Část 2: Mapování epigenomické a transkriptomické souhry během formování paměti a vzpomínání v souboru Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
Odlišné transkripční programy engramových souborů během vytváření a vybavování paměti
Abychom objasnili, jak změny v dostupnosti chromatinu a interakce promotor-enhancer ovlivňují expresi genů, provedli jsme jadernou RNA-seq (nRNA-seq) ze všech neuronových subpopulací. Naše analýza diferenciálně exprimovaného genu (DEG) odhalila nízké množství změn v časné fázi ve srovnání s neurony v bazálním stavu (Basal vs. Early, 88°, obr. 5a, doplňková tabulka 8). To bylo zvláště neočekávané vzhledem k rozsáhlému stupni organizace chromatinu pozorovanému v tomto časovém bodě (obr. 2a). Naproti tomu neurony z pozdní fáze vykazovaly vyšší počet stupňů, přestože v těchto časových bodech byla větší podobnost v dostupnosti chromatinu (obr. 5a). Abychom potvrdili naše transkripční nálezy, porovnali jsme naše výsledky s dříve publikovanými údaji aktivovaných granulárních buněk DG 1 hodinu po nové expozici32, 24 hodin po FS20 a po prodloužené stimulaci (6 hodin) myší kultivovaných kortikálních neuronů pomocí KCl33 (rozšířená data obr. 4a ). Je zajímavé, že ačkoli toto srovnání odhalilo významné překrývání mezi upregulovanými geny z našeho souboru dat a 1 hodinu po nové expozici32 (P=0.006) nebo 24 hodin po FS20 (P=0.0005), nepozorovali žádné významné překrývání s geny, které byly up-regulovány v reaktivovaných buňkách engram a dalších souborech dat, což potvrzuje jedinečnou transkripční krajinu reaktivovaných buněk engram během vyvolání.
Klikněte naVýhody a vedlejší účinky Cistanche pro paměť
Dále jsme využili dříve publikovaný výpočetní přístup34, který měří změny ve čtení zralé RNA (exony) a pre-mRNA (introny). Jak se očekávalo, exonické změny korelují s globálními transkripčními změnami měřenými pomocí DEseq2 (čtení exonu i intronu) napříč všemiPaměťfáze (Rozšířená data Obr. 4b). Nicméně měření poměrů exon/intron ukazuje, že změněné transkripty (up-a down-regulované) běhemPaměťkonsolidace (brzy vs. pozdní) jsou převážně řízeny intronovými čteními, což naznačuje, že tento transkripční profil většinou odráží nezralé transkripty, které vyžadují další kroky zpracování RNA (rozšířená data obr. 4c). Naproti tomu up-regulované geny během vyvolání (pozdní vs. reaktivované) jsou převážně řízeny exonickými transkripty, což odráží zralejší stav RNA (rozšířená data obr. 4c).
Abychom sladili rozpor mezi pozorovanými změnami chromatinu a transkripčním stavem v každé subpopulaci, provedli jsme korelační analýzu DAR a DEG, identifikovaných během různých časových bodůPaměťformace a odvolání. Pro tuto analýzu byly DAR na nekódujících oblastech (intergenních a intronických) mapovány na jejich příslušné promotory s využitím našich dat pc-HiC. Celkově jsme zjistili nízkou korelaci (P=2,81 × 10−2) mezi rozdílnou dostupností chromatinu a změnami genové exprese, ke kterým dochází v časné fázi (Basal vs. Early, Extended Data Obr. 4d). Tyto výsledky byly v souladu s předchozí prací21, která uvádí, že modifikace histonů mají malou korelaci s transkripčními změnami běhemPaměťzískávání. Neočekávaně jsme pozorovali silnější překrývání a podobnost mezi změnami chromatinu, ke kterým dochází běhemPaměťkódování (brzy) se změněnou transkripční krajinou během konsolidace paměti (pozdní) a reaktivovanými engramovými neurony (P {{0}}.13 × 10−8, 2,42 × 10 −7, resp. Rozšířená data obr. 4d). Abychom tuto analýzu dále potvrdili, provedli jsme Pearsonovu korelaci mezi hodnotami log2FC z DAR a hodnotami log2FC DEG, které byly anotovány do této oblasti (intergenní oblasti byly mapovány prostřednictvím datové sady pc-HiC, rozšířená data, obr. 4e, doplňková tabulka 9) . Naše analýza odhalila, že časné změny chromatinu (Basal vs. Early, DARs) významně korelovaly s down-regulací genů v pozdní fázi (Early vs. Late, Extended Data Obr. 4e, šedá čára, r=− 0.14, p < 0.0001).="" navíc="" po="" analýze="" stupňů="" na="" intronická="" a="" exonická="" čtení="" jsme="" pozorovali,="" že="" korelace="" byla="" z="" velké="" části="" řízena="" intronickými="" čteními="" (introny="" r="−0,21," p="">< 0,0001,="" exony="" r="−0,09," p="" {{="" 29}}.02).="" naproti="" tomu="" rané="" změny="" chromatinu="" (basal="" vs.="" early,="" dars)="" ukázaly="" pozitivní="" korelaci="" s="" deg="" z="" reaktivovaných="" buněk,="" která="" byla="" převážně="" řízena="" exonickými="" čteními="" (introny="" r="−0,007," p="0,73" ,="" exony="" r="0.11," p="0.04)." tato="" data="" poskytují="" další="" důkaz="" pro="" primární="" aktivaci="" a="" transkripční="" zpoždění,="" ve="" kterých="" změny="" chromatinu,="" ke="" kterým="" dochází="" během="" časné="" fáze,="" umožňují="" transkripční="" změny="" pozorované="" v="" pozdějším="" časovém="" bodě,="" primárně="" v="" reaktivovaných="" buňkách="">
Paměťkódování, konsolidace a vyvolání je dynamický proces vyžadující několik vln opožděné genové transkripce12,32,33. Proto identifikovat různé transkripční programy napříč všemiPaměťfáze jsme hodnotili expresi každého genu od neaktivovaných neuronů (Basal) přes časné (Activated early), pozdní (Activated-Late) a neurony, které byly reaktivovány během vyvolání (Reactivated). Všechny diferenciálně exprimované geny (DEGs, n=1095), které splňovaly hraniční kritéria (p-hodnota < 0.01,="" log2(násobná="" změna)=""> 1), byly nestranně shlukovány (k-střední hodnota) (obr. 5b, c). Byly identifikovány čtyři hlavní shluky; i) 260 genů
které byly down-regulovány v pozdní fázi (Dw-late cluster), ii) 207 genů, které byly up-regulovány v pozdní fázi (Up-late cluster), iii) 186 genů, které byly up-regulovány v časné fázi, a byly udržovány po celou dobuPaměťfáze (stabilní klastr) a iv) 438 genů
které byly jedinečně up-regulovány v reaktivovaných neuronech běhemPaměťodvolání (Reaktivační cluster). Podobně jako v našem párovém srovnání transkripční změny v aktivovaných-pozdních neuronech korelovaly výše s intronickými čteními a transkripční krajina reaktivovaných neuronů se zdá být zralejší a představovala vyšší korelaci s exonickými čteními (rozšířená data obr. 5a,b).
Dále jsme provedli analýzu genové ontologie (GO) pro každý shluk (obr. 5d), abychom identifikovali obohacené dráhy v různýchPaměťfáze. Transkripční signatura pozdního klastru byla obohacena o geny zapojené do regulace „funkce inhibiční synapse“, u kterých bylo prokázáno, že hrají roli v neuronální excitabilitě35,36 (obr. 5e). V klastru Up-late jsme pozorovali sady genů podílejících se na pozitivní nebo negativní regulaci transkripce, jako je rodina onkogenů muskuloaponeurotického fibrosarkomu v-maf, protein B (Mafb), rodina hlemýžďů zinkový prst 2 (Snai2) a RE{{ 8}} umlčující transkripční faktor (Rest) (obr. 5e). Je zajímavé, že jsme zjistili, že 15 procent (32/207) promotoru genu v Dw – pozdním clusteru obsahuje buď Snai2 (p-hodnota - 1 × 10−9) nebo Rest (p-hodnota - 1 × 10−3) vazebná místa. Tato dynamika transkripčních regulátorů ukazuje na možnou souhru mezi shluky Dw- a Up-late. Pozoruhodně bylo zjištěno, že funkčně odlišné neuronální soubory existují v jednomPaměťengram, ve kterém soubory závislé na onkogenu osteosarkomu FBJ (Fos) a neuronálním proteinu 4 domény PAS (Npas4) podléhají odlišným synaptickým modifikacím po CFC a řídí chování řízené pamětí v opačných směrech37. Bylo prokázáno, že excitační synaptické vstupy podporujíPaměťgeneralizační a inhibiční podporují paměťovou diskriminaci. Ačkoli tyto odlišné soubory nemohly být v současné studii rozlišeny, tato pozorování by mohla vysvětlit obousměrnou expresi pozitivních nebo negativních regulátorů transkripce, stejně jako up a down-regulované geny zapojené do neuronální excitability.
Cistanche může zlepšit paměť
Stable-cluster byl většinou obohacen o transkripty zapojené do cytoskeletu, remodelace axonů a závislých na hipokampu.Paměť38, včetně lehkých a těžkých polypeptidových neurofilament (Neal, Neath) a myosinu, těžkého polypeptidu 10, nesvalového (Myh10) (obr. 5d,e). Pro vizualizaci a sledování změn souvisejících s cytoskeletem na dendritech a trnech byl reportér loop-eYFP (závislý na TAM) dodán adeno-asociovaným virem (AAV) do myší DG ofArc-CreERT2 (rozšířená data obr. 6a). Naše data odhalila, že aktivované-pozdní a reaktivované neurony obsahují výrazně vyšší počet hub a tenkých trnů (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">
Jedinečný transkripční podpis reaktivovaných engram neuronů (Reactivation cluster) byl většinou charakterizován kategoriemi 'RNA transport/vazba' a 'proteinové translační mechanismy' (obr. 5d). Tento transkripční program zahrnuje zvýšenou expresi členů rodiny kinesinů 5a a c (Kif5a, Kif5c), iniciaci eukaryotické translace (Eif) faktor 3 podjednotku A, D (3a, 3d), faktor 4 podjednotku H (Eif4h), faktor 5 podjednotku A ( Eif5a) a ribozomální protein (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (obr. 5d, e), o kterých se dříve uvádělo, že hrají klíčovou roli při transportu mRNA do synaptického kompartmentu a autonomní kontrole lokální translace39 . Abychom dále potvrdili tato zjištění na translační úrovni, měřili jsme proteinovou expresi a lokalizaci tří členů z rodiny Eif pomocí imunohistochemie (IHC). Již dříve bylo hlášeno, že členové Serval Eif se specificky podílejí na translaci v synaptických kompartmentech39, a proto jsme samostatně analyzovali expresi proteinů na soma a dendritových šachtách aktivovaných neuronů (obr. 5f). Reaktivované neurony měly vyšší expresi Eif3e proteinů v soma ve srovnání s aktivovanými-časnými a pozdními neurony (rozšířená data obr. 6c). Naproti tomu Eif4e byl významně hojnější v šachtách reaktivovaných neuronů ve srovnání s aktivovanými-časnými a pozdními neurony (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">Paměť.
Větší translační aparát usnadňuje změny tvaru, velikosti a počtu páteře, což vede ke zvýšené synaptické plasticitě39–41. Kromě toho trny s větším průměrem hlavy pravděpodobně obsahují ribozomy pro lokální syntézu proteinů, větší postsynaptické hustoty, které ukotvují více AMPA glutamátových receptorů a činí tyto synapse funkčně silnější41,42. V souladu s těmito zprávami vykazovaly reaktivované neurony vyšší počet zvětšených průměrů hlavy (51 procent ze všech hřibovitých trnů) ve srovnání se skupinou aktivovaných pozdě (18 procent) (rozšířená data, obr. 6d). Kromě toho jsme zjistili významné zvýšení hladin ionotropního glutamátového receptoru 1, mRNA AMPA1 (Gria1) (rozšířená data, obr. 6e) a proteinu Gria1 pouze v dendritických šachtách reaktivovaných neuronů ve srovnání s aktivovanými - časnými a - pozdní neurony (obr. 5g). Souhrnně tato data podporují hypotézu, že různé časově oddělené transkripční programy jsou synchronizovány, aby byla zachována neuronální excitabilita, strukturální změny, translace proteinů a synaptická plasticita po celou dobu životnosti engramového souboru.
Regulační prvky s opačnými transkripčními účinky interagují s promotory, jak paměť postupuje od kódování k vybavování
Dále jsme se zeptali, jak by mohla interakce promotor-zesilovač na dlouhé vzdálenosti a stav chromatinu vést ke koordinovaným změnám genové exprese pozorovaným v každém z transkripčních shluků. Abychom toho dosáhli, měřili jsme dostupnost chromatinu přes zesilovače, které interagují s promotory, z každého transkripčního shluku (obr. 6a–c). Kromě toho bylo interakční skóre těchto zesilovačů vyneseno společně proti dostupnosti chromatinu a jejich příslušné genové expresi (doplňková tabulka 10).
Cistanche může zlepšit paměť
Celkově všechny shluky vykazovaly významný přírůstkový nárůst dostupnosti chromatinu na zesilovačích. Důležité je, že jsme zjistili, že dostupnost chromatinu nastala před 3D - přeskupením chromatinu a změnou genové exprese, což poskytuje další podporu transkripčního zpoždění (obr. 6a–c, rozšířená data obr. 7a, b). Konkrétně v reaktivačním clusteru naše analýza odhalila dvoufázový proces, ve kterém raná fázePaměťtvorba vede k primingu, kdy se zesilovače stávají dostupnějšími, ale nevykazují očekávané změny v genové expresi. Reaktivace engramových buněk byla spojena s reorganizací interakcí promotor-enhancer, kdy aktivované zesilovače byly uvedeny do kontaktu s jejich příslušnými promotory ve vyšší frekvenci a byl pozorován transkripční nárůst (obr. 6a–c). Cistanche se může zlepšitPaměť.
Dříve bylo navrženo, že interakce promotor-enhancer jsou vysoce dynamické a interakce s odlišnými kombinatorickými enhancery vedou ke směrové změně v genové expresi v závislosti na tom, zda enhancer obsahuje motivy represoru nebo aktivátoru14, 18. Cistanche může zlepšitPaměť.
Abychom to dále prozkoumali, použili jsme chrom k nezaujaté segregaci genomu do různých stavů definovaných umístěním motivu, které vážou buď transkripční aktivátory1 (časná růstová odpověď 1 (Egr1), Ap1), transkripční represory43,44 (pleiomorfní adenom podobný genu 1 (Plagl1) ), hypermethylované u rakoviny 2 (Hic2), methyl CpG vazebný protein 2 (Mecp2), Snai2 a Rest,) nebo TF, které obousměrně ovlivňují transkripci a podílejí se na architektuře 3D genomu25,44,45 (CCCTC-binding factor ( CTCF), E2F transkripční faktor 1 (E2f), Yy1). Tím byly identifikovány tři různé kombinatorické stavy TF-vazebných míst (silný represor, bivalentní a silný aktivátor, obr. 6d,e). Je zajímavé, že shluk s redukcí genové exprese (Dw-pozdní) vykazoval progresivně se zvyšující korelaci od kódování k vyhledávání se zesilovači, které obsahují transkripční represory a bivalentní motivy (obr. 6d, horní teplotní mapa; rozšířená data obr. 7c, d). Tato data naznačují, že navzdory pozorované dostupnosti chromatinu jsou geny down-regulovány v důsledku represe, která se objevuje z těchto regulačních prvků. Cistanche se může zlepšitPaměť.
Naproti tomu v klastru reaktivace jsme pozorovali přírůstkové obohacení pro enhancery, které obsahují transkripční aktivátory spolu s motivy, které ukotvují smyčkové struktury (rozšířená data obr. 7c, d). Zdá se tedy, že při neuronální aktivitě může několik promotorů využívat širokou škálu různých zesilovačů k vytvoření nových interakcí promotor-zesilovač, které mohou odlišně koordinovat genovou expresi. V tomto modelu promotory down-regulovaných genů interagují se zesilovači, které obsahují transkripční represory, zatímco up-regulované geny jsou výsledkem interakcí promotor-zesilovač, které přivádějí transkripční aktivátory do těsného kontaktu s příslušnými promotory. Souhrnně naše data odhalují sekvenční přeprogramování dostupnosti chromatinu, architektury 3D genomu a interakcí promotor-enhancer během tvorby engramu (rozšířená data, obr. 8).
