Systémová analýza VEGFA u renálního buněčného karcinomu: exprese, prognóza, genová regulační síť a regulační cíle

edmund.chen@wecistanche.com

Úvod

Renální buněčný karcinom (RCC), nejčastější maligní nádor v ČRledvina, je jedním z 10 nejčastějších druhů rakoviny na celém světě.1 ​​Ročně má na svědomí přibližně 330000 případů rakoviny a více než 140000 úmrtí.2 Mezi heterogenními podtypy RCC jeledvina ledvinovékarcinom z papilárních buněk (KIRP) je na druhém místě z hlediska incidence, tvoří 10 až 15 procent RCC, poledvina ledvinovájasnobuněčný karcinom (KIRC) s incidencí 75 procent – ​​80 procent .3ledvinychromofob (KICH) je vzácný podtyp RCC, tvořící přibližně 4 až 5 procent RCC.4 Pokročilý RCC je smrtelné onemocnění s 5-letou mírou přežití pouze 11,7 procenta.5 Chirurgie a cílená léčba jsou primární klinické terapeutické metody pro RCC.6 Relevantní klinické studie ukázaly, že použití inhibitorů imunitního kontrolního bodu v kombinaci s antiangiogenními látkami je klinicky účinnější u pacientů s RCC.7,8 Nové metody založené na imunoterapii však také čelí mnoha výzvám v klinické aplikaci. Existuje naléhavá potřeba identifikovat slibnější terapeutické cíle a přístupy k léčbě RCC.

Vaskulární endoteliální růstový faktor A (VEGFA), kritický angiogenní faktor, je důležitý nádorově specifický faktor u pacientů s RCC a hraje klíčovou roli v angiogenezi a progresi nádoru.9 VEGFA indukuje adhezi a migraci rakovinných buněk vazbou na integrin 9 1.10 Několik inhibitorů VEGFA je klinicky užitečných.11,12 Sunitinib, inhibitor avaskulární tyrozinkinázy VEGF, byl schválen pro léčbu první a druhé linie pokročilého RCC. Sunitinib však může potenciálně způsobitpoškození ledvina kardiovaskulárním postižením.11 Ačkoli je VEGFA považována za základní nádorově specifický faktor u pacientů s RCC, úroveň exprese, genová regulační síť, prognostická hodnota a regulační cíl VEGFA u pacientů s heterogenními podtypy RCC (KIRC, KICH, a KIRP) zůstávají neobjasněny. Proto je nutné získat užitečnější informace o vztahu mezi expresí VEGFA a výskytem RCC. V této studii jsme použili několik bezplatných online databází k identifikaci úrovně exprese, sítě regulace genů, prognostické hodnoty a cíle regulace VEGFA u pacientů s RCC. Tato studie si navíc kladla za cíl dále prozkoumat vztah mezi expresí VEGFA a výskytem RCC a poskytnout nové poznatky o cílové léčbě pacientů s RCC.

klíčová slova:Renální buněčný karcinom, ledvinový renální jasný buněčný karcinom, ledvinový chromofob, ledvinový renální papilární buněčný karcinom, VEGFA, genová regulační síť, predikce cíle

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

Materiály a metody

Analýza UALCANUALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html) je online databáze používaná jako nástroj pro genovou expresi podskupiny nádorů a analýzy přežití.13,K analýze dat genové exprese TCGA byl použit modul "Expression Analysis" databáze ALCAN a screeningová kritéria byla nastavena následovně: (a) gen: VEGFA; (b) datový soubor: KIRC, KICH a KIRP; (c) podmínky nastavení prahu: Hranice P-hodnoty =0.05. Pro srovnávací analýzu byl použit Studentův t-test.Analýza profilování genové expreseAnalýza profilování genové exprese (GEPIA) (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html) je bezplatná online platforma, která poskytuje data o expresi sekvenování RNA 9736 nádorů a 8587 normálních vzorků pro analýzu14 diferenciální exprese mRNA, metylace promotoru, patologického stadia a korelativní prognózy v této studii. Kritéria screeningu byla následující: (a) gen: VEGFA; (b) datový soubor: KIRC, KICH a KIRP; (c) podmínky pro nastavení prahu: Hranice P-hodnoty =0.05. K analýze exprese VEGFA a patologického stadia RCC byl použit Studentův t-test. K analýze prognózy pacientů s RCC byla použita Kaplan-Meierova křivka.Analýza cBioPortalcBioPortal (http://cbioportal.org) je otevřená online databáze používaná k vizualizaci, studiu a analýze genetických dat rakoviny.15 V naší studii je analýza genetických změn VEGFA a jeho sousedních genů (top 5{{ 9}} změněné sousední geny VEGFA) bylo provedeno pomocí databáze cBioPortal. Screeningová kritéria byla následující: (a) Bylo analyzováno 446, 66 a 274 vzorků KIRC, KICH a KIRP; (b) Z-skóre exprese mRNA vzhledem ke všem vzorkům (log RNA Seq V2 RSEM) byla získána s použitím prahu z-skóre ±2,0; (c) gen: VEGFA.Analýza STRINGSTRING (https://string-db.org/cgi/input.pl) je online bezplatná databáze používaná ke konstrukci sítí interakce protein-protein (PPI) mezi cílovými proteiny.16 V této studii jsme vytvořili síťovou interakci PPI pomocí screeningové podmínky s nízkou spolehlivostí (0.150) a definované druhy jako Homo sapiens.Analýza GeneMANIAGeneMANIA (http://www.genemania.org) je analytický nástroj pro vytváření PPI, generování hypotéz o funkci genů, analýzu seznamů genů a sekvenování genů pro určení funkce.17 V této studii jsme vytvořili interakční sítě pro zkoumání role VEGFA a top 50 změněných sousedních genů.Metascape analýzaMetascape (https://metascape.org) je jednoduchý a výkonný nástroj pro anotaci a analýzu genových funkcí, který může uživatelům pomoci použít v současnosti populární metody bioinformatické analýzy pro analýzu dávkových genů a proteinů, aby pochopili funkci genů nebo proteinů.18 V našem Studie, funkce genové ontologie (GO) a analýza obohacení dráhy VEGFA a jeho změněných sousedních genů v RCC Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) byly zkoumány pomocí Metascape.Analýza DŮVĚRYTRUST (https://www.grnpedia.orgtrrust/) je ručně spravovaná databáze lidských transkripčních regulačních sítí, které obsahují 8444 a 6552 regulačních vztahů transkripčního faktoru a cíle 800 lidských transkripčních faktorů.19 V této studii jsme se pokusili identifikovat klíčový faktor regulující expresi VEGFA a jeho změněných sousedních genů u pacientů s RCC pomocí databáze TRUST.Analýza LinkedOmicsLinkedOmics (http://www.linkedomics.org) je veřejná online platforma, která zahrnuje multi-omická data ze všech 32 typů rakoviny TCGA.20 Poskytuje metody pro analýzu a porovnávání dat multi-omics rakoviny v rámci a mezi typy nádorů. V naší studii byly cílené obohacení kinázy, obohacení cíle miRNA a geny odlišně exprimované v korelaci s VEGFA prováděny pomocí modulu „LinkInterpreter“ LinkedOmics. Kritéria screeningu byla stanovena následovně: (a) minimální počet tří genů (velikost); (b) typ rakoviny: KIRC, KICH a KIRP; c) simulace 500; (d) hledání přiřazení: VEGFA a prvních 50 změněných sousedních genů; (e) cílový soubor dat: RNA-seq (typ dat).Analýza časovačeTIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/) je komplexní zdroj pro systematickou analýzu imunitních buněk infiltrujících nádor, včetně B buněk, CD4 plus T buněk, CD8 plus T buněk, neutrofilů, makrofágů a dendritických buněk. V naší studii byla korelace mezi hladinou exprese VEGFA a infiltrací imunitních buněk hodnocena „genovým modulem“ TIMER.

Výsledek

Exprese VEGFA u pacientů s RCCPorovnali jsme hladiny exprese VEGFA u pacientů s RCC s normálními lidskými tkáněmi a zjistili jsme, že transkripční hladiny VEGFA stratifikované podle typu vzorku, pohlaví a patologického stadia KIRC byly významně upregulovány (P < {{0}}}="" .001)="" (obrázek="" 1(a)="" až="" (c)).="" podobně="" byla="" hladina="" exprese="" vegfa="" v="" tkáních="" kich="" zvýšena="" na="" základě="" typu="" vzorku,="" pohlaví="" a="" kich="" stádia="" 2="" (p="">< 0,05)="" (obrázek="" 1(d)="" až="" (f)).="" hladina="" exprese="" vegfa="" v="" tkáních="" kirp="" však="" byla="" snížena="" na="" základě="" typu="" vzorku="" a="" mužského="" pohlaví="" (p="">< 0,05)="" (obrázek="" 1="" (g)="" a="" (h)).="" dále="" jsme="" hodnotili="" korelaci="" mezi="" rozdílnou="" expresí="" vegfa="" a="" patologickým="" stadiem="" u="" pacientů="" s="" rcc.="" naše="" výsledky="" ukázaly="" významnou="" korelaci="" mezi="" expresí="" vegfa="" a="" patologickým="" stadiem="" u="" pacientů="" s="" kirc="" (p="0.0471)" a="" kirp="" (p="4.36e-6)" (obrázek="" 2)="" .="" kromě="" toho="" jsme="" použili="" gepia="" k="" hodnocení="" prognostické="" hodnoty="" exprese="" vegfa="" u="" pacientů="" s="" rcc.="" celkové="" přežití="" bylo="" delší="" u="" pacientů="" s="" kirp="" s="" nízkou="" spíše="" než="" vysokou="" hladinou="" exprese="" vegfa="" (p="0.00044)" (obrázek="" 3(c)).="" procento="" přežití="" bylo="" vyšší="" u="" pacientů="" s="" kirp="" s="" nízkou="" než="" vysokou="" hladinou="" exprese="" vegfa="" před="" 100="" měsíci="" (p="0.0016)" (obrázek="" 3(f)).="" opačný="" výsledek="" byl="" však="" zjištěn="" po="" 100="" měsících="" u="" pacientů="" s="" kirp="" (obrázek="">

Genetická alterace a hladina metylace promotoru exprese VEGFA u pacientů s RCCGenetické změny VEGFA u pacientů s RCC byly hodnoceny pomocí TCGA. Naše výsledky ukázaly, že exprese VEGFA byla u pacientů s KIRC změněna o 4 procenta (doplňkový obrázek 1(a)). Úroveň methylace promotoru exprese VEGFA však byla nižší u pacientů s KIRC než u normálních lidí (doplňkový obrázek 1(b)). Navíc jsme u pacientů s KICH zjistili 8procentní změnu úrovně exprese VEGFA (doplňkový obrázek 1(c)). Podobně byla exprese VEGFA změněna o 4 procenta u pacientů s KIRP (doplňkový obrázek 1(e)). Úroveň methylace promotoru exprese VEGFA však byla vyšší u pacientů s patologickým stádiem 1 KIRP než u normálních jedinců (doplňkový obrázek 1 (f))

Alterace sousedních genů a interakční síť VEGFA u pacientů s RCCSousední genová alterace exprese VEGFA u pacientů s RCC byla analyzována pomocí softwaru cBioPortal. U pacientů s KIRC, KICH a KIRP jsme našli frekvence změn sousedních genů VEGFA vyšší nebo rovné 11,11 procenta, vyšší nebo rovné 20 procentům a vyšší nebo rovné 9,09 procenta (50 nejčastěji změněných sousedních genů), respektive (doplňkové tabulky 1–3). Nejčastěji změněnými sousedními geny VEGFA u pacientů s KIRC byly VHL (72,22 procenta), PBRM1 (33,33 procenta) a MUC16 (22,22 procenta) (doplňková tabulka 1). Kromě toho byly TRRAP (60.00 procent), PABPC1 (60.{21}} procent) a MUC5B (60{24}} procent) nejčastěji změněnými sousedními geny VEGFA u pacientů s KICH (doplňková) tabulka 2). Tři nejčastěji změněné sousední geny VEGFA u pacientů s KIRP byly BAP1 (27,27 procenta), MS4A15 (18,18 procenta) a TGM7 (18,18 procenta) (doplňková tabulka 3).

Poté jsme prozkoumali potenciální interakce mezi VEGFA a jeho sousedními geny. Síť PPI byla vytvořena pomocí softwaru STRING. Získali jsme 43 uzlů a 95 hran v sítích PPI u pacientů s KIRC (doplňkový obrázek 2 (a)). Navíc, trimethylace peptidyl lysinu, methylace peptidyl-lysinu, extracelulární matrix a glykosylace vázaná na protein O byly primárními funkcemi VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s KIRC (doplňkový obrázek 2(b)). Získali jsme také 44 uzlů a 125 hran v sítích PPI u pacientů s KICH (doplňkový obrázek 2 (c)). VEGFA a jeho sousední geny měly u pacientů s KICH následující funkce: zpracování O-glykanu, Golgiho lumen, glykosylace b proteinu O-vázaná, udržování struktury epitelu a organizace cytoskeletu intermediárního vlákna (doplňkový obrázek 2(d)). Dále bylo získáno 30 uzlů a 57 hran v sítích PPI u pacientů s KIRP (doplňkový obrázek 2(e)). Vývoj svalové struktury, diferenciace svalových buněk, vývoj svalové tkáně a vývoj strukturální složky svalové tkáně byly primárními funkcemi VEGFA a jejích sousedních genů u pacientů s KIRP (doplňkový obrázek 2(f)). VEGFA je spojen se svými sousedními geny do komplexní interakční sítě koexpresí, fyzikálními interakcemi, předpokládanými sdílenými proteinovými doménami a společnou lokalizací (doplňkový obrázek 2(b) až (f))

Analýza obohacení GO a KEGG dráhyFunkce GO a analýza obohacení KEGG dráhy VEGFA a top 50 změněných sousedních genů u pacientů s RCC byly zkoumány pomocí softwaru Metascape. Naše výsledky ukázaly, že buněčné složky související s VEGFA a jejími sousedními geny u pacientů s KIRC byly zapojeny hlavně do bazální membrány, caveola, adherens junkce, části spermií a části kontraktilních vláken (doplňkový obrázek 3(a)). Kromě toho byly hlavními biologickými procesy exprese VEGFA a jeho změněných sousedních genů u pacientů s KIRC morfogeneze koronární vaskulatury, vývoj kardiomyocytů, pozitivní regulace extenze axonů a adheze heterofilní buňka-buňka prostřednictvím adhezních molekul buněk plazmatické membrány (doplňkový obrázek 3(b)). Molekulární funkce VEGFA a jeho top 50 změněných sousedních genů u pacientů s KIRC zahrnovaly především strukturální složku extracelulární matrice, vazbu molekul buněčné adheze a katalytickou aktivitu, stejně jako působení na RNA (doplňkový obrázek 3(c)). KEGG dráha VEGFA a její sousední geny v KIRC byly zapojeny hlavně do signální dráhy AGE-RAGE u diabetických komplikací a signální dráhy PI3K-Akt (doplňkový obrázek 3(d)). Golgiho lumen, extracelulární matrice, ATPázový komplex a Z disk byly buněčné složky související s expresí VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s KICH (doplňkový obrázek 3(e)). Kromě toho hlavní biologické procesy zahrnující expresi VEGFA a jejích 50 hlavních změněných sousedních genů u pacientů s KICH byly udržování gastrointestinálního epitelu, negativní regulace organizace buněčných složek a hojení ran (doplňkový obrázek 3(f)) . Molekulární funkce VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s KICH byly aktivita ATPázy, vazba aktinových filamentů a vazba proteázy (doplňkový obrázek 3(g)). Transportéry ATP-binding cassette (ABC) a infekce virem lidské T-buněčné leukémie 1 byly zapojeny do analýzy KEGG dráhy VEGFA a jejích top 50 změněných sousedních genů u pacientů s KICH (doplňkový obrázek 3(h)). Kromě toho se buněčné složky související s VEGFA a jeho sousedními geny u pacientů s KIRP podílely hlavně na Golgiho lumenu a centriole (doplňkový obrázek 3 (I)). Kromě toho byly tkáňová homeostáza, homeostáza myeloidních buněk, zpracování O-glykanu a buněčná odpověď na lipidy hlavními biologickými procesy zapojenými do exprese VEGFA a jeho změněných sousedních genů u pacientů s KIRP (doplňkový obrázek 3(j)). Molekulární funkce VEGFA a jeho top 50 změněných sousedních genů u pacientů s KIRP zahrnovaly hlavně aktivitu transkripčního koaktivátoru, aktivitu peptidázy cysteinového typu a vazbu kalmodulinu (doplňkový obrázek 3(k)). Infekce Vibrio cholerae, dilatační kardiomyopatie a infekce lidským cytomegalovirem byly zapojeny do analýzy KEGG dráhy VEGFA a jejích změněných sousedních genů u pacientů s KIRP (doplňkový obrázek 3(l)).

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL

Cíle transkripčního faktoru VEGFA u pacientů s RCCPotenciální cíle transkripčního faktoru, kinázy a miRNA VEGFA u pacientů s RCC byly získány pomocí softwaru TRRUST (tabulka 1). Hypoxií indukovatelný faktor 1 alfa podjednotka (HIF1A), transkripční faktor AP-2 alfa (TFAP2A) a estrogenový receptor 1 (ESR1) byly klíčovými transkripčními faktory zapojenými do sítě VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s KIRC (P < 0.05).="" rora,="" setd2,="" vegfa="" a="" vhl="" mají="" regulované="" geny="" hif1a.="" kromě="" toho="" tfap2a="" reguloval="" funkce="" adra1a="" a="" vegfa.="" nr5a2="" a="" vegfa="" mají="" regulované="" geny="" esr1.="" ještě="" více="" byly="" klíčovými="" cíli="" transkripčního="" faktoru="" zapojeného="" do="" sítě="" vegfa="" a="" jeho="" sousedních="" genů="" signální="" převaděč="" a="" aktivátor="" transkripce="" 3="" (stat3),="" nukleární="" faktor="" zesilovače="" genu="" kappa="" lehkého="" polypeptidu="" v="" b-buňkách="" 1="" (nfkb1)="" a="" homeodoména.="" interagující="" proteinkinázou="" 2="" (hipk2)="" u="" pacientů="" s="" kich="" (p="">< 0.01).="" regulované="" geny="" stat3="" byly="" a2m,="" muc4,="" muc5b,="" tp53="" a="" vegfa.="" kromě="" toho="" nfkb1="" reguloval="" funkce="" a2m,="" muc5b,="" muc6,="" tnc,="" tp53="" a="" vegfa.="" tp53="" a="" vegfa="" mají="" regulované="" geny="" hipk2.="" kromě="" toho,="" forkhead="" box="" o3="" (foxo3),="" tfap2a="" (aktivující="" enhancer-vazebný="" protein="" 2="" alfa)="" a="" homolog="" 1="" onkogenu="" e26="" viru="" erytroblastózy="" v-ets="" (ets1)="" byly="" kritickými="" cíli="" transkripčního="" faktoru="" vegfa="" a="" jeho="" sousedních="" genů="" u="" pacientů="" s="" kirp="" (="" p="">< 0,05).="" navíc="" bcl2l11="" a="" vegfa="" regulují="" geny="" foxo3.="" navíc="" tfap2a="" reguloval="" funkce="" muc4="" a="" vegfa.="" casp1="" a="" muc4="" byly="" geny="" regulované="">

Kinázové a miRNA cíle VEGFA u pacientů s RCC Také jsme získali tři nejlepší kinázové cíle a miRNA cíle sítě VEGFA pomocí LinkedOmics (tabulka 2). Cílová síť VEGFA miRNA v KIRC byla spojena s ATAAGCT MIR-21 (P < 0.05).="" kromě="" toho="" byly="" cílem="" kináz="" vegfa="" kináza="" atm="" u="" pacientů="" s="" kich="" (p="">< 0.05).="" kromě="" toho="" kináza="" cdk1="" a="" kináza="" aurkb="" byly="" kinázovými="" cíli="" vegfa="" u="" pacientů="" s="" kirp="" (p="">< 0,05).="" cíle="" mirna="" vegfa="" byly="" (tcgatgg)="" mir-213,="" (tctgatc)="" mir-383="" a="" (caggtcc)="" mir-492="" u="" pacientů="" s="" kirp="" (p=""><>

Korelace odlišně exprimovaných genů a exprese VEGFA u pacientů s RCCZískali jsme data sekvenování mRNA 533 pacientů s KIRC v databázi TCGA společnosti LinkedOmics. Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 4(a), 20,158 genů bylo úzce spjato s VEGFA. Mezi nimi 11 417 a 8 741 genů vykazovalo pozitivní a negativní korelace s expresí VEGFA. Kromě toho 50 významných genů pozitivně a negativně korelovalo s expresí VEGFA u pacientů s KIRC (P < 0,05)="" (doplňkový="" obrázek="" 4="" (b)="" a="" (c)).="" navíc="" exprese="" vegfa="" měla="" silnou="" pozitivní="" asociaci="" s="" notch4="" (pearsonův="" korelační="" koeficient="0.7023," p="2.076e–80)" (doplňkový="" obrázek="" 5(a)),="" gpr4="" (pearsonova="" korelace{="" {19}}.702,="" p="2.63e–80)" (doplňkový="" obrázek="" 5(b))="" a="" trib2="" (pearsonova="" korelace="0.6972," p="8.902e–79" )="" (doplňkový="" obrázek="" 5(c))="" výrazy.="" dále="" jsme="" analyzovali="" data="" sekvenování="" mrna="" 66="" pacientů="" s="" kich="" v="" databázi="" tcga="" a="" zjistili="" jsme,="" že="" 19="" 216="" genů="" úzce="" souvisí="" s="" expresí="" vegfa.="" mezi="" nimi="" 8820="" a="" 10="" 396="" genů="" vykazovalo="" pozitivní="" a="" negativní="" korelace="" s="" expresí="" vegfa="" (doplňkový="" obrázek="" 4(d)).="" identifikovali="" jsme="" také="" 50="" významných="" genů,="" které="" pozitivně="" a="" negativně="" korelovaly="" s="" expresí="" vegfa="" u="" pacientů="" s="" kich="" (doplňkový="" obrázek="" 4(e)="" a="" (f)).="" kromě="" toho="" byla="" exprese="" vegfa="" pozitivně="" spojena="" s="" ckmt2="" (pearsonova="" korelace="0.6474," p="4.236e–9)" (doplňkový="" obrázek="" 5(d)),="" rragd="" (pearsonova="" korelace="0" .6279,="" p="1.673e–8)" (doplňkový="" obrázek="" 5(e))="" a="" ppargc1a="" (pearsonova="" korelace="0.6086," p="5.93e–8)" (doplňkový="" obrázek="" 5(f))="" výrazy.="" nakonec="" jsme="" analyzovali="" data="" sekvenování="" mrna="" 290="" pacientů="" s="" kirp="" v="" databázi="" tcga.="" kromě="" toho="" 20="" 023="" genů="" úzce="" souviselo="" s="" expresí="" vegfa.="" mezi="" nimi="" 11="" 130="" a="" 8="" 893="" genů="" vykazovalo="" pozitivní="" a="" negativní="" korelace="" s="" expresí="" vegfa="" vegfa="" (doplňkový="" obrázek="" 4="" (g)).="" identifikovali="" jsme="" 50="" významných="" genů,="" které="" pozitivně="" a="" negativně="" korelovaly="" s="" expresí="" vegfa="" u="" pacientů="" s="" kirp="" (doplňkový="" obrázek="" 4(h)="" a="" (i)).="" exprese="" vegfa="" byla="" pozitivně="" spojena="" s="" flt1="" (pearsonova="" korelace="0.8184," p="2.909e–71)" (doplňkový="" obrázek="" 5(g)),="" c6orf223="" (pearsonova="" korelace="0)." 7779,="" p="4.606e–60)" (doplňkový="" obrázek="" 5(h))="" a="" esm1="" (pearsonova="" korelace="0.7602," p="6.983e–56)" (doplňkový="" obrázek="" 5="" (i))="">

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL

Infiltrace imunitních buněk a exprese VEGFA u pacientů s RCCAbychom dále odhalili vztah mezi infiltrací imunitních buněk a expresí VEGFA u pacientů s RCC, zkoumali jsme korelaci mezi infiltrací imunitních buněk a expresí VEGFA pomocí softwaru TIMER. Úroveň exprese VEGFA u pacientů s KIRC byla pozitivně spojena s infiltrací CD8 plus T buněk (Cor=0.197, P=3.36e-5), CD4 plus T buněk ( Cor= 0.301, P=4.41e-11) a neutrofily (Cor =0.223, P= 1.44e -6) (doplňkový obrázek 6(a)). Dále jsme analyzovali korelaci mezi infiltrací imunitních buněk a expresí VEGFA u pacientů s KICH. Infiltrace B (Cor=0.349, P=4.39e-3), CD8 plus T (Cor= 0.398, P=1.03e -5) a dendritické buňky (Cor=0.253, P=4.18e-2) byly pozitivně spojeny s expresí VEGFA (doplňkový obrázek 6(b)) . Konečně, hladina exprese VEGFA u pacientů s KIRC byla pozitivně spojena s infiltrací B (Cor= 0.16, P=1.04e-2), CD8 plus T (Cor{ {41}}.179, P=0.384e-3) a CD4 plus T buňky (Cor=0.157, P=1.14e-2 ) (doplňkový obrázek 6(c)). Infiltrace makrofágy (Cor=-0,226, P=3.22e-4) však byla negativně spojena s expresí VEGFA (doplňkový obrázek 6(c)).

Diskuse

VEGFA, člen rodiny VEGF, je důležitým cytokinem a předním induktorem angiogeneze.22 Předklinické studie uvádějí, že VEGFA je nadměrně exprimován u pacientů s RCC.23,24 Nicméně úroveň exprese VEGFA u pacientů s RCC zůstává kontroverzní .25,26 Nádorová angiogeneze hraje zásadní roli v progresi RCC. Léky zacílené na nádorovou angiogenezi se v léčbě RCC používají již téměř 20 let.27 Terapeutické účinky těchto léků však stále nejsou ideální a je třeba omezit jejich vedlejší účinky. Snažili jsme se odhalit genovou regulační síť, prognostickou hodnotu a cílovou predikci VEGFA u pacientů s RCC.

Dále jsme zkoumali hladinu exprese VEGFA a korelaci mezi rozdílnou expresí VEGFA a patologickým stadiem u pacientů s RCC. Exprese VEGFA byla upregulována u pacientů s KIRC a KICH spíše než u normálních jedinců. Nicméně pacienti s KIRP měli downregulovanou expresi VEGFA. Tato zjištění byla podobná zjištěním předchozí studie u pacientů s KIRC, KICH a KIRP,26,28 a byla v rozporu s předchozími zjištěními studie u pacientů s KICH.25 Pokusili jsme se vysvětlit protichůdné výsledky změnou genů a metylací promotoru u pacientů s RCC. Zjistili jsme, že genetické změny se vyskytly u 4 procent, 8 procent a 4 procent pacientů s KIRC, KICH a KIRP. Navíc hladina methylace promotoru VEGFA byla nižší u pacientů s různými KIRC stádii než u zdravých jedinců; naproti tomu hladina methylace promotoru VEGFA byla vyšší u pacientů s KIRP 1. stupně. Mezi pacienty s KICH a zdravými jedinci však nebyly nalezeny žádné rozdíly v hladině metylace promotoru VEGFA. Proto předpokládáme, že genetická alterace a metylace VEGFA může být hlavní příčinou různých expresí VEGFA u pacientů s RCC. Exprese VEGFA a patologická stadia KIRC a KIRP. Kromě toho přežití pacientů s KIRP s nízkými hladinami exprese VEGFA bylo delší než přežití pacientů s KIRP s vysokými hladinami exprese VEGFA. Je pozoruhodné, že jsme získali opačné výsledky po 100 měsících u pacientů s KIRP na základě křivek přežití bez onemocnění. Hladina exprese VEGFA tedy může být prognostickým indikátorem u pacientů s KIRP. Některé studie ukázaly, že exprese VEGF může být základním rysem pokročilého RCC. Detekce koexprese CD147/VEGF může pomoci předpovědět prognózu pacientů s pokročilým RCC.29

Navíc 50 nejčastějších sousedních genů VEGFA bylo změněno u pacientů s RCC podle následujících frekvencí: větší nebo rovno 11,11 procenta (KIRC), větší nebo rovno 20 procent (KICH) a větší nebo rovné 9,09 procenta (KIRP). Poté jsme prozkoumali potenciální interakce a funkce VEGFA a jeho sousedních genů; bylo zjištěno, že mají složité a těsné spojovací sítě. U pacientů s KIRC se tyto geny podílely především na metylaci proteinů. U pacientů s KICH však sousední geny VEGFA fungovaly při glykosylaci proteinů a udržování buněčné struktury. Kromě toho sousední geny VEGFA souvisely hlavně s růstem a diferenciací svalových vláken u pacientů s KIRP. Dynamické změny v metylaci proteinů jsou zásadní pro určení buněčného osudu a vývoj buněk. K methylaci proteinů dochází primárně na postranních řetězcích zbytků Lys a Arg.30 Například methylace histonů je běžně pozorována u rakovin s methylací na zbytcích Lys a Arg.31 Aberantní methylace a O-glykosylace jsou běžné epigenetické modifikace nádoru. Aberantní O-glykosylace přispívá k rozvoji rakoviny prostřednictvím přímé indukce onkogenních vlastností v rakovinných buňkách.32 KIRP je maligní nádorledvinovéparenchym mající papilární nebo tubulární papilární strukturu s vazivovou cévní osou. Výskyt KIRP může být spojen s výskytem RCC se stromatem podobným angioleiomyomu (také známým jako stroma hladkého svalstva nebo leiomyomového stroma), a to díky značné podobnosti jejich imunohistochemických fenotypů.33 Výše ​​uvedené důkazy ukazují, že sousední geny VEGFA mohou ovlivnit výskyt a progrese RCC.

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL

Kromě toho analýza obohacení GO odhalila, že funkce VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s KIRC souvisejí hlavně s vazbou molekul buněčné adheze a katalytickou aktivitou, stejně jako s působením na RNA. Adhezní molekula epiteliálních buněk (EPCAM) nedávno získala pozornost jako kandidátní protein pro diagnostiku, prognózu a léčbu různých nádorů. EPCAM je nezávislý prognostický molekulární marker u RCC a může poskytnout pomocnou informaci pro lepší prognózu.34 Zjistili jsme, že aktivita ATPázy, vazba aktinových filament a vazba proteázy byly molekulárními funkcemi VEGFA a jejích sousedních genů u pacientů s KICH. Je známo, že u pacientů s KICH35 dochází k mitochondriálním morfologickým a funkčním změnám; Změna aktivity ATPázy může být potenciálním patogenním mechanismem. K potvrzení tohoto mechanismu jsou však nutné další studie. V naší studii molekulární funkce VEGFA a jeho změněných sousedních genů u pacientů s KIRP zahrnovaly především aktivitu transkripčního koaktivátoru, aktivitu peptidázy cysteinového typu a vazbu na kalmodulin. Kalmodulin je všudypřítomný intracelulární protein vázající vápník údajně spojený s buněčným cyklem. Je známo, že pacienti s RCC vykazují pozitivní korelaci mezi obsahem kalmodulinu v nádoru a rychlostí růstu nádoru.36 Zjistili jsme, že signální dráha AGE-RAGE u diabetických komplikací, signální dráha PI3K-Akt, působení transportéru ABC a virus lidské leukémie T-buněk 1 infekce se podílela hlavně na analýze KEGG dráhy VEGFA a jejích sousedních genů u pacientů s RCC; tyto procesy úzce souvisejí s výskytem a progresí rakoviny.37 Regulace těchto signálních drah tedy může být potenciálním cílem léčby RCC.

Analyzovali jsme také cíle a regulátory VEGFA u pacientů s RCC. Nejprve jsme prozkoumali cíle transkripčního faktoru VEGFA a jeho sousedních genů u pacientů s RCC a zjistili jsme, že HIF1A, TFAP2A a ESR1 byly rozhodujícími regulačními faktory u pacientů s KIRC. HIF-1 je klíčový genový regulátor zapojený do buněčné odpovědi na hypoxii. Nadměrná exprese HIF-1 je spojena s patogenezí RCC; navíc funkční polymorfismus HIF1A může vést k náchylnosti k RCC a polymorfismus HIF1A může ovlivnit recidivu, progresi a přežití RCC.38 TFAP2A a ESR1 však nebyly u pacientů s RCC hlášeny. Také jsme zjistili, že STAT3, NFKB1 a HIPK2 byly významně regulované faktory u pacientů s KICH. Proteiny STAT3 jsou klíčové transkripční faktory, které jsou abnormálně aktivovány u různých malignit, včetně RCC.39 Inhibice STAT3 může bránit migraci a invazi buněk RCC.40

NFKB1 souvisí s patogenezí mnoha maligních nádorů, včetně RCC. Funkční polymorfismus promotoru NFKB1 je spojen se zvýšeným rizikem RCC.41 HIPK2 hraje jedinečnou roli v regulaci buněčné apoptózy a proliferace, stejně jako při opravě poškození DNA a dalších základních procesech; HIPK2 tedy přitahuje stále větší pozornost. Fosforylace FOXM1 pomocí HIPK2 podporuje transkripční aktivitu a proliferaci buněk FOXM1 u pacientů s RCC, což může být potenciální mechanismus léčby RCC.42 V naší studii bylo zjištěno, že FOXO3, TFAP2A a ETS1 jsou kritickými cíli transkripčních faktorů VEGFA a jeho sousedních genů. u pacientů s KIRP. FOXO3-zprostředkovaná exprese fosfofruktokinázy-M inhibuje růst, migraci a invazi RCC buněk,43 FOXO3 lze použít jako nový biomarker jako nový terapeutický cíl v léčbě RCC.44 Zdá se, že ETS1 je klíčovým transkripčním faktorem v extracelulárním remodelace matrice během angiogeneze; může se podílet na angiogenezi RCC.45 Dále jsme zkoumali kinázové cíle spojené s VEGFA (ATM v KICH, stejně jako CDK1 a AURKB v KIRP) a miRNA cíle spojené s VEGFA (MIR-21 v KIRC; MIR{ {23}}, MIR-383 a MIR-492 v KIRP). Během posledního desetiletí mnoho studií ukázalo, že poruchy nebo mutace proteinkináz hrají kauzální roli ve výskytu rakoviny. Výzkum rakoviny prokázal kritickou roli mnoha proteinkináz v lidské tumorigenezi a progresi rakoviny, díky čemuž jsou tyto molekuly účinnými kandidáty pro nové cílené terapie.46 Inhibitory kináz způsobily revoluci v léčbě určitých typů maligních nádorů.47 miRNA jsou třídou ne kódující RNA, které hrají zásadní roli v regulaci genové exprese. Inhibitory miRNA snižují expresi cílových genů interakcí s 3′ nepřeloženou oblastí cílových genů. Jejich důležitá role v regulaci exprese tumor supresorových genů a exprese onkogenů zvyšuje jejich roli v tumorigenezi.48 Objev cílů miRNA může nakonec objasnit mechanismy, které jsou základem tumorigeneze a vývoje protirakovinných léčiv.49 Tato studie poskytuje referenci a zdůrazňuje význam dalšího analýzy regulovaných faktorů, kináz a miRNA jako potenciálních terapeutických cílů pro léčbu RCC.

Zkoumali jsme korelaci mezi odlišně exprimovanými geny a expresí VEGFA u pacientů s RCC. Více než 10000 genů pozitivně a negativně korelovalo s expresí VEGFA u pacientů s RCC. Mezi nimi byly u pacientů s RCC nalezeny geny s nejvyšší korelací s VEGFA: NOTCH4, GPR4 a TRIB2 v KIRC; CKMT2, RRAGD a PPARGC1A v KICH; a FLT1, C6orf223 a ESM1 v KIRP. Zacílení těchto genů souvisejících s rakovinou však může poskytnout adjuvantní terapii RCC. Imunoinfifiltrace RCC úzce souvisí s klinickou prognózou.50 K transportu imunitních buněk do rakovinných míst docházelo především prostřednictvím krevních cév. Jak se očekávalo, zjistili jsme, že exprese VEGFA u pacientů s RCC byla pozitivně spojena s infiltrací imunitních buněk, včetně CD8 plus T buněk, CD4 plus T buněk, makrofágů, neutrofilů a dendritických buněk. Doufáme, že zlepšíme infiltraci RCC imunitními buňkami vývojem léků působících na VEGFA nebo regulační cíle související s VEGFA. Závěrem lze říci, že zkoumáním úrovně exprese a sítě genové regulace VEGFA u pacientů s RCC jsme poskytli více informací o studiu a léčbě RCC. Dále jsme identifikovali nové terapeutické cíle a prognostické biomarkery pro přesnou predikci přežití pacientů s RCC.