Současný stav neuroprotekce u vrozených srdečních chorob, část 2

Mikroskopické snímky byly poté podrobeny výpočtu obrazu pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signál Hsp60 byl vynásoben "x".

Hsp60 je důležitá proteinová molekula, která hraje důležitou biologickou roli v lidském těle. Výzkumy posledních let ukázaly, že přítomnost Hsp60 úzce souvisí s lidskou pamětí.

Hsp60 je molekulární chaperonový protein, který se podílí hlavně na skládání, rozbalování, stabilizaci a degradaci proteinu. Tyto procesy jsou velmi důležité pro normální metabolismus a buněčnou funkci lidského těla. Zároveň má Hsp60 také antioxidační, protizánětlivé a imunomodulační účinky a hraje velkou roli při udržování lidského zdraví a rovnováhy imunitního systému.

Výzkum zjistil, že Hsp60 hraje klíčovou roli při tvorbě a udržování paměti. Během procesu učení a paměti produkují mozkové buňky velké množství molekul Hsp60. Tyto molekuly mohou chránit buňky před rušením a poškozením z vnějšího prostředí, aby zajistily hladký průběh učení a paměti. Kromě toho může Hsp60 také ovlivnit lidské myšlení a chování změnou signální transdukce mozkových buněk a vývoj neuronů a má pozitivní vliv na kognitivní funkce a odolnost vůči stresu.

Ačkoli role Hsp60 prokázala pozitivní účinky na lidské tělo, lidé si také musí uvědomit, že jak nadbytek, tak nedostatek Hsp60 může mít negativní účinky na lidské zdraví. Proto bychom měli aktivně zkoumat a studovat mechanismus Hsp60 v různých fyziologických a patologických stavech lidského těla, abychom lépe porozuměli postavení a roli Hsp60 v lidském zdraví. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola má antioxidační, protizánětlivé a anti-aging účinky, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví nervového systému. Kromě toho může Cistanche deserticola také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, schopnost učení a rychlost myšlení a mohou také zabránit rozvoji kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Kliknutím na možnost Know zlepšíte krátkodobou paměť

Hodnota "x" byla stanovena následovně: odečtením "x" složeného signálu Hsp60 od signálu mitochondriální DNA v kontrolní skupině byla hodnota mitochondriální DNA menší nebo rovna nule. Signál histonu H2B byl vynásoben "y".

Hodnota "y" byla stanovena následovně: odečtením signálu "y" složeného histonu-H2B od signálu jaderné DNA v kontrolní skupině byla hodnota jaderné DNA menší než nebo rovna nule. Pokud se signál pozadí násobením zvýší, kontrast násobeného obrazu lze upravit pro stejné podmínky ve všech vzorcích.

Pro následnou analýzu byl použit snímek barvení dsDNA mínus upravený snímek znásobeného Hsp60 a histonu H2B. Pomocí funkce "Adjust-Threshold" byly tyto obrázky binarizovány. Vybrali jsme dsDNA punkta o velikosti od 2 do 20 µm2 (kruhovitost 0,1–1,0) a byly spočítány pomocí funkce „Analyze-Analyze Particles“.

2.3. Elektronová mikroskopie

Jeden den před transfekcí byly HeLa buňky naneseny v hustotě 600 buněk/µl. Exprese požadovaných genů byla umlčena v HeLa buňkách pomocí Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) v Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) podle pokyny výrobce (s konečnou koncentrací RNA 10 nM).

Čtyři dny po knockdownu siRNA byly buňky podrobeny fixaci. Vzorky buněčné kultury byly fixovány 2% PFA a 2% glutaraldehydem v 0.1 M fosfátovém pufru, pH 7,4, při 37 ◦C, poté umístěny do 4 ◦C lednička na 30 min. Vzorky byly fixovány ve 2% glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru přes noc při 4 °C. Vzorky byly třikrát promyty 0,1 M fosfátovým pufrem po dobu 30 minut a následně fixovány 2% oxidem osmičelým v 0,1 M fosfátovém pufru při 4 °C po dobu 1 hodiny.

Vzorky byly dehydratovány roztoky ingradovaného ethanolu, přeneseny do pryskyřice (Quetol{0}}, Nisshin EM Co., Tokio, Japonsko) a polymerovány při 60 ◦C po dobu 48 hodin. Polymerizované pryskyřice byly nařezány na ultratenké 70-nmsekce diamantovým nožem pomocí ultramikrotomu (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Německo) a poté byly namontovány na měděné mřížky.

Řezy byly obarveny 2% uranylacetátem při teplotě místnosti po dobu 15 minut a promyty destilovanou vodou, následovalo sekundární barvení roztokem pro barvení olova (Sigma-Aldrich, Tokio, Japonsko) při teplotě místnosti po dobu 3 minut.

Mřížky byly pozorovány pod transmisním elektronovým mikroskopem (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japonsko) při urychlovacím napětí 80 kV (mozek zebrafish) nebo 100 kV (buňka) a snímky byly zaznamenány pomocí kamery s nabíjecím zařízením (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Imunoelektronová mikroskopie

Vzorky na zlatých discích byly zmraženy v kapalném propanu při -175 ◦C. Poté, co byly vzorky zmraženy, byly zmrazeny nahrazeny 1% kyselinou tříslovou v ethanolu a 2% destilované vody při -80 °C po dobu 24 hodin.

Vzorky byly poté udržovány při -20 °C po dobu 4 hodin, následovala inkubace při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly vzorky třikrát dehydratovány v bezvodém ethanolu po dobu 30 minut. pokaždé, následovaná infiltrací směsí 50:50 ethanolu a pryskyřice (LR bílá: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) při 4 °C po dobu 1 hodiny. Vzorky byly přeneseny do čerstvé 100% pryskyřice a inkubovány při 4 °C po dobu 30 minut a tento proces byl třikrát opakován.

Vzorky byly přeneseny do čerstvé 100% pryskyřice a byly polymerovány při 50 ◦CO/N. Polymerované pryskyřice byly ultratenké řezy při 90 nm diamantovým nožem za použití ultramikrotomu (Ultracut UCT; Leica) a řezy byly umístěny na niklové mřížky. Mřížky byly inkubovány s anti-dsDNA protilátkou (35I9 DNA) (1/800, Abcam, kat. č. ab27156, RRID: AB_470907) v 1% BSA/PBS při 4 °C CO/N, poté třikrát propláchnuty 1% BSA/PBS po dobu 1 minuty.

Následně byly inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s {{0}}}nm zlatými částicemi (kozí anti-myší IgG polyklonální protilátka) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Po opláchnutí PBS byly mřížky umístěny do 2% glutaraldehydového 0,1 M kakodylátového pufru.

Poté byly mřížky vysušeny a poté obarveny 2% uranylacetátem po dobu 15 minut a roztokem barviva olova (Sigma-Aldrich) při teplotě místnosti po dobu 3 minut. Mřížky byly pozorovány transmisním elektronovým mikroskopem (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) při urychlovacím napětí 100 kV. Digitální snímky byly získány pomocí CCD kamery (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Výsledky

3.1. Snížený TFAM nebo GBA indukuje zvýšení ektopické mitochondriální DNA

Nejprve jsme ukázali příklad detekce cytoplazmatické DNA odvozené z mitochondrií v buňkách HeLa, ve kterých byl protein TFAM sražen siRNA (obrázek 1A). TFAM je klíčový mitochondriální transkripční faktor a také funguje při replikaci a opravě mitochondriální DNA [20] .

Uvádí se, že sekvenční polymorfismy v tomto genu jsou spojeny s Parkinsonovou nemocí [21,22]. Po 3 dnech knockdownu proteinu TFAM bylo v cytoplazmě buněk HeLa detekováno mnoho teček dvouvláknové DNA.

Histony jsou pozitivní markery pro DNA jaderného původu v cytoplazmě a negativní markery pro mitochondriální DNA a DNA mitochondriálního původu v cytoplazmě [23]. Tyto tečky se nelokalizovaly společně s histony, což naznačuje, že se nejednalo o DNA odvozenou z jádra. Kromě toho se některé z těchto cytoplazmatických ektopických teček DNA nelokalizovaly společně s Hsp60, markerem pro mitochondriální matrici, což naznačuje, že se nacházely mimo mitochondrie (obrázek 1B, C).

Elektronová mikroskopie také ukázala, že ektopická DNA unikala z mitochondrií (obrázek 2A, B). Stručně řečeno, nárůst ektopických DNA teček v cytoplazmě knockdownem TFAM byl způsoben únikem mitochondriální DNA z mitochondrií. Zadruhé jsme ukázali další příklad detekce cytoplazmatické DNA odvozené z mitochondrií v buňkách HeLa, ve kterých byl protein GBA sražen siRNA (Obrázek 1A).

GBA je kauzativní gen pro Gaucherovu chorobu, ale heterozygotní mutace GBA je také rizikovým faktorem pro Parkinsonovu chorobu [24]. Mnoho teček dvouvláknové DNA bylo detekováno v cytoplazmě buněk HeLa po 3 dnech knockdownu GBA proteinu. Některé tečky DNA byly lokalizovány společně s histony, což naznačuje, že jde o DNA odvozenou z jádra.

Jiné tečky DNA nebyly lokalizovány společně s histony, což naznačuje, že se nejednalo o DNA odvozenou z jádra, ale o DNA odvozenou z mitochondrií (obrázek 1D). Stručně řečeno, zvýšení ektopických bodů DNA v cytoplazmě knockdownem GBA bylo alespoň částečně způsobeno únikem mitochondriální DNA z mitochondrií.

For more information:1950477648nn@gmail.com