Konzervovaný sekreční protein bohatý na cystein MaCFEM85 interaguje s MsWAK16 a aktivuje obranyschopnost rostlin
Oct 26, 2023
Abstraktní: Metarhizium anisopliaeje entomopatogenní houba, která může zvýšit růst a odolnost rostlin, když působí jako endofyt v hostitelských rostlinách. O proteinových interakcích nebo jejich aktivačních mechanismech je však známo jen málo. Běžné proteiny fungální extracelulární membrány (CFEM) byly identifikovány jako rostlinné imunitní regulátory, které potlačují nebo aktivují reakce rostlinné rezistence. Zde jsme identifikovali protein obsahující doménu CFEM, MaCFEM85, který byl lokalizován hlavně v plazmatické membráně. Kvasinkové dvouhybridní (Y2H), stahovací testy glutathion-S-transferázy (GST) a bimolekulární fluorescenční komplementační testy prokázaly, že MaCFEM85 interagoval s extracelulární doménouMedicago sativa(alfalfa) membránový protein, MsWAK16. Analýzy genové exprese ukázaly, že MaCFEM85 a MsWAK16 byly významně upreguloványM. anisopliaeaM. sativaod 12 do 60 hodin po společné inokulaci. Další kvasinkové dvouhybridní testy a aminokyselinová místně specifická mutace ukázaly, že pro interakci MaCFEM85 s MsWAK16 byly specificky vyžadovány CFEM doména a 52. cystein. Testy obranné funkce ukázaly, že JA byla up-regulována, ale velikost léze Botrytis cinerea a reprodukce Myzus persicae byly potlačeny přechodnou expresí MaCFEM85 a MsWAK16 v modelové hostitelské rostlině Nicotiana benthamiana. Souhrnně tyto výsledky poskytují nový pohled na molekulární mechanismy, které jsou základem interakcí M. anisopliae s hostitelskými rostlinami.
cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu
Klíčová slova: wall-associated kinase; CFEM; Metahizium anisopliae; imunita rostlin; Medicago sativa
1. Úvod
Interakce mezi rostlinami a mikroby jsou široce rozšířené a jsou výsledkem minulé a probíhající společné evoluce. Tyto interakce mohou mít pro každého účastníka buď příznivé, neutrální nebo nepříznivé výsledky [1–3]. Prospěšná rhizosférická mikroflóra může zlepšit růst rostlin a zlepšit celkové zdraví tím, že chrání před půdními chorobami nebo zvyšuje příjem živin [4,5]. Široká škála prospěšných mikrobů může zlepšit schopnosti rostlin, jako je příjem živin, růst a obranyschopnost proti patogenům a hmyzu [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın je důležitý rod entomopatogenních hub se schopností kolonizovat rostliny [8], ale existují také důkazy naznačující, že členové rodu mohou zvyšovat odolnost rostlinných patogenů. Laboratorní studie například zjistila 60% inhibici Fusarium solani (Mart.) Sacc. v přítomnosti Metarhizium robertsii (dříve známého jako M. anisopliae) ve srovnání s kontrolami bez M. robertsii [9]. Některé kmeny Metarhizium mají potenciál zlepšit odolnost rostlin vůči hmyzím škůdcům a chorobám změnou exprese rostlinných obranných genů. Endofytická kolonizace s M. Roberts aktivuje expresi obou obranných drah kyseliny jasmonové (JA) a kyseliny salicylové (SA) v listech kukuřice; navíc je taková kolonizace spojena s podporou růstu rostlin a potlačením vývoje larev Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense aktivovalo -1,3-glukanázu a chitinasu ve slupce ovoce Lansium parasiticum, což vedlo k inhibici růstu Botrytis sp. a Fusarium sp. na plodech Aglaia dookkoo Griff [11]. Navíc, když byla M. anisopliae aplikována na sazenice arašídů, byly aktivovány různé transkripční faktory včetně WRKY, MYC, TGA a transkripčních faktorů reagujících na ethylen, zatímco nitrátové transportéry a proteiny vázané na dehydrataci reagující prvky byly také odlišně exprimovány [12]. . To naznačuje, že M. anisopliae reguluje rostlinné obranné geny při kolonizaci rostliny. Poměrně málo je však známo o mechanismech, které jsou základem obranných reakcí rostlin po infekci Metarhizium. Efektory jsou běžným prostředkem, kterým mikroorganismy regulují odolnost rostlin [13]. Aktivace rostlinné rezistence je obvykle charakterizována oxidačním vzplanutím a indukcí hormonů, metabolitů a dalších signálů [13]. Rostlinné hormony SA a JA hrají důležitou roli při navození rezistence rostlin, zprostředkovávají dvě samostatné obranné signální dráhy [14]. SA signální dráha primárně funguje v rostlinné alergické reakci a v systémové získané rezistenci vůči patogenům, ale může se také podílet na nepřímých obranných reakcích rostlin vyvolaných krmením bodavým hmyzem [15]. Akumulace SA je spojena se zvýšenou expresí genů kódujících proteiny přenosu lipidů (LTP) a fenylalanin amonnou lyázu (PAL) [16], které zprostředkovávají syntézu a akumulaci následných specializovaných metabolitů, jako jsou flavonoidy a lignin [17]. Signální dráha JA funguje v přímých a nepřímých reakcích na mechanické poškození, houbové patogeny a hmyzí škůdce. Studie prokázaly, že JA signalizace má regulační účinek na syntézu specializovaných metabolitů, jako jsou terpenoidy, fenylpropanoidy a alkaloidy, které mají širokou škálu biologických funkcí [18]. Bylo prokázáno, že některé specializované metabolity se po ošetření methylJA (MeJA) akumulují v rostlinných buňkách, včetně paclitaxelu u druhů Taxus [19,20], terpenoidů v Centella Asiatica (L.) Urban [21] a saponinů v ženšenu [22]. . Aplikace SA a chitosanu (CHT) jako elicitorů vyvolala akumulaci ligninu a obranné enzymové reakce v rajčatech, což snížilo výskyt infekce Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Kromě toho se hladiny JA a SA v pšenici významně akumulovaly aplikací elicitoru PeaT, čímž se zesílila obranná reakce na mšici ovesnou Sitobion avenae (Fabricius) [24]. To naznačuje, že rostlinná imunita by mohla být regulována těmito efektory prostřednictvím rostlinných hormonů a metabolitů.
cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému
Běžné proteiny houbové extracelulární membrány (CFEM) jsou přítomny v široké škále hub. Kódují domény, které jsou obvykle dlouhé 60 aminokyselin (aa) a obsahují osm charakteristicky rozmístěných cysteinů [25]. Domény CFEM jsou podobné doménám podobným epidermálnímu růstovému faktoru (EGF), které fungují jako extracelulární receptory, přenašeče signálu nebo adhezní molekuly v interakcích hostitel-patogen [26]. Proteiny obsahující domény CFEM mohou ovlivnit odpověď rostlinné rezistence tím, že působí jako efektory. U plísně rzi pšeničné Puccinia triticina Erikas urychlil kandidát CFEM efektoru PTTG_08198 postup buněčné smrti a podpořil akumulaci reaktivních forem kyslíku (ROS) [27]. Antraknózová houba Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils obsahuje pět efektorů (CgCFEM6, 7, 8, 9 a 15), u kterých bylo prokázáno, že potlačují BAX-indukovanou programovanou buněčnou smrt u Nicotiana benthamiana Domin [28]. Bylo popsáno, že fytosymbiotická mykorhizní houba Laccaria bicolor (Maire) PDOrton vylučuje několik proteinů CFEM, jako je Lac310796, Lac296573 a Lac296572, v symbiotických tkáních [29]. Ačkoli komplexní funkce těchto proteinů nebyly dále studovány v mykorhizní symbióze, dřívější výsledky naznačují, že proteiny CFEM mohou fungovat v signalizaci mezi houbami a rostlinami. M. anisopliae může v hostitelské rostlině fungovat buď jako entomopatogenní nebo endofytická houba [30]. Úloha proteinů CFEM však dosud nebyla popsána. Již dříve jsme identifikovali protein obsahující doménu CFEM v M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Zde informujeme o vztahu mezi MaCFEM85 a kinázou MsWAK16 asociovanou se stěnou Medicago sativa. Analyzovali jsme sekvenci MaCFEM85 a provedli experimenty, abychom určili, které zbytky jsou kritické pro interakci s MsWAK16. Nakonec jsme s použitím N. benthamiana jako naší modelové rostliny vyhodnotili obranné reakce rostlin na Botrytis cinerea a mšici Myzus persicae s přechodnou expresí MaCFEM85 a MsWAK16 a bez ní.
Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Výsledky
2.1. MaCFEM85 byl nejúžeji spojen s nepatogenními houbovými CFEM a lokalizován do plazmové membrány
Fylogenetický strom byl postaven pro analýzu vztahů mezi MaCFEM85 a dalšími CFEM proteiny z patogenních a nepatogenních modelových hub. Ty zahrnovaly Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge a Beauveria bassiana (Bals.) (viz část 4). MaCFEM85 byl nejblíže příbuzný CFEM proteinům v B. bassiana, a proto byl evolučně blíže nepatogenním než patogenním houbám (obrázek 1a).
Obrázek 1a
2.2. MaCFEM85 byl upregulován během interakcí s M. sativa
Nástěnné receptorové kinázy (WAK) představují podskupinu v rámci superrodiny receptorových proteinových kináz (RLK) a zahrnují extracelulární doménu, transmembránovou šroubovici a intracelulární kinázovou doménu. Hrají důležitou roli v regulaci růstu rostlin, vývoje, stresové reakce a signálních drah rezistence patogenů [32]. RNA byla extrahována z hyf M. anisopliae a kořenů M. sativa po společné inkubaci, aby se prozkoumaly expresní vzory MaCFEM85 a MsWAK16. Jak MaCFEM85, tak MsWAK16 byly exprimovány ve významně vyšších hladinách během společné inkubace od 12 do 6 0} h (obrázek 1c,d). Od 0 do 36 hodin se exprese MaCFEM85 postupně zvyšovala a dosáhla vrcholu za 36 hodin. Byl x 593krát více exprimován v kombinaci M. anisopliae a M. sativa ve srovnání s M. anisopliae pěstovanými samostatně. Ačkoli exprese MaCFEM85 byla mírně snížena v období 48–60 hodin, byla stále exprimována ve významně vyšších hladinách než u M. anisopliae pěstovaných samostatně. MsWAK16 byl také významně upregulován, s expresí vrcholící za 36 hodin. U M. sativa infikované M. anisopliae byla MsWAK16 x 89,06krát více exprimována než u M. sativa bez M. anisopliae. Od 36 do 60 hodin se hladiny MsWAK16 mírně snížily, ale jeho exprese byla stále významně vyšší než u nenaočkovaných rostlin.
2.3. MaCFEM85 interaguje s MsWAK16 in vitro a in vivo
Pro zkoumání potenciálního funkčního mechanismu MaCFEM85 v reakci na léčbu M. anisopliae byl proveden kvasinkový dvouhybridní (Y2H) screening, aby se předběžně identifikovaly hostitelské proteiny, které interagují s MaCFEM85. Interakce mezi extracelulární doménou MsWAK16 (MsWAK16-ED) a MaCFEM85 byla zkoumána pomocí kvasinkového dvouhybridního testu jedna ku jedné s použitím MaCFEM85 v pGBKT7 jako BD vektoru a MsWAK16 v pGADT7 jako AD vektoru. Všechny transformované kvasinky rostly dobře na SD-T/L deficitním médiu a pozitivní kontrolní skupina a experimentální skupina rostly úspěšně na SD-T/L/H/A + X- -gal deficitním médiu. To naznačuje, že MaCFEM85 by mohl interagovat s MsWAK16-ED (obrázek 2a).
Obrázek 2. Ověření interakce mezi MaCFEM85 a MsWAK16.
Pro in vitro validaci byla glutathion-S-transferázou (GST) značená MsWAK16-ED (kódující produkt 60 kDa) vložena do pGEX6-P2 a polyhistidinem (His) značený MaCFEM85 ( kódující produkt 17 kDa) byl vložen do pET-21b. Imunoblotting s protilátkami His a GST ukázal, že rekombinantní protein MaCFEM85-His interagoval s kořistí GST-MsWAK16-ED, ale ne se samotnou GST, a že GST-MsWAK16- ED interagoval s His -MaCFEM85 (obrázek 2b). Abychom dále potvrdili interakci mezi MaCFEM85 a MsWAK16, provedli jsme bimolekulární fluorescenční komplementační test (BiFC) s konstrukty MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC. Společná exprese MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC v tabákových listech generovala žlutý fluorescenční signál, což naznačuje, že MaCFEM85 interagoval s MsWAK16 (obrázek 2c).
2.4. Klíčová místa pro interakce MaCFEM85 a MsWAK16
Pro definování oblasti MaCFEM85, která je nutná pro interakci s MsWAK16-ED, byly pomocí online softwaru SMART předpovězeny proteinové domény (obrázek 3a). MaCFEM85 obsahoval doménu CFEM v oblasti 19-86 aa. Rovněž byla předpovězena terciární struktura (obrázek 3b). Osm cysteinů v této doméně vedlo ke čtyřem disulfidovým můstkům (CYS26 a CYS69, CYS30 a CYS64, CYS43 a CYS50 a CYS52 a CYS85), čímž byla zachována stabilita proteinu (obrázek 3b). Pro ověření domnělého interakčního místa (míst) v MaCFEM85 bylo vytvořeno sedm mutovaných verzí proteinu a vloženy do pGBKT7 jako návnadové proteiny. Každý rekombinantní vektor byl kotransfekován s AD-MsWAK16-ED v kmeni Y2H Gold. Kmen s mutovaným CYS52 nerostl na selektivním médiu (obrázek 3c, vyznačeno červeně), což ukazuje, že CYS52 je nutný pro interakci MaCFEM85 s MsWAK16-ED.
2.5. Interakce MaCFEM85 s MsWAK16 aktivuje rostlinnou imunitní odpověď
2.5.1. Hodnocení role MaCFEM85 a MsWAK16 v odolnosti vůči chorobám proti B. cinerea
Abychom prozkoumali možné zapojení MaCFEM85 a MsWAK16 do obranných reakcí patogenů, zkoumali jsme, zda by nadměrná exprese MaCFEM85, MsWAK16 nebo MaCFEM85 a MsWAK16 mohla poskytnout zvýšenou rezistenci vůči B. cinerea. Tyto vektory jsme přechodně exprimovali v listech N. benthamiana. Test Western blot ukázal, že MaCFEM85 a MsWAK16 byly exprimovány na srovnatelných úrovních, když byly exprimovány samostatně nebo společně, což ukazuje, že MaCFEM85 a MsWAK16 byly úspěšně exprimovány v tabáku (obrázek 4a). Testy onemocnění byly také prováděny s použitím N. benthamiana infiltrovaného MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 nebo kontrolou GFP. Léze byly významně menší (o ~ 30 % 2 dny po inokulaci) na listech infiltrovaných MaCFEM85, MsWAK16 nebo MaCFEM85+MsWAK16 ve srovnání s kontrolními rostlinami (obrázek 4b). Tato data ukazují, že přechodná exprese MaCFEM85 v N. benthamiana propůjčila zvýšenou rezistenci vůči B. cinerea a že MaCFEM85 a MsWAK16 pozitivně regulovaly obrannou odpověď proti B. cinerea.
Obrázek 3. Identifikace místa interakce mezi MaCFEM5 a MsWAK16.
Obrázek 4. Indukce rostlinné rezistence přechodnou expresí MaCFEM85 a MsWAK16.
2.5.2. Hodnocení role MaCFEM85 a MsWAK16 v obraně proti mšicím u N. benthamiana
Pro další zkoumání role MaCFEM85 a MsWAK16 byly rostliny N. benthamiana přechodně exprimující MaCFEM85 a MsWAK16 zamořeny M. persicae a populace byly hodnoceny. Pro tento experiment byla velká plocha každého listu N. benthamiana agroinfiltrována rekombinantním binárním vektorem pYBA1132 obsahujícím MaCFEM85 a MsWAK16. GFP byl použit jako kontrola. 12 hodin po infiltraci byly 20 dospělci M. persicae v kleci na každý list, čímž byla infiltrovaná oblast vystavena mšicím. V následujících třech dnech byla zaznamenána mortalita dospělých mšic a počet nymf; nymfy pak byly odstraněny. Nebyl žádný významný rozdíl v riziku úmrtnosti mezi populacemi M. persicae živícími se rostlinami exprimujícími MaCFEM85, MsWAK16 nebo MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (obrázek 4c). Nicméně po 24, 48 a 72 hodinách byl průměrný počet potomků produkovaných každou dospělou mšicí významně vyšší u N. benthamiana exprimující kontrolu GFP ve srovnání s těmi, které exprimují MaCFEM85, MsWAK16 nebo MaCFEM85+MsWAK16 (obrázek 4d).
2.5.3. Hodnocení role MaCFEM85 a MsWAK16 v akumulaci hormonů a genové expresi související s hormony
Abychom analyzovali rozdíly mezi obrannými reakcemi rostlin N. benthamiana exprimujících eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16, měřili jsme hladiny JA, SA a celkových flavonoidů a expresi příbuzných genů. Výsledky ukázaly, že hladiny JA a SA se mezi rostlinami exprimujícími eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16 lišily (obrázek 5a). Ve srovnání s těmi, které exprimují eGFP, byly hladiny JA významně nižší v rostlinách exprimujících MaCFEM85; Hladiny SA byly mírně zvýšené, ale rozdíly nebyly významné. Na rozdíl od toho rostliny exprimující MsWAK16 nevykazovaly žádné významné rozdíly v hladinách JA ve srovnání s kontrolou eGFP, zatímco hladiny SA byly významně nižší než u kontroly (obrázek 5a). Hladiny JA a SA byly významně zvýšeny a sníženy v rostlinách exprimujících MaCFEM85+MsWAK16 ve srovnání s eGFP.
Obrázek 5. Hladiny hormonů a genová exprese hormonální odezvy
Celkový obsah flavonoidů byl významně vyšší u rostlin exprimujících MaCFEM85+MsWAK16 ve srovnání se všemi ostatními léčenými skupinami (obrázek 5a). Úrovně exprese biosyntetického genu byly podobné v rostlinách exprimujících MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16. Například geny související s odpovědí JA, jmenovitě COI1, MYC2 a PDF1.2, byly významně upregulovány ve srovnání s rostlinami exprimujícími GFP (obrázek 5b). Podobně geny NPR1, WRKY70 a PR1 související s SA byly významně odlišně exprimovány v rostlinách exprimujících MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 byl upregulován, zatímco WRKY70 a PR1 byly downregulovány ve srovnání s kontrolou (obrázek 5b). Zkoumali jsme také expresi klíčových genů v drahách syntézy kyseliny šikimové a fenylpropanoidů, které oba souvisí se syntézou flavonoidů. Obecně exprese samotného MaCFEM85 neindukovala významně vyšší expresi těchto genů v tabáku. Tyto geny však byly upregulovány v tabáku exprimujícím MsWAK16 nebo MsWAK16+MaCFEM85 ve srovnání s kontrolou GFP (obrázek 5c).
cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému
3. Diskuse
3.1. Konzervovaný CFEM proteinový motiv plní více funkcí u druhů hub
Doména CFEM je pro houby jedinečná a běžně se vyskytuje v extracelulárních membránových proteinech hub. Doména pochází z nejnovějšího společného předka Ascomycota a Basidiomycota [33]. Nedávný výzkum ukázal, že proteiny CFEM v houbových patogenech mohou působit jako rostlinné imunitní regulátory, což způsobuje potlačení nebo aktivaci imunity hostitelské rostliny v závislosti na typu infekce [28,34,35]. Existuje jen málo zpráv o proteinech obsahujících doménu CFEM u M. anisopliae, pouze v kontextu evolučního srovnání s jinými houbami [36]. V této studii jsme porovnávali CFEM proteiny M. anisopliae s jinými známými CFEM proteiny u patogenních i nepatogenních hub. Potvrdili jsme, že nejbližší homolog MaCFEM85 je Cfem5 nalezený v Beauveria bassiana, jednom z 12 proteinů CFEM u tohoto druhu (doplňkový obrázek S1). BbCfem5 je nezbytný pro získávání železa [37]. Navíc na základě předpokládané terciární struktury je doména CFEM v MaCFEM85 velmi podobná proteinu povrchového antigenu 2 (CSA2) nalezenému v Candida albicans (CPRobin) Berkhout, ve kterém bylo 65 zbytků (96 % sekvence) modelováno s 99,8 % spolehlivosti [31]. Candida albicans je živočišný patogen; CSA2 hraje důležitou roli v růstu a patogenitě extrakcí hemu z hemoglobinu a transportem hemu z buněčné stěny do plazmy [38–40]. Předpokládáme, že MaCFEM85 se může podílet na virulenci M. anisopliae hmyzích hostitelů. Tyto kombinované funkce MaCFEM85 v patogenní infekci zvířat a aktivaci rostlinné imunity činí z proteinu vzrušující budoucí výzkumné zaměření.
3.2. Disulfidové vazby jsou důležité struktury pro funkci proteinů
Konformační integrita proteinové struktury přímo souvisí s její schopností fungovat. Disulfidové vazby tvořené cysteinovými páry podporují skládání proteinů a konformační stabilitu a jsou považovány za klíčová místa pro rozpoznání a vazbu specifických receptorů nebo ligandů [41]. Například narušení kterékoli ze tří konzervovaných disulfidových vazeb v rostlinném patogenu Cladosporium fulvum efektorového proteinu AVR4 vede k citlivosti na proteázy a snížené schopnosti vázat chitin [42]. U tří dalších proteinů C. fulvum (ECP1, ECP2 a ECP5) jednotlivé substituce alaninů za cysteiny tlumí hypersenzitivní reakci rajčat, což naznačuje, že cysteiny jsou kritické pro udržení stability a aktivitu indukující hypersenzitivní reakci [43]. Navíc ve zralém proteinu MC69 Magnaporthe oryzae může mutageneze dvou konzervovaných cysteinových zbytků (Cys36 a Cys46) narušit funkci MC69 bez ovlivnění sekrece, což naznačuje důležitost disulfidové vazby specificky v patogenitě MC69 [44]. Zdá se, že doména CFEM je co do velikosti a vzoru cysteinových zbytků podobná doménám podobným EGF, které obsahují tři nebo čtyři páry disulfidových vazeb. Proteiny EGF mohou fungovat jako receptory na buněčném povrchu, přenašeče signálu nebo adhezní molekuly v interakcích hostitel-patogen [45]. V této studii jsme nejen zjistili, že doména CFEM MaCFEM85 obsahovala osm konzervovaných cysteinů, které tvořily čtyři páry disulfidových vazeb (obrázek 3b), ale také jsme potvrdili, že CFEM byla kritickou doménou pro interakci mezi MaCFEM85 a MsWAK16. Kromě toho jsme prostřednictvím místně cílené mutace cysteinových zbytků na alanin zjistili, že cysteinový zbytek v poloze 52 byl hlavním místem potřebným pro interakci (obrázek 3c). Tyto výsledky poskytují základ pro další studium fyziologických funkcí interakce CFEM85–WAK16.
3.3. Interakce MaCFEM85 s aktivovanou ochranou rostlin MsWAK16
Při interakcích mezi mikroorganismy a rostlinami jsou obranné reakce rostlin obecně aktivovány mikrobiálními efektorovými proteiny. Indukovaná obrana se stává důležitým nástrojem biologické kontroly škůdců pro podporu odolnosti. Proteiny CFEM byly identifikovány jako efektory podílející se na regulaci imunitní aktivace nebo inhibice rostlin [28,46]. Existuje však nedostatek publikovaných výzkumů spojujících regulaci těchto imunitních faktorů s jejich specifickou rolí v chorobách rostlin a odolnosti proti hmyzu. V této studii jsme použili entomopatogenní a endofytickou houbu, M. anisopliae, k identifikaci interakce mezi MaCFEM85 a kinázou asociovanou s buněčnou stěnou, MsWAK16, v M. sativa. Výsledky ukázaly, že tato interakce snížila poměr lézí po inokulaci B. cinerea (obrázek 4b) a snížila rychlost růstu populace M. persicae (obrázek 4d), což ukazuje, že interakce mezi MaCFEM85 a MsWAK16 zvýšila odolnost M. sativa vůči mšicím. Změny v hladinách JA, SA a ethylenu (ET) mohou být použity jako markery pro hodnocení indukce rostlinné rezistence [47,48]. Zde jsme prokázali, že MaCFEM85 interagoval s MsWAK16, aby ovlivnil rezistenci rostlin prostřednictvím hormonální regulace a inhiboval rychlost reprodukce M. persicae (obrázek 4d). Podobné studie byly popsány již dříve. Například bylo ukázáno, že efektorový protein Brevibacillus laterosporus PeBL1 indukuje akumulaci JA a SA v rajčatech a snižuje rychlost růstu druhé a třetí generace populací M. persicae, které se živí těmito rostlinami. Rostliny rajčat postříkané efektory mají navíc repelentní účinek na M. persicae [49]. Aplikace elicitorového proteinu PeBC1 na fazol obecný (Phaseolus vulgaris L.) vede k výrazným a významným subletálním účinkům na mšice broskvoňové. Rostliny ošetřené PeBC1 vykazují významnou upregulaci genů souvisejících s JA a SA [50]. Beauveria bassiana elicitor PeBb1 snižuje plodnost M. persicae na tabáku a indukuje expresi JA a genů souvisejících s ET [51]. V této studii přechodná exprese MaCFEM85 a MsWAK16 v tabáku významně upregulovala geny COI1, MYC2 a PDF1.2 související s JA odpovědí (obrázek 5b) a zvýšila obsah JA a celkového obsahu flavonoidů (obrázek 5a), což bylo srovnatelné s výsledky v literatuře, jak je popsáno výše. Nedetekovali jsme však vysoké hladiny SA v tabáku 12 hodin po infiltraci a rostliny přechodně exprimující MsWAK16 nebo MaCFEM85+MsWAK16 vykazovaly významně snížené hladiny SA a downregulaci genů zapojených do SA reakce (obrázek 5a,b) . To prokázalo, že stimulace různých rostlinných hormonů může vést nejen k synergickým aktivitám, ale také k přeslechům a zpětné vazbě, což umožňuje rostlinám vhodně reagovat na různé podněty. V rostlinách byly dříve hlášeny zvýšené hladiny JA, ale nízké hladiny SA. Například u A. thaliana defektního pro akumulaci SA byly hladiny JA 25-krát vyšší než u divokého typu A. thaliana a byly aktivovány geny citlivé na JA [52]. Bylo také hlášeno, že některé bakterie mohou zvýšit hladiny JA v rostlinách, aby inhibovaly akumulaci SA, čímž se zabrání poškození způsobenému SA. Například Pseudomonas syringae se zaměřuje na receptor COI1 prostřednictvím toxinu, koronatinu, který negativně reguluje dráhu JA [53]. To podporuje MYC2-indukovanou upregulaci transkripčních faktorů ANAC019, ANAC055 a ANAC072 [54], inhibuje transkripci ICS1 (klíčový gen pro syntézu SA) a tím snižuje produkci SA a signální transdukci. V této studii vedla interakce mezi MaCFEM85 a MsWAK16 ke zvýšené akumulaci JA a upregulaci genů reagujících na JA, ale inhibici akumulace SA a transkripci genů souvisejících s SA. To naznačuje, že interakce mezi MaCFEM85 a MsWAK16 indukovala JA, čímž se zlepšila odolnost rostlin vůči mšicím.
U N. benthamiana přechodně exprimující MaCFEM85 a MsWAK16 byly hladiny JA zvýšeny a velikosti lézí B. cinerea byly sníženy (obrázek 4b), v souladu s předchozími studiemi. JA se podílí na odolnosti rostlin vůči hmyzu a nekrotrofním patogenům [52,55]. Jako nekrotrofní patogen byl B. cinerea inhibován akumulací JA a ET [56]. V A. thaliana ET-deficientní mutant ein2-1 a JA-response mutant coi1-1 byly hladiny downstream obranného genu PDF1.2 významně sníženy a citlivost na B. cinerea byla zvýšena [ 57]. Zde jsme zjistili, že akumulace JA a transkripce genů souvisejících s JA byly významně zvýšeny u N. benthamiana přechodně exprimující MaCFEM85 a MsWAK16, zatímco akumulace SA a transkripce genů souvisejících s SA byly inhibovány. Exprese MaCFEM85 a MsWAK16 také vykazovala inhibiční účinek na B. cinerea. To naznačuje, že JA byla aktivována MaCFEM85 a MsWAK16 a hrála hlavní roli v rezistenci rostlin vůči B. cinerea.
4. Materiály a metody
4.1. Kmeny hub, rostlinné materiály a kultivační metody
Kmeny izolátu Metarhizium anisopliae Ma 9 byly kultivovány na médiu bramborový cukr-agar (PSA) (200 g extraktu z oloupaných brambor vařeného ve vodě, 20 g sacharózy a 15 g agaru/l). Čerstvý prášek sporangia byl shromážděn po 10 dnech. Rostliny Nicotiana benthamiana byly pěstovány v umělé klimatické komoře s cyklem 14/10 h světlo/tma (27/25 ◦C). Pro přechodnou genovou expresi prostřednictvím transformace zprostředkované Agrobacterium byl Agrobacterium tumefaciens kmen GV3101 kultivován v médiu Luria Broth (LB) (10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu a 10 g NaCl/l). Kvasinkový kmen Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Čína) byl kultivován na médiu s kvasinkovým extraktem pepton-dextróza (YPDA) (10 g kvasinkového extraktu, 20 g peptonu, 20 g glukózy a 0,03 g adenin hemisulfátu/l). Pro každý vektor a kmen byla použita vhodná antibiotika, jmenovitě rifampin, kanamycin nebo ampicilin (25, 50, respektive 50 ug/ml). Kmeny a plazmidy použité v této studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Semena Medicago sativa byla povrchově sterilizována 75% ethanolem po dobu 1 minuty, poté 50% NaClO (5,5%) po dobu 15 minut. Semena byla důkladně promíchána a poté promyta ve sterilní vodě třikrát po dobu 5 minut. Semena byla inkubována při teplotě 4 °C ve tmě po dobu 24 hodin, poté byla přes noc vyklíčena na plotnách s 1% vodním agarem při teplotě místnosti. Tři dny po vyklíčení byly vyvíjející se semenáčky přeneseny na filtrační papír na 9-cm sterilních Petriho miskách, s 20 semenáčky na misku. Ošetření a kontrola byly rozděleny do 15 misek. Sazenice pak byly zavlažovány 10 ml suspenze spor M. anisopliae obsahující 107/ml a kontrola byla zavlažována 10 ml sterilní vody. V 0, 12, 24, 48 a 60 h byl pro každý časový interval odebrán náhodný výběr sazenic ze tří Petriho misek. Vzorky byly zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při -80 ◦C.
4.2. qRT-PCR a konstrukce plazmidu
Celková RNA byla extrahována z M. anisopliae (hyphae) a M. sativa (kořeny) pomocí činidla TRIzol (Invitrogen, CA, USA) podle pokynů výrobce. Kvalita a množství výsledné RNA byly měřeny pomocí NanoPhotometer® (Implen, Münich, Německo). Syntéza prvního vlákna cDNA (až 2 ug RNA) byla provedena pomocí 5x All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) podle pokynů výrobce. qRT-PCR byla provedena pomocí 2×SYBR Green qPCR Master Mix od US EVER BRIGHT ® INC. a systému ABI QuantStudio 5 podle pokynů výrobce. Primery použité pro každý gen jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2. Maury [58], Msactin [59] a Nbactin [60] byly použity jako interní referenční geny pro normalizaci dat exprese. Reakce byla prováděna za následujících podmínek: 5 minut při 95 °C, následovalo 40 cyklů při 95 °C po dobu 15 s a při 60 °C po dobu 40 s. Pro každý vzorek byly tři technické replikáty. Relativní vyjádření bylo vypočteno pomocí metody 2−∆∆Ct [61]. Statistická významnost byla stanovena pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) a Duncanova vícerozsahového testu v SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Přechodná exprese proteinů u N. benthamiana
Kódující sekvence MaCFEM85 (CDS) byla amplifikována ultravěrnou DNA polymerázou s použitím cDNA jako templátu. Pro subcelulární lokalizační testy byly produkty PCR obsahující CDS pro MaCFEM85 klonovány do pYBA1132-eGFP (štěpeného EcoRI a SalI) a pcambia1300-třešně (EcoRI a SacI), v daném pořadí. Všechny konstrukty byly validovány sekvenováním (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, Čína). Primery použité v této studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2. Pro přechodnou expresi MaCFEM85-eGFP a MaCFEM85-mCherry v N. benthamiana byl A. tumefaciens kmen GV3101 transformován každým plazmidem a ověřen pomocí PCR. Agrobacterium bylo kultivováno přes noc při 28 °C za třepání. Buňky byly shromážděny 5 minutovou centrifugací při 5000 otáčkách za minutu při teplotě místnosti, třikrát promyty sterilní dvakrát destilovanou vodou a resuspendovány v 10 mM MgCl2 pufru (obsahujícím 10 mM MES a 10 mM acetosyringonu, pH 5,7). Buněčná suspenze byla upravena na OD600 0,5, poté infiltrována do spodní strany 4- až 5-týdenních listů N. benthamiana pomocí 1-ml injekční stříkačky. Každý list byl infiltrován 50 ul A. tumefaciens; byly ošetřeny tři listy na rostlinu a tři rostliny byly v každé ošetřované skupině. Ošetřené listy byly shromážděny po 30 hodinách a vizualizovány konfokálním mikroskopem Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Německo), aby se určila subcelulární lokalizace.
cistanche přínosy pro muže-posílení imunitního systému
4.4. Fylogenetická analýza
Fylogenetický strom byl zkonstruován pomocí metody sousedského spojení v MEGA X. 1000 bootstrap replikátů bylo s použitím P-distance modelu. Aminokyselinové sekvence použité ke generování stromu byly získány pomocí BLASTP vyhledávání proti databázi NCBI příbuzných hub (např. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatum roselioclaeplodatus , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana a Paecilomyces lilacinus) pomocí MaCFEM85 jako dotazu.
4.5. Kvasinkové dvouhybridní testy
K ověření interakce mezi MaCFEM85 a MsWAK16 byl použit Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; nyní Takara Bio USA, Inc.). MaCFEM85 bez signálního peptidu byl zaveden do pGBKT7 jako návnada a extracelulární doména MsWAK16 (MsWAK16-ED) byla vložena do pGADT7 jako kořist. Příprava a transformace buněk kompetentních pro kvasinky byly provedeny pomocí Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) podle pokynů výrobce. Plazmidy návnady a kořisti byly společně transformovány do kvasinkového kmene Gold. Interakce protein-protein byly analyzovány na základě růstu na miskách SD s dvojitým odpadním médiem (DDO, SD/-Trp-Leu) a SD čtyřnásobným odpadním médiem (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. BiFC test
Pro vytvoření BiFC konstruktů byly vektory pUC-SPYNE a pUC-SPYCE linearizovány štěpením BamHI. CDS plné délky MaCFEM85 a MsWAK16 byly klonovány a vloženy do linearizovaných plazmidů pomocí rekombinantního enzymu, aby se získaly konstrukty MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC. Plazmidy obsahující MaCFEM85 a MsWAK16 byly kotransformovány s prázdnými vektory jako negativní kontroly (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE a pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Všechny vektory byly zavedeny do N. benthamiana prostřednictvím transformace zprostředkované Agrobacterium, jak je popsáno výše. Fluorescenční signály byly pozorovány v epidermálních buňkách listů pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Německo). Primery použité pro konstrukci vektoru jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2.
4.7. GST Pull-Down Assay
Pro GST pull-down testy byl MsWAK16-ED vložen do pGEX-6P-2 vektoru a MaCFEM85 byl vložen do pET-21b. Purifikované fúzní proteiny (GST-MsWAK16- ED) a pGEX-6P-2 no-load protein (GST) byly použity jako návnadový protein a purifikovaný pET-21 Jako kořist byl použit fúzní protein b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85). GST pulldown testy byly provedeny s Mag-Beads GST Fusion proteinovým purifikačním systémem (Sangon Biotech, Shanghai, Čína) podle instrukcí výrobce. Stručně, Mag-Beads byly pětkrát promyty 1x fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS, pH 7,4), aby se uvolnil alkoholový chránič, a poté bylo přidáno 10 ml GST nebo GST-MsWAK16-ED. Kuličky byly míchány převracením při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Po odstranění supernatantu byly Mag-Beads pětkrát promyty 1 x PBS. His-MaCFEM85 byl přidán k Mag-Beads již navázaným s GST a směs byla inkubována přes noc při 4 °C s rotací. Kuličky byly poté pětkrát promyty 1 x PBS, aby se odstranily nenavázané proteiny. Následně byly proteiny imobilizované na kuličkách separovány pomocí SDS-PAGE, přeneseny na nitrocelulózovou membránu (100 V, 1 h) a analyzovány pomocí Western blotu. Membrány byly promyty třikrát po dobu 10 minut PBS + Tween (PBST). Membrány byly blokovány po dobu 2 hodin při pokojové teplotě pomocí 5% odstředěného mléka, poté inkubovány s myší monoklonální protilátkou ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Peking, Čína) (zředěnou 1:3000) nebo myší monoklonální protilátkou ProteinFind anti-GST po dobu 2 h při 4 ◦C. Membrány byly poté ponořeny do ProteinFind kozí anti-králičí IgG(H+L) (HRP) protilátky (TransGen Biotech, Beijing, Čína) (zředěno 1:5000) na 1 hodinu při teplotě místnosti. Membrány byly vizualizovány pomocí EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Peking, Čína) podle pokynů výrobce.
4.8. Identifikace klíčového místa v MaCFEM85
Aby se určila velikost požadovaná pro interakci MaCFEM85 s MsWAK16, byla provedena PCR amplifikace za účelem vytvoření více zkrácených forem MaCFEM85. Do vektoru byla vložena doména CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa zbytky 19–86) a C terminál bez domény CFEM (MaCFEM85-C, aa zbytky 87–170) pGBKT7 jako návnadový protein (doplňková tabulka S1). Dalších pět variant bylo zkonstruováno pomocí syntézy polypeptidu k mutaci cysteinu na alanin v pozicích 26, 30, 43, 52 a 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM∆854 CFEM8552, respektive ∆CFEM858). Tyto varianty byly použity k provedení experimentů Y2H s MsWAK16-ED. Transformované kvasinkové buňky byly testovány na růst na syntetických vynechaných SD/-Trp-Leu destičkách a SD/-Trp-Leu-His-Ade destičkách obsahujících X- -galaktosidázu (X- -Gal).
4.9. Testy odolnosti rostlin
Myzus persicae byly získány od Henan Quanying Biological Co., Ltd. Týden před zahájením biologických testů bylo 150 dospělých mšic umístěno na tři rostliny N. benthamiana (50 mšic na rostlinu). Po 72 hodinách byli všichni dospělci odstraněni měkkým umělým štětcem a nymfám bylo umožněno krmit se další čtyři dny, než byly přeneseny do N. benthamiana pro testy výkonnosti mšic.
4.10. Testy výkonnosti mšic
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) byl použit k hodnocení výkonnosti M. persicae, odolnosti rostlin vůči B. cinerea a exprese genů souvisejících s hormony. Agrobacterium nesoucí buď pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 nebo pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 byly pěstovány v LB doplněném vhodnými antibiotiky po dobu 36 hodin při 28 ◦C. Buňky byly třikrát promyty, poté resuspendovány v infiltračním pufru (10 mM MgCl2, 10 mM MES a 100 uM acetosyringonu, pH 5,6) na OD600 0,6. Pro koinfekci byly bakterie nesoucí MaCFEM85 a MsWAK16 upraveny na OD600 1,2 a poté smíchány ve stejných objemech. Plně expandované listy byly infiltrovány bakteriemi pomocí 1-ml injekčních stříkaček bez jehly. Na každou rostlinu byly infiltrovány tři listy a každé ošetření bylo aplikováno na tři rostliny pro celkem 12 rostlin na experiment.
Pro testy účinnosti mšic bylo 20 dospělých mšic aplikováno na infiltrovanou oblast každého listu 12 hodin po aplikaci Agrobacterium. Mšice byly uzavřeny pomocí klipových klecí o průměru 5 mm. Každé ošetření bylo opakováno pětkrát. Mortalita dospělých mšic a počet nově kladených nymf byl zaznamenáván denně po dobu tří dnů. B. cinerea byla kultivována po dobu pěti dnů na PDAY. 12 hodin po infiltraci Agrobacterium byla nově kultivovaná B. cinerea vyražena do 5- mm houbového koláče a povrch růstu mycelia byl připojen k infiltrační oblasti na povrchu listu. Aby se usnadnil vývoj onemocnění, byly rostliny udržovány vlhké tím, že byly pokryty plastovou fólií v miskách při 22 ◦C, aby se usnadnila progrese onemocnění. Po 48 hodinách byl odhadnut postup onemocnění v naočkovaných listech měřením velikosti lézí. Pro kvantifikaci relativní exprese relevantních genů byly tři infiltrované listy odebrány z každé rostliny 12 hodin po infiltraci, poté zmrazeny v kapalném dusíku a skladovány při -80 °C. Extrakce celkové RNA, syntéza cDNA a qRT-PCR byly provedeny tak, jak je popsáno v části 3.2. Hladiny kyseliny salicylové (SA), kyseliny jasmonové (JA) a flavonoidů byly měřeny v 15 infiltrovaných listech N. benthamiana na ošetření. Listy byly shromážděny, zmraženy v kapalném dusíku a poté skladovány při teplotě -80 stupňů. Rostlinné hormony byly kvantifikovány pomocí souprav Plant Salicyclic Acid a Plant Jasmonic Acid ELISA Kit (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) a flavonoidy byly kvantifikovány pomocí sady Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) pokyny výrobce.
4.11. Statistická analýza
Data byla analyzována v SPSS v20.0. Významné rozdíly v hladinách exprese MaCFEM85 a MsWAK16 byly stanoveny pomocí Studentova t-testu. Významné rozdíly v hladinách SA, JA a flavonoidů byly stanoveny pomocí jednocestné ANOVA a Duncanova vícerozsahového testu s prahem p < 0,05.
5. Závěry
V této studii jsme identifikovali a charakterizovali nový vylučovaný protein, MaCFEM85, v M. anisopliae. Bylo zjištěno, že jde o konzervovaný efektor, který může interagovat s MsWAK16 a aktivovat obrannou reakci N. benthamiana. Ukázali jsme, že doména CFEM a cysteinový zbytek v poloze 52 v MaCFEM85 byly pro interakci kritické. Tato interakce může aktivovat imunitní reakce související s JA a mechanismy odolné vůči chorobám a hmyzu v rostlině.
Reference
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerství rostlin a mikrobů: Důsledky pro růst a zdraví rostlin. In Plant Microbe Symbiosis: Fundamentals and Advances; Springer: Berlín/Heidelberg, Německo, 2013; s. 105–117. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Rozluštění interakcí rostlina-mikrobi: Může pomoci vícedruhová transkriptomika? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Nakrmte své přátele: Formují rostlinné exsudáty kořenový mikrobiom? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B.; Kamilová, F. Růst podporující rhizobakterie. Annu. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Indukovaná systémová rezistence a reakce rostlin na činidla biologické kontroly plísní. Annu. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Metabolické a transkriptomické změny indukované u Arabidopsis rhizobakteriem Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikace kořenů a mikrobů rostlin při utváření kořenových mikrobiomů. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Hmyzu patogenní houba Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) je také endofytem, který stimuluje vývoj kořenů rostlin. Dopoledne. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonismus endofytické hmyzí patogenní houby Metarhizium robertsii proti patogenu fazole Fusarium solanif. sp. phaseoli. Umět. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii podporuje růst kukuřice, potlačuje růst hmyzu a mění expresi genů obrany rostlin. Biol. Kontrola 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T.; Petcharat, V. Indukce obranných reakcí u ovoce Hongkong (Aglaia dookkoo Griff.) proti houbám hniloby ovoce Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrola 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Odpověď kořenů podzemnice olejné Arachis hypogaea na přítomnost prospěšných a patogenních hub analýzou transkriptomu. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Kapitola 11 – Role houbových elicitorů v obranném mechanismu rostlin. In Molekulární aspekty rostlinných prospěšných mikrobů v zemědělství; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2020; s. 143–158. [CrossRef]
14. Dong, X.; Sa, JA Ethylen a odolnost rostlin vůči chorobám. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Oddělené dráhy obranné odezvy závislé na jasmonátu a závislé na salicylátu u Arabidopsis jsou nezbytné pro rezistenci vůči odlišným mikrobiálním patogenům. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Kalhoty, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Fenylalanin amonná lyáza (PAL) Podporuje antivirovou obranu proti viru Panicum mosaic a jeho satelitům. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Profil exprese genu PAL z Astragalus membranaceus var. Mongholicus a jeho klíčová role v toku do biosyntézy flavonoidů. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripční stroje v sekundárním metabolismu rostlin vyvolaném jasmonátem. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Účinky složení plynné fáze na suspenzní kultury Taxus cuspidata. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkripční profil buněk taxus chinensis v reakci na methyljasmonát. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Metabolomics odvozené pohledy na manipulaci syntézy terpenoidů v buňkách Centella asiatica methyl jasmonate. Rostlinná biotechnologie. rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Účinky elicitace na produkci saponinu v buněčné kultuře Panax ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitorem indukované obranné reakce u Solanum lycopersicum proti Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Proteinový elicitor PeaT1 posílil odolnost proti mšicím (Sitobion avenae) v pšenici. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Rozšíření fyziologické role hexamerní DnaB helikázy. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Tři proteiny ukotvené GPI doménou Aspergillus fumigatus (CfmA-C) ovlivňují stabilitu buněčné stěny, ale nehrají roli ve virulenci plísní. Plísňové. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genomová identifikace kandidátů na efektor s konzervovanými motivy z plísně rzi pšeničné Puccinia triticina. Přední. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatická analýza a funkční charakterizace CFEM proteinů v kukuřičné antraknózové houbě Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; a kol. Genom Laccaria bicolor poskytuje pohled na mykorhizní symbiózu. Příroda 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogenní houby jako endofyty: Interakce rostlina-endofyt-býložravec a vyhlídky pro použití v biologické kontrole. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatická analýza a funkční charakterizace CFEM proteinů Metarhizium anisopliae. J. Fungi. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; a Kanyuka, K. WAKsing rostlinná imunita, ustupující nemoci. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Systematické analýzy odhalují jedinečnost a původ domény CFEM v houbách. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Nový efektorový gen SCRE2 přispívá k plné virulenci Ustilaginoidea virens vůči rýži. Přední. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, protein obsahující doménu CFEM s předpokládaným místem ukotveným GPI, se podílí na patogenitě, produkci konídií a toleranci vůči stresu u Botrytis cinerea. Přední. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Genomová srovnávací analýza domnělých receptorů spojených s G proteinem souvisejících s Pth{2}} v houbách patřících k Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Systematické příspěvky proteinů obsahujících CFEM k získávání železa jsou zásadní pro mezidruhovou interakci vláknité patogenní houby Beauveria bassiana. Environ. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Získávání heme-železa v houbách. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, člen rodiny proteinů Rbt5, se podílí na využití železa z lidského hemoglobinu během růstu hyf Candida albicans. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Tvorba biofilmu mutanty Candida albicans pro geny kódující fungální proteiny vykazující doménu CFEM obsahující osm cysteinů. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Disulfidové vazby jako přepínače funkce proteinu. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Přirozené mutanty AVR4 patogenu rajčete Cladosporium fulvum s narušenými disulfidovými vazbami jsou citlivé na proteolýzu, obcházejí rezistenci zprostředkovanou Cf-4-, ale zachovávají si svou schopnost vázat chitin. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; a kol. Zlepšení mnoha agronomických znaků genem odolnosti vůči chorobám prostřednictvím zesílení buněčné stěny. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; a kol. Rozsáhlé narušení genu v Magnaporthe oryzae identifikuje MC69, secernovaný protein nezbytný pro infekci jednoděložnými a dvouděložnými houbovými patogeny. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Doména CFEM obsahující osm cysteinů jedinečná pro skupinu proteinů houbové membrány. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Systémová identifikace a funkční charakterizace běžných proteinů extracelulární membrány hub v Lasiodiplodia theobromae. Přední. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R.; Jones, JD Role rostlinných hormonů v obranných reakcích rostlin. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulace stresových reakcí zprostředkovaná rostlinnými hormony. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Javed, K.; Qiu, D. Proteinový elicitor PeBL1 z Brevibacillus laterosporus zvyšuje odolnost proti Myzus persicae v rajčatech. Patogeny 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekulární a funkční charakterizace elicitoru PeBC1 extrahovaného z Botrytis cinerea podílejícího se na indukci rezistence proti mšici broskvoňové (Myzus persicae) u fazolí obecných (Phaseolus vulgaris L.). Hmyz 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Předpokládaná role dosud necharakterizovaného proteinového elicitoru PeBb1 odvozeného z Beauveria bassiana ARSEF 2860 Kmen proti Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) v Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogeny 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; a kol. NPR1 moduluje křížovou komunikaci mezi obrannými cestami závislými na salicylátu a jasmonátu prostřednictvím nové funkce v cytosolu. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; On, SY Pseudomonas syringae pv. rajče DC3000: Modelový patogen pro testování náchylnosti k chorobám a hormonální signalizace u rostlin. Annu. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Podjednotka mediátorového komplexu Arabidopsis16 pozitivně reguluje salicyláty zprostředkovanou systémovou získanou rezistenci a obranné dráhy vyvolané jasmonátem/ethylenem. Rostlinná buňka 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Kyselina salicylová inhibuje syntézu inhibitorů proteináz v listech rajčat indukovanou systeminem a kyselinou jasmonovou. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Networking pomocí hormonů s malou molekulou v imunitě rostlin. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Pro indukci rostlinného genu pro defensin u Arabidopsis je nutná současná aktivace cest odezvy na jasmonát a ethylen. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Exprese genů zapojených do klíčení, konidiogeneze a patogeneze u Metarhizium anisopliae pomocí kvantitativní RT-PCR v reálném čase. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Genová exprese celulózové syntázy za abiotického stresu: Stopařův průvodce normalizací RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Pektátová lyáza Verticillium dahliae indukuje imunitní reakce rostlin a přispívá k virulenci. Přední. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Livák, KJ; Schmittgen, TD Analýza dat relativní genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a metody 2(-Delta Delta C(T)). Methods 2001, 25, 402–408. [CrossRef]