální testování probíhalo během tmavé fáze (aktivní perioda) za podmínek okolního červeného osvětlení. Přístup k potravě a vodě byl před operací neomezený. Po operaci byla krysám mírně omezena potrava, aby si udržely 85 procent své volné tělesné hmotnosti s volným přístupem k vodě během testování. Všechny chirurgické a behaviorální metody byly v souladu s Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití zvířat Kalifornské univerzity v Irvine.

Ordinace

Excitotoxické léze byly vytvořeny pomocí lokálních infuzí NMDA (Sigma, St. Louis, MO). Celková anestezie byla vyvolána (5 procent) a udržována isofluranem (1-2,5 procenta) smíchaným s kyslíkem (800 ml/min). Krysy byly poté umístěny do stereotaktického zařízení (Stoelting Instruments, Wood Dale, IL) a pokožka hlavy byla anestetizována Marcainem⑧ (7,5 mg/ml, {{10}},5 ml, sc). Lebka byla exponována po řezu ve střední čáře a byly provedeny úpravy, aby se zajistilo, že bregma, lambda a místa ± 0,2 mm laterálně od středové linie jsou v rovině. Během chirurgického zákroku byl všem potkanům podán glykopyrolát (0,2 mg/ml, 0,5 mg/kg, sc), aby se zabránilo respiračním potížím, a 5 ml Ringerova roztoku s 5 procenty dextrózy (sc) pro hydrataci. Po odstranění kosti překrývající místa infuze( viz níže), byl NMDA infuzován do mozku pomocí 33-stříkačky o průměru 10μ（Hamilton Company, Reno, NV）poháněné motorizovanou infuzní pumpou (World Precision Instruments, Sarasota. FL) namontovanou na rameni stereotaxického manipulátoru. Jehla zůstala v místě vpichu po dobu 5 minut po infuzi léku, aby se umožnila difúze. Dorsoventrální (DV) souřadnice byly měřeny z tvrdé pleny mozkové. Subjekty byly náhodně rozděleny do jedné z pěti skupin: HCleze, PFC léze PER léze, sekundární kontrolní léze zrakové kůry (V2) nebo falešně operované kontroly.

HC léze （n{0}）.一 Část kosti překrývající sedm míst HC infuze byla resekována bilaterálně a zůstala hydratovaná ve sterilním fyziologickém roztoku během infuzí. Část kosti byla vrácena po infuzích. Tři bilaterální dorzální místa HC byla zaměřena následovně:-2.2 A/P,±1.0M/L,-3.0DV;{{7} }.0A/P,±1,8/L,-2,8 D/V;-4,0A/P,±2,8 M/L, -2,6 D/V. Čtyři bilaterální ventrální místa HC byla cílena následovně:{19}}.8 A/P,±4,8 ML,6,5 D/V;-4,8 A/P,±4,5 M/L,{{29 }}.3D/V;-5.7 A/P,±4.9 M/L,-2.8,D/V;-5.7A/,±5.1 ML, { {41}}.8 D/V. Každé HC místo bylo infundováno 200-225 nLof NMDA (85 mM; 50 mg/ml) při 200-250 nL/min.

PFC léze (n {{0}}). – Dorzálně k místům infuze byly vyvrtány malé otvory zaměřené na prelimbickou kůru PFC. PFC byla podána bilaterální infuzí 25{{10}} nL NMDA (85 mM; 50 mg/ml) při 200 l/min (3,2 A/R, ± 0,75 M/L, -3,0 D/V z dura) podobně jako Sharpe and Killcross (2012). PER léze（n=11）. 一Byly vyvrtány oboustranně dva otvory（~-4 a-7mm A/P,~1 mm mediálně k temporálnímu hřebenu) pro kotevní šrouby k uchycení rozšiřovače tkáně (Kholodar-Smith et al.2008a) . Spánkové svaly byly poté odtaženy, aby se odhalily spánkové a temenní kosti, dokud nebyl viditelný zygomatický oblouk. Tkáňový rozšiřovač byl zajištěn mezi kotevními šrouby a vnitřním povrchem temporálních svalů. Kost překrývající temporální kortex (~2 mm x 5 mm) byla resekována a fragment byl umístěn do sterilního fyziologického roztoku. Kostní fragment byl vrácen po infuzích. Injekční stříkačka (jehla bez jádra; Hamilton Company, Reno, NV) byla umístěna pod úhlem 45 stupňů od vertikálního povrchu temporálního kortexu, s očkem jehly směřujícím ventrálně a dozadu, aby nasměrovalo tok NMDA směrem k PER. Infuze NMDA (85 mM; 50 mg/ml) byly provedeny na 7-8 místech (80 nL na infuzi; 70 nL/min; rovnoměrně rozmístěné po ~0,5 mm) pokrývající rostrokaudální rozsah PER od-2,8 až-7.6 A/Prelativeto bregma (Burwell, 2001). Bylo provedeno sedm injekcí, když byla v zamýšleném místě infuze přítomna velká krevní céva. Špička jehly byla vložena~1,5 mm do kortexu vzhledem k tvrdé pleně.

Sekundární kontroly zrakové kůry (V2) (n=8).- Dorzálně k místům infuze V2 byly vyvrtány malé otvory. Místa V2 byla infundována 250 nL NMDA (85 mM) rychlostí 200 l/min (-4) 0,5 A/P,±2,5 M/L;-0,8 D/V z dura). Falešně operované kontroly (n=10). – Tito jedinci podstoupili stejné chirurgické zákroky jako jejich skupina s odpovídajícími lézemi (počty: HC,4; PFC,4; PER,2), kromě toho, že nebyla provedena žádná infuze NMDA. Po lézích byly řezy sešity a překryty lokálním antibiotikem. Potkani byli vráceni do svých domácích klecí a sledováni, dokud se neprobudili. Jeden den po chirurgickém zákroku bylo potkanům podáno analgetikum (Flunixin, 50 mg/ml, 2,5 mg/kg sc.) a na místo řezu bylo aplikováno topické antibiotikum. Potkani se nechali zotavit z chirurgického zákroku přibližně dva týdny před behaviorálním testováním.

Pachové podněty

Odoranty byly prezentovány na 1" kulatých dřevěných korálcích (Woodworks Ltd. Haltom City, TX), každý ovoněný domácím kořením (viz Feinberg et al., 2012). Korálky byly vonné po dobu 48 hodin ve směsi písku na hřišti a jedné koření. Pro každou krysu byly pachy vybrány pseudonáhodně, aby se vyrovnaly pachy nad sériovými pozicemi napříč subjekty a aby se předešlo opakovaným pachům. Vůně byly vybrány z následujícího seznamu: nové koření, anýz, bazalka, bobkový list, kardamom, celer, skořice, hřebíček, koriandr , římský kmín, kopr, fenykl, zázvor, citronová kůra, muškátový oříšek, rozmarýn, šalvěj, majoránka, máta, pomerančová kůra, paprika, tymián a kurkuma. Písek byl zahrnut k ředění zápachu a slouží jako konzistentní vůně na pozadí pro všechny korálky Seznam pachů, stejně jako koncentrace pachů v písku, byly stanoveny empiricky pomocí nezávislé kohorty naivních krys, aby se zajistila stejná úroveň vrozené preference k jednotlivým pachům (data nejsou uvedena). Potkani byli před testováním seznámeni s dřevěnými korálky podle umístění několika neparfemovaných kuliček do jejich domácích klecí po dobu alespoň dvou dnů před behaviorálním testováním (Spinetta et al., 2008; O'Dell a kol., 2011; Feinberg a kol., 2012). Znalost dřevěných kuliček zajistila, že během testování se zvířata zaměřila na pach přidaný do experimentálních kuliček.

Testování paměti pachů a předmětů

Naivní krysy byly krátce ošetřovány po dobu 3-5 dnů po prvním příjezdu a během behaviorálních procedur. Všechna behaviorální sezení byla prováděna v domácí kleci každého jednotlivého potkana. Behaviorální testování začalo po pooperačním zotavení a probíhalo během tmavé fáze (aktivní období) za podmínek okolního červeného osvětlení. Krysy byly během behaviorálního testování udržovány na 85 procentech své hmotnosti při volném krmení, protože jsme zjistili, že pilotní krysy budou zkoumat kuličky déle a důsledněji, když budou mírně omezeny na jídlo (viz také Feinberg, et al. 2012). Hodinu před behaviorálním testováním byly krysy odstraněny násypky a láhve s vodou, aby se aklimatizovaly na testovací podmínky. Série pěti pachů byla prezentována jako sekvence událostí, přičemž každá prezentace pachu byla oddělena 20minutovým intervalem (viz obrázek IA). Každá kulička byla umístěna ve středu nejpřednějšího kvadrantu klece a doby zkoumání (definované jako čichání a šlehání do ~1 cm od kuličky) byly zaznamenány na přenosném počítači pomocí softwaru ODLog. Důležité je, že pro zajištění ekvivalentního vzorkování všech pachů v sérii, množství času stráveného vzorkováním prvního pachu (dostupného celkem 30 s) určovalo, jak dlouho měla každá krysa možnost odebírat každý následující pach (např. strávili 4 s zkoumáním zápachu A, zajistili bychom, aby každý pach B až E byl odebírán po dobu 4 s). Testovací relace, ve kterých potkan neprozkoumal žádný pach vzorku na stejné úrovni jako první pach (v časovém okně 5 minut), nebyly do analýzy zahrnuty. Aby se zabránilo křížové kontaminaci, byla každá kulička po jakékoli prezentaci během odběru vzorků nebo testování zlikvidována a experimentátor si vyměnil rukavice pokaždé, když byla použita nová kulička.

Paměť na pořadí, ve kterém byly vůně prezentovány, a paměť na pachy samotné byly poté hodnoceny pomocí sondy objednávky a sondy položky (viz obrázek IA). Sonda objednávky byla administrována 60 minut po seznamu vzorků a zahrnovala prezentaci dvou pachů ze seznamu (B vs. D). Naše pilotní práce ukázala, že krysy mohou také provádět jiné sondy řádu nad úrovní náhody (např. A vs. C, C vs. D), ale že výkon se může lišit (podobně jako zjištění ve Fortin et al., 2002). Proto zde bylo zvoleno jedno párování pachů, aby se maximalizovala statistická síla. V souladu s předchozí prací (např. Dere et al., 2005) jsme očekávali, že zvířata vyjadřují paměť na pořadí, ve kterém se události odehrály, přednostním zkoumáním položky, která se objevila dříve v sérii. Sonda paměti položky byla aplikována 20 minut po objednané sondě (~ 80 minut po seznamu vzorků) a zahrnovala prezentaci dvou pachů: střední pach ze seznamu a nový pach (C vs. X). Sonda položky je důležitou kontrolou, která zajistí, že si krysy zapamatují pachy uvedené na seznamu, což je vyjádřeno jako preferenční zkoumání nového/pachu (před dříve zjištěným pachem). Všimněte si, že jak pro objednací, tak pro položkové sondy byly kuličky umístěny do stejného kvadrantu klece jako kulička vzorku a umístěny přibližně 3 cm od sebe (viz obrázek 1B), s levou/pravou polohou vyváženou napříč krysami. Doba průzkumu pro každou perličku byla zaznamenána v ODLog.

Rychle prezentovaná podmínka sekvence

Také jsme testovali stejné skupiny v náročnější verzi paradigmatu, ve které je sekvence položek prezentována rychleji (~45 s mezi položkami). Všechny postupy, včetně retenčních intervalů před objednávkou a sondou paměti položky (60 a 80 minut, v tomto pořadí), byly jinak totožné.

Stav kontroly síly paměti

Provedli jsme kontrolní experiment v samostatné kohortě naivních zvířat, abychom zohlednili možnost, že výkon na objednané sondě jednoduše závisí na rozdílech v síle paměti vzorkovaných položek. Zde byla krysám podávána série pěti pachů, přičemž každá prezentace pachu byla oddělena 20minutovým intervalem odpovídajícím parametrům hlavního úkolu. Následně byl každé kryse prezentován pach ze sekvence spolu s novým pachem (např. As.V, VBS.W, Cvs.X, Dvs.Y, E.vs.Z). Interval mezi pachem posledního vzorku a sondový test trval 60 min. Každá krysa absolvovala pět relací (vyváženým způsobem), ve kterých byla provedena všechna srovnání (jedno srovnání na relaci). Byla testována pouze jedna sekvenční pozice na relaci, za den, s alespoň jedním dnem volna mezi testovacími sezeními. Každé sezení zahrnovalo novou nepřekrývající se sadu pachů.

Analýza dat

Hodnoty DI se pohybují od plus 100 do -100 procent. Kladné hodnoty odpovídají preferenci vůči dřívějšímu zápachu v objednané sondě a novému zápachu ve sondě položky. Negativní skóre odpovídá preferenci vůči pozdějšímu zápachu v objednané sondě nebo dříve zjištěnému zápachu v sondě položky. Skóre nula znamená žádnou preferenci pro žádný pach (náhodnost). pro analýzu dat bylo použito průměrné skóre každého potkana.

Statistiky byly provedeny pomocí Prism 8. Skupinová data byla analyzována pomocí analýzy rozptylu (ANOVA) s posthoc testy kontrolujícími počet provedených srovnání (pomocí Holm-Sidakových testů nebo Bonferroniho korekce). Skupinová data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Statistická významnost byla stanovena pomocí p<>

Histologie

Krysám byla podána nadměrná dávka pentobarbitalu sodného (Euthasol, 390 mg/ml, 150 mg/kg, ip) a byla jim transkardiálně perfundována 100 ml PBS a následně 200 ml 4% paraformaldehydu (pH 7,4; Sigma-Aldrich, St. Louis , MO), mozky byly dodatečně fixovány přes noc ve 4% paraformaldehydu a poté umístěny do 30% roztoku sacharózy pro kryoprotekci. Zmrazené mozky byly nařezány na posuvném mikrotomu (50 um; koronální orientace) na čtyři sady bezprostředně sousedících řezů pro barvení kresylovou violeťou specifické pro buněčné tělo a barvení NeuN specifické pro neurony. Přesné metody pro každé barvení jsou podrobně popsány jinde (viz doplňkové materiály od Kholodar-Smith et al., 2008a).

Analýza lézí

Pomocí softwaru Image J a Photoshopu (verze CS6) byl odhadnut rozsah neurotoxického poškození HC, PER, PFC a V2, stejně jako laterálního entorinálního kortexu, infralimbického kortexu a přední cingulární kůry, na základě sériových řezů obarvených NeuN .

VÝSLEDEK

Rozsah léze

HC léze. Subjekty s HC lézemi měly velké a úplné léze celého HC, zatímco okolní vlákna byla ušetřena (obrázek 3A). V celém rostrálně-kaudálním rozsahu mozků byl jasný nedostatek HC tkáně. Dvourozměrná analýza oblasti lézí byla provedena pomocí řezů obarvených NeuN. Celkově bylo poškozeno 85,5 ± 2,52 procent hipokampu. Nebyl žádný rozdíl v poškození levé hemisféry (85,72±2,77 procenta) ve srovnání s pravou hemisférou (85,36±2,26 procenta ;tio=0.17,p=0.87, párové vzorky t -test).

PFC léze. – Subjekty s PFC lézemi měly velké léze prelimbické kůry (PL) a v menší míře infralimbické kůry (IL; obrázek 3B). PL, IL a ACC byly zahrnuty do kvantitativní dvourozměrné analýzy plochy lézí. PL byla nejvíce poškozena (40,34 ± 3,25 procenta), následovala IL (18,23 ± 5,85 procenta) a velmi malé poškození bylo u ACC (5,03 ± 1,60 procenta). Rozsah poškození PL je podobný tomu, co bylo dříve zjištěno u podobné techniky lézí (DeVito & Eichenbaum, 2011), avšak rozsah poškození extra-PL oblastí byl v této studii značně snížen. Navzdory menšímu poškození mimo oblast tedy jakékoli účinky těchto lézí pravděpodobně primárně odrážejí funkci PL. Pomocí t-testu párových vzorků jsme nezjistili žádný významný rozdíl v poškození PL levé hemisféry (37,96±3,55 procenta) ve srovnání s pravou hemisférou (42,72±3.86 procent ;t{{26} }.40,p=0.09).

PER léze.-U PER lézí jedinců bylo poškození soustředěno do kortikální tkáně obklopující střední zadní rýhový sulcus (obrázek 3C) s 58,32 ± 4,27 procenty plného rozsahu PER lézí (A/P-2). 0 až -7.2). K většině poškození došlo v zadním PER(A/P-4.{12}} až-7.2), kde bylo celkové průměrné poškození 80,23±4,54 procenta. Pomocí t-testu párových vzorků jsme zjistili, že neexistuje žádný rozdíl v poškození zadní PER v levé hemisféře (76,34±5,30 procenta) ve srovnání s pravou hemisférou (84,13±5,08 procenta;t10=-1,62 ,p=0.14). Došlo také k menšímu poškození části laterálního entorinálního kortexu (LEC) umístěné bezprostředně ventrálně k oblasti 35 PER (36,71±4,21 procenta). Rozsah poškození je podobný tomu, co bylo dříve zjištěno při použití této techniky lézí (Kholodar-Smith et al.,2008a; Feinberg et al.2012).

Léze V2. Krysy s lézí V2 sloužily jako negativní kontrola, aby se prokázalo, že poškození kůry překrývající HC v oblasti, která dříve nebyla spojena se sekvenční pamětí, neovlivňuje výkon našeho úkolu. Poškození bylo z velké části omezeno na V2, s celkovým poškozením 40,38 ± 3,27 procenta u potkanů. U čtyř potkanů ​​došlo k malému poškození CAl jednostranně a u dvou potkanů ​​k malému poškození CAL bilaterálně. Nezdálo se však, že by toto poškození ovlivnilo jejich výkon na sondách objednávek ani položek.

Falešné léze. Falešné krysy HC, PFC a PER (n=4, 4 a 2, v tomto pořadí) nevykazovaly žádné znatelné známky poškození mozku, jak bylo hodnoceno pomocí histologických barvení NeuN. Takže simulace byly interpretovány jako mající plné a normální nervové schopnosti během všech behaviorálních experimentů a byly kombinovány pro následné analýzy.

Paměť objednávek a položek

Jak se očekávalo, výkonnostní úrovně byly stejně vysoké u falešně operovaných zvířat a V2. zvířata s lézemi, takže jsme je spojili a vytvořili kontrolní skupinu.

Výkon na objednávkových paměťových sondách.

Jednocestná ANOVA byla použita ke zkoumání rozdílů v diskriminačním indexu (DI) na objednané sondě napříč skupinami lézí. Byl zaznamenán významný hlavní účinek skupiny (Fy,48=5.084, p=0.0039) a posthoc srovnání ukázala, že kontrolní skupina se významně lišila od skupin HC, PFC a PER (Holm -Sidak testuje p<0.05).one-sample-tests showed="" that="" the="" control="" group="" was="" significantly="" different="" from="" chance(di="0;" t17=""><0.0001),but the="" lesioned="" groups="" were="" not(hc:tu0="0.8667,p=0.4064;PFC:to" =1.941,p="0.0783;PER:t10=1.310,p=0.2196)." to="" limit="" the="" number="" of="" posthoc="" tests,="" pairwise="" comparisons="" among="" hc,="" pfc,="" and="" per="" groups="" were="" not="" directly="" tested;="" instead,="" group="" differences="" were="" examined="" using="" a="" group="" x="" probe="" interaction="" (see="" below).="" see="" figure="" 2a="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" these="">

Výkon na paměťových sondách položek.

A one-way ANOVA on item memory performance did not show a significant difference across groups(Group effect: F3.48= 1.167,p=0.3320), and no group was significantly different from the control group (Holm-Sidak tests p's>0.05). Pomocí jednovzorkových t-testů proti náhodě (DI=0) všechny skupiny prokázaly významnou preferenci pro nový zápach (zápach X) ve srovnání s vůní prezentovanou v sekvenci (zápachy; všechna p<0.001). see="" figure="" 2b="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" these="">

Přímé porovnání objednávek a položek.

K porovnání skupinového výkonu napříč typy sond byla použita dvoucestná ANOVA s opakovanými měřeními. Zjistili jsme významné hlavní účinky skupin (F,48=5.80,p=0.002) a Probe (F1.48=32.55,p<0.001).however, the="" group="" x="" probe="" interaction="" did="" not="" reach="" significance="" (f3,48="1.96," p="0.133)indicating" that="" the="" pattern="" of="" results="" did="" not="" significantly="" differ="" across="" lesion="" groups,="" post-hoc="" comparisons="" revealed="" that="" di="" scores="" were="" significantly="" lower="" on="" the="" order="" probes="" relative="" to="" the="" item="" probes="" for="" the="" hc,="" pfc="" and="" per="" groups="" (bonferroni-corrected="" one-sample="" t-tests;=""><0.017), whereas="" the="" control="" group="" showed="" no="" significant="" difference.="" these="" findings="" strongly="" suggest="" that="" the="" deficit="" observed="" is="" selective="" to="" order="" memory="" and="" cannot="" be="" attributed="" to="" a="" secondary="" impairment="" in="" item="" memory.="" these="" data="" are="" displayed="" in="" the="" form="" of="" difference="" scores="" (dlorder-ditem)="" in="" figure="">

Kontrolní podmínky a analýzy

Rychlá prezentace seznamu vzorků.

Abychom oddělili výkon mezi skupinami, testovali jsme stejná zvířata na náročnější verzi úkolu, ve které byl seznam vzorků prezentován rychleji (~45 s mezi položkami). Zjistili jsme, že všechny skupiny vykazovaly silnou paměť položek (nevýznamný efekt skupiny: F3,41=1.48,p=0.24; všechny skupiny vykazují jednovzorkové t-testy výše 0 ,p je<0.05).however, none="" of="" the="" groups,="" including="" the="" control="" group,="" showed="" clear="" order="" memory="" under="" this="" condition(non-significant="" group="" effect:="" f,41="1.09,p=0.365;" mean="" di="" for="" all=""><0.2), which="" makes="" it="" difficult="" to="" further="" interpret="" these="">

Síla paměti.

We ran a control experiment in a separate cohort of naive animals to determine whether the memory strength of the different sample odors was significantly different at the time of the ordered probe. We found no significant differences in item memory across odor positions (F4.20=0.88,p=0.49), suggesting that all positions are remembered equally well (i.e., they have the same memory strength). Furthermore, all odor positions were significantly greater than chance exploration times for the novel odor(DI>0). Je tedy vysoce nepravděpodobné, že by síla paměti mohla v našem paradigmatu vysvětlovat úsudky paměti pořadí.

Odběr vzorků zápachu.

První pachová perlička fáze vzorku byla krysám k dispozici celkem 30 s. Celkově ji potkani aktivně zkoumali po dobu 4,14 ± 1,49 s (průměr ± 1 std; průměr za 3 sezení u každého subjektu). Tato doba odběru vzorků byla porovnána napříč sezeními a skupinami s lézemi pomocí ANOVA s opakovanými měřeními. Zjistili jsme, že krysy zkrátily dobu odběru vzorků během tří sezení (průměrně 4,82 s, 4,67 s a 4,13 s; významný hlavní účinek doby odběru; F,.{14}}.06,s<0.001), but="" that="" this="" effect="" did="" not="" differ="" across="" groups(non-significant="" session="" lesion="" interaction;f9,138="1.18,p=0.31).There" was="" a="" significant="" main="" effect="" of="" group="" (f146="3.339," p="0.027)," though="" the="" means="" were="" very="" close(3.85s,4.39s,="" 5.00s,="" and="" 3.88s="" for="" controls,="" hc,="" pfc,="" and="" per,="" respectively).="" a="" post-hoc="" holm-sidak="" test="" revealed="" slightly="" longer="" sample="" times="" in="" pfc="" animals="" relative="" to="" controls=""><0.037), but="" no="" other="" group="" differences="" were="" observed(p's="">0.05). Je nepravděpodobné, že by tento malý skupinový rozdíl naše výsledky zmátl; ačkoli to mohlo vést k mírně vyššímu výkonu paměti řádu a položek ve skupině PFC. Důležité je, že tento účinek je v podstatě zohledněn rozdílovými skóre znázorněnými na obr. 2C. Klíčovou kontrolou je, že pro každé zvíře jsme srovnali čas vyšetřování v rámci prezentace sekvence.

Diskuse

Pomocí nového paradigmatu náhodné paměti jsme hodnotili účinky selektivního poškození HC, PFC nebo PER na paměť objednávek a položek. Zjistili jsme, že každá ze tří skupin s lézí byla významně narušena v paměti pořadí ve srovnání s kontrolami a že deficity byly srovnatelné velikosti. Důležité je také zjištění, že všechny skupiny s lézemi vykazovaly normální paměť položek, což naznačuje, že jejich schopnost pamatovat si prezentované položky zůstala nedotčena (tj. jejich deficit byl specifický pro neschopnost zapamatovat si jejich pořadí). Zatímco se dříve ukázalo, že tyto struktury jsou důležité pro různé formy časové paměti, existovaly značné rozdíly v požadavcích na úkoly napříč studiemi, a proto bylo potřeba posoudit jejich přínos v rámci stejného experimentu. Tato studie pomáhá integrovat tato předchozí zjištění tím, že prokazuje, že HC, PFC a PEReach hrají klíčovou roli při zapamatování jedinečných sekvencí událostí, což je základní rys epizodické paměti.

Integrace klíčových vlastností epizodické paměti do jediného paradigmatu

Epizodická paměť zahrnuje zapamatování si řady zážitků našeho každodenního života, které jsou náhodně zakódovány a vyhledány podle potřeby (Tulving, 1972; Allen & Fortin, 2013). Proto je při modelování epizodické paměti u zvířat důležité zachytit náhodnou povahu epizodického kódování (např. Dere et al., 2005; Zhou et al., 2012). Abychom tak učinili, vyvinuli jsme náhodnou verzi paradigmatu. dříve používané k posouzení pořadí a paměti položek, ve kterých byla zvířata výslovně odměňována během vzorkování položek a testů sond (Fortin et al, 2002).

Toto paradigma přesahuje předchozí snahy tím, že do jediného přístupu integruje klíčové rysy jiných modelů epizodické paměti (např. Chiba a kol., 1994; Mitchell & Laiacona, 1998; Fortin a kol., 2002; Kesner a kol. kol., 2002; Hannesson a kol., 2004a,b; Babb a Crystal, 2006; DeVito & Eichenbaum, 2011; Barker & Warburton, 2011; Warburton a kol., 2013). Zaprvé, abychom se zaměřili na náhodné kódování a vyhledávání, prezentace pachů nebyly odměňovány během seznamu vzorků nebo testů sondy. Místo toho jsme využili tendenci hlodavců přednostně zkoumat nové podněty k hodnocení paměti, což je přístup, který vyvinuli a ověřili ostatní (viz Ennaceur, 2010). Přesněji, když byly předloženy dva podněty, zjistili jsme, že kontrolní zvířata přednostně zkoumala dřívější ze dvou položek na objednané sondě a nový zápach na sondě položky, který jsme použili jako indikátor pořadí a paměti položky. Věříme, že preference dřívějšího zápachu je etologicky relevantní strategií související s optimálním chováním při hledání potravy (např. potkan s větší pravděpodobností najde potravu nebo vodu doplněnou dříve než později, protože uplynulo více času; viz Allen & Fortin ,2013). Toto chování by mohlo být podpořeno přidružením konkrétních položek k jejich sekvenční pozici nebo reprezentaci časového kontextu nebo prostřednictvím sekvenčně spárovaných společníků (např. Allen et al. 2014. Jayachandran et al, 2019; Long & Kahana, 2019). Za druhé, aby se kódování zaměřilo na čichový podnět, byly pachy prezentovány na dřevěných korálcích, které jsou jinak identické ve všech ostatních smyslových atributech, a každý korálek byl použit pouze jednou, aby se zabránilo kontaminaci zvířete nebo podestýlkou ​​(viz Feinberg, et al., 2012 ; O'Dell, et al. 2012; Spinetta, et al., 2008). Kromě toho byly všechny kuličky prezentovány na stejném místě a konfigurace levo-pravé na testech sondy byly vyváženy napříč zvířaty a relacemi, aby prostorové umístění irelevantní pro výkon. Za třetí, abychom kontrolovali možnost, že by paměť objednávek mohla být jednoduše způsobena rozdíly v síle paměti mezi těmito dvěma položkami, zajistili jsme, aby doba vyšetřování byla ekvivalentní napříč pachy (pro každý seznam a zvíře). Nakonec jsme použili delší seznam vzorků než jiná paradigmata (v tomto případě 5 prezentací zápachu). Použití pěti položek ve vzorovém seznamu nám umožnilo zaměřit naše objednávky a sondy položek na prostřední tři položky, u kterých se v našem kontrolním experimentu ukázalo, že mají srovnatelnou paměťovou kapacitu (Dl ~0,6), a vyhnout se sondám objednávek zahrnujících první nebo poslední ukázkové položky (které mohou být zkresleny efekty přednosti nebo aktuálnosti).

Jedním neočekávaným behaviorálním zjištěním bylo, že rychlá verze úkolu (~45 s mezi položkami během vzorkování) neukázala spolehlivou paměť objednávek v kontrolách. Zatímco naše pilotní práce ukázala, že tato rychlá verze by mohla vést k detekovatelné paměti objednávek, kontrolní skupina v této studii se významně nelišila od náhody. Hlubší pohled na výkonnost jednotlivých kontrolních zvířat naznačuje, že podskupina se chovala jako naše pilotní zvířata, zatímco zbytek neprokázal účinek, což vedlo ke zvýšené variabilitě. Budoucí použití této úlohy může těžit ze systematického střídání délek intervalů, které pomohou objasnit vztah mezi zpožděním položek a spolehlivostí/sílou výsledné paměti objednávek.

Příspěvky HC, PFC a PER do paměti pro pořadí událostí

V objednané sondě jsme zjistili, že kontroly, skupina kombinující simulace HC, PFC a PER a také léze V2 (negativní kontrola), prokázaly významnou preferenci pro zápach, který se vyskytoval dříve v sekvenci (zápach B), což naznačuje že mají neporušenou paměť na pořadí událostí. Všechny krysy, kterým byla způsobena léze buď HC, PFC nebo PER, však nevykazovaly žádnou preferenci pro pach B nebo D, a proto žádný důkaz paměti objednávky. Na sondě položek všechny skupiny prokázaly významnou preferenci pro nový zápach (zápach X), což naznačuje, že mají srovnatelnou paměť pro položky uvedené na seznamu, a že tedy nedostatek paměti objednávky nebyl pouze důsledkem selhání. zapamatovat si prezentované pachy. Toto zjištění ušetřené paměti položky po poškození HC, PFC nebo PER je v souladu s předchozími zprávami. Například již dříve bylo prokázáno, že HC nebo PFC nejsou nezbytné pro diskriminaci novosti (Feinberg a kol., 2012; Barker, a kol., 2007; Fortin, a kol., 2002; Mitchell & Laicona, 1998). Kromě toho v souvisejícím úkolu léze PER nevedly k deficitu paměti rozpoznávání pachů pro typ zde použitých pachů (zápachy z domácnosti) v žádném z testovaných intervalů zadržení (5 minut až 48 hodin), ačkoli rozpoznávání sociálních/pachů byla narušena v dlouhých retenčních intervalech (Feinberg, et al.2012).

Naše zjištění jsou v souladu s předchozími studiemi lézí u hlodavců, které implikovaly HC v paměti pořadí pomocí různých paradigmat (Kesner & Novak, 1982; Chiba a kol. 1994; Mitchell & Laiacona, 1998; Fortin, a kol., 2002; Kesner , et al. 2002; DeVito & Eichenbaum, 201l; Barker & Warburton, 2011; 2013) as neuropsychologickými a neurozobrazovacími studiemi u lidí (Cabeza et al, 1997; Hayes et al, 2004; Kumaran & Lehn, 2006; ,2009;Ross et al.,2009;Ekstrom et al.2011;Tubridy &Davachi,2011;Hsieh et al.,2014;Davachi& Dubrow,2015;Reederset al.,2018; pro přehled Long & Kahana,2019). Naše zjištění vycházejí z těchto předchozích studií tím, že ukazují, že HC hraje klíčovou roli v inceidentalencoding a získávání sekvencí non-prostorových epizod, po kontrole matoucího vlivu efektů prvenství a aktuálnosti. Zbývá určit, jak HC tuto funkci vykonává. Ukázalo se, že HC neurony poskytují informace o časovém kontextu, ve kterém k událostem došlo (např. Manns et al., 2007; MacDonald et al., 2013; Allen et al. 2016) a předpokládá se, že HC používá tento typ časoprostorového signálu utvářet epizodické vzpomínky vázáním informací o jednotlivých událostech s prostorovými a časovými souvislostmi, ve kterých k nim došlo (Allen & Fortin, 2013; Knierim, 2015; Eichenbaum, 2017). Objasnění tohoto procesu bude vyžadovat záznam elektrofyziologické aktivity během náhodného kódování a vyhledávání sekvence událostí.

PFC se také podílí na paměti pořadí v úkolech prostorové a objektové diskriminace u hlodavců (Barker a kol., 2007; Hannesson a kol., 2004a, b; DeVito & Eichenbaum, 2011; Mitchell & Laicona, 1998; Fuster, 2001) a lidí (Staresina & Davachi, 2009; Jenkins & Ranganath, 2010; Tubridy & Davachi, 2011; Allen & Fortin, 2013). Naše data jsou v souladu s tím a přispívají k rostoucímu množství důkazů, že PFC je nezbytné pro nahodilou paměť pro sekvence neprostorové epizody. Nedávná zjištění naznačují, že PFC se může podílet na řízení toho, jak jsou sekvence získávány z úložišť paměti HC v závislosti na aktuálních požadavcích na chování (Jayachandran et al, 2019: Schmidt et al. 2019). Budoucí studie využívající přechodné inaktivace v tomto úkolu mohou být užitečné při objasnění specifické role PFC při kódování a získávání sekvencí jedinečných událostí.

Ačkoli bylo prokázáno, že umlčení medailových PFC terminálů v PER narušuje sekvenční paměť (Jayachandran et al., 2019), toto je první zpráva, která ukazuje, že léze PER způsobují deficit specifický pro paměť náhodných pořadí. Tento účinek je v souladu s předchozími důkazy, že PER se podílí na přemostění časových vzpomínek při podmiňování stopového strachu a sjednocování nespojitých stimulů (Kholodar-Smith, et al., 2008a,b; Navaroli, 2012). Navíc Barker a kol. (2007) uvedli, že krysy s lézemi PER mají deficity v paměti pořadí, ale selektivita tohoto účinku byla nejasná, protože také zjistili významné deficity v rozpoznávací paměti. Existuje také obava, že jejich studie se spoléhala na rozpoznávání objektů, které je citlivé na léze PER (např. Murray & Richmond. 2001; Bussey et al., 2005), a že jejich sekvence se skládala pouze ze dvou položek, které lze zaměnit efekty prvenství a aktuálnosti. Zde pozorované efekty PER objasňují, že role PER v paměti přesahuje vnímání objektů s mnoha funkcemi tím, že ukazuje, že účinky lézí mohou být specifické pro paměť pro pořadí, je známo, že PER se podílí na modulaci toku informací mezi HC, PFC a entorinální oblasti (např. Paz et al 2007), a tato modulační role může být klíčová pro kódování a vyhledávání sekvencí událostí.

Závěry

Vyvinuli jsme nové paradigma paměti nahodilých objednávek a položek, které integruje klíčové funkce z jiných modelů epizodické paměti, a ukázali jsme, že HC, PFC a PER jsou pro paměť objednávek kritické. I když se jedná o důležitá zjištění, hlavním nedostatkem studie je to, že vzor výsledků se u všech tří skupin lézí významně nelišil, a proto neosvětlil příslušné příspěvky těchto struktur. Naše neschopnost najít rozdíly mezi skupinami lézí byla primárně způsobena experimentálním designem, který zahrnoval mnoho skupin. Zatímco tento design nám umožnil testovat roli každé struktury v rámci stejného experimentu (klíčový cíl studie), párová srovnání mezi skupinami s lézí byla nepraktická kvůli potřebě kontrolovat počet provedených posthoc testů. Doufali jsme, že rychle představená verze tohoto úkolu by mohla pomoci odlišit role těchto struktur napříč časovými škálami, ale bohužel tato alternativní verze nevedla k robustní paměti objednávek v kontrolních subjektech. Dalším faktorem, který také mohl přispět k nedostatečnému rozlišení mezi účinky HC, PFC a PER, je naše použití předtréninkových lézí, které ovlivnily všechny fáze paměti (tj. kódování konsolidace a vyhledávání). Budoucí studie využívající přechodné inaktivace mohou být vhodnější pro odhalení různých poruch tím, že poskytnou příležitost zaměřit se na konkrétní fázi Společně tato zjištění naznačují, že HC, PFC a PER jsou součástí široké sítě struktur nezbytných pro náhodné učení pořadí. událostí v epizodické paměti. Objasnění specifické povahy jejich příslušných příspěvků, stejně jako jejich základních nervových mechanismů, bude vyžadovat další zkoumání.