Synergické protizánětlivé účinky extraktu Laminaria Japonica Fucoidan a Cistanche Tubulosa

Jako imunitní odpověď proti cizím antigenům uvolňují makrofágy prozánětlivé cytokiny, jako je tumor nekrotizující faktor- (TNF- ), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 a další. Takové cytokiny indukují chemotaktický příliv granulocytů, monocytů, lymfocytů a žírných buněk do poškozené tkáně, což podporuje odstranění antigenu a obnovu tkáně. Nadměrná infiltrace a aktivace buněk však zhoršuje poškození tkáně, což vede k edému (cévní exsudaci) a bolesti, což jsou dobře známé jevy zánětu.

TNF- je důležitým faktorem pro indukci exprese genu syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v několika buněčných liniích. Aktivace iNOS vede k produkci oxidu dusnatého (NO), který nejen moduluje několik fyziologických funkcí, jako je baktericidní a vazodilatace, ale také způsobuje zánět. Po poškození tkáně degradací fosfolipáz fosfolipidů buněčné membrány vzniká kyselina arachidonová. Kyselina arachidonová se dále rozkládá pomocí cyklooxygenázy (COX) na prostaglandiny (PG). Nadměrné množství PGE2 tvořené COX-II indukuje několik cytokinů pro zánět. Protože NO i PGE2 působí jako hlavní faktory pro zánět a indukci bolesti, jsou dráhy TNF-–NO a COX-II–PGE2 hlavními proudy zánětlivého procesu, které jsou inhibovány kortikosteroidy a nesteroidnímiprotizánětlivé léky(NSAID), resp.

I když existuje několik steroidů a NSAIDterapii zánětlivých onemocněníTyto léky mohou mít nežádoucí účinky na imunitní systém, gastrointestinální trakt, ledviny, játra, centrální nervový systém, krevní tlak a kardiovaskulární systém. Proto je nutné minimalizovat nepříznivé účinky chemických terapeutik jejich nahrazením nebo použitím v kombinaci s přírodními produkty.

Fucoidan, sulfátový polysacharidový komplex z mořských řas, jako je Laminaria japonica a Cladosiphon okamuranus široce rozšířený v mnoha zemích, se již dlouhou dobu používá jako léčivo v orientální medicíně. V předchozích studiích bylo prokázáno, že fukoidan má antioxidační, antikoagulační, protirakovinné aprotizánětlivé aktivity. V souladu s tím přitahují pozornost výzkumníků příznivé účinky fukoidanu na zánětlivá onemocnění, ischemii, imunitní dysfunkci a nádory. Na druhé straně,Cistanche tubulosa(CT) byl také široce používán jako tradiční lék v Číně. Bylo publikováno, že CT extrakty snižují produkci TNF-á a IL- 4, což jsou hlavní faktory pro produkci NO v zánětlivých drahách [19].

Tato předchozí zjištění nás vedla ke zkoumání kombinované účinnosti fukoidanu a CT extraktu na 2 hlavní dráhy zánětu. Abychom objasnili mechanismus účinku, analyzovali jsme NO a PGE2 v exsudátech ze zánětu vzduchových váčků vyvolaného karagenanem.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO PREVENCIZÁNĚTLIVÉ AKTIVITYPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiály a metody

Materiály

Poločištěný fukoidan a vodný extrakt CT byly získány od Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan a CT extrakt byly udržovány při 4 stupních, smíchány (1:3) rozpuštěny v purifikované vodě před použitím a orálně podávány v objemu 5 ml/kg.

Buněčná kultura a kvantifikace NO

Buněčná linie myších makrofágů RAW 264.7 byla zakoupena od American Type Culture Collection (Manassas, USA) a kultivována v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (Sigma, St. Louis, USA) obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra a antibiotika [100 U/ml penicilin (Sigma) a 100 ug/ml streptomycinu (Sigma)]. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře 5% CO2 při 37 stupních.

Pro posouzení účinků fukoidanu a CT extraktu na sekreci NO byly buňky RAW 264.7 (1×106 buněk/ml) inkubovány s fukoidanem nebo CT extraktem (1–320 µg/ml) po dobu 5 minut a následně interferon- (IFN-, 10 U/ml) a lipopolysacharid (LPS, 10 ug/ml) po dobu 24 hodin. V našich předběžných studiích bylo potvrzeno, že ošetření pomocí IFN-plus LPS pro aktivaci buněk RAW 264.7 neovlivnilo životaschopnost buněk až do 24 hodin a že fukoidan a CT extrakt nebyly cytotoxické do 1 mg/ml. Jako indikátor NO byla měřena koncentrace dusitanů (NO2 – ), oxidovaného produktu NO. Kultivační médium bylo smícháno se stejným objemem Griessova činidla (1% sulfanilamid, 0,1% naftylethylendiamin v 2,5% kyselině fosforečné) [21] a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Koncentrace dusitanů byla analyzována při 540 nm, kde byl použit NaN02 pro vytvoření standardní křivky.

Zvířata a léčba

Samci myší ICR (ve věku 7 týdnů) byli zakoupeni od Daehan Biolink (Eumseong, Korea) a umístěni v místnosti s konstantními podmínkami prostředí (22±2ºC; 40-70% relativní vlhkost; 12-hodina světla -tmavý cyklus; 150-300 lux jas). Krmivo pro pelety a čištěná voda byly dostupné ad libitum. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Chungbuk National University (CBNU), Korea a byly provedeny podle standardních operačních postupů (SOP) Laboratory Animal Research Center, CBNU.

Myším (n{0}}/skupina) byl orálně podáván fukoidan (18 nebo 54 mg/kg), CT extrakt (54 nebo 162 mg/kg) nebo jejich směs (18+54, {{6 }} nebo 90+270 mg/kg) jednou denně po dobu 7 dnů. Nízké dávky fukoidanu (18 mg/kg) a CT extraktu (54 mg/kg) pocházely z odhadovaných dávek pro člověka 100 mg/tělo (70 kg) a 300 mg/tělo po přenesení povrchové plochy tělesné hmotnosti (Km{14 }} pro člověka/Km=3 pro myš). Vysoké dávky fukoidanu a CT extraktu byly nastaveny na 3 násobky, samostatně nebo ve směsi, a směs s nejvyšší dávkou byla fixována na 5 násobek pro posouzení maximálních synergických účinků.

První den léčby fukoidanem a CT extraktem bylo myším subkutánně injikováno 10 ml sterilního vzduchu do zadní strany, aby se vytvořil váček [22,23]. Po 2 a 5 dnech se do vaku znovu vstříklo 5 ml vzduchu. Jednu hodinu po konečném ošetření byl do sáčku injikován 1 ml karagenanu (1% ve fyziologickém roztoku; Sigma) nebo jeho vehikulum (fyziologický roztok).

Analýzy exsudátů

Vzduchový vak byl promyt 1 ml studeného fyziologického roztoku 6 hodin po injekci karagenanu a byl zaznamenán čistý objem výplachové tekutiny. Celkové počty zánětlivých buněk, neutrofilů, monocytů a lymfocytů byly stanoveny za použití coulter counter. Koncentrace NO a PGE2 byly stanoveny Griessovým činidlem (Sigma) a enzymovým imunotestem (EIA) za použití soupravy Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO BLOKOVÁNÍ ÚČINKU NA ZÁNĚTLIVÉ BUNĚČNÉ CHEMOTAXI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologické vyšetření

Tkáň lemující váček byla odstraněna a fixována v neutrálním roztoku formalínu. Tkáňová sklíčka zalitá v parafínu byla obarvena hematoxylinem-eosinem a vyšetřena pod světelným mikroskopem na zánětlivé léze.

Statistická analýza

Výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SE. Srovnání experimentálních skupin byla provedena jednosměrnou analýzou rozptylu následovanou korekcí Tukeyova testu. Hodnota AP<0.05 was considered statistically significant.

Výsledky

In vitro kultivace buněk RAW 264.7, ošetření IFN- a LPS výrazně zvýšily produkci NO (obrázek 1). Předběžné ošetření fukoidanem (1–320 µg/ml) neovlivnilo uvolňování NO z makrofágové buněčné linie (obrázek 1A). Pro srovnání, CT extrakt (32–320 µg/ml) významně potlačoval produkci NO, což svědčí o protizánětlivé aktivitě (obrázek 1B).

Injekce karagenanu do vzduchového vaku myši výrazně zvýšila objem exsudátu ve vaku (obrázek 2). Taková zvýšená exsudace byla zmírněna ošetřením fukoidanem (18 mg/kg) a CT extraktem (54 a 162 mg/kg). Je pozoruhodné, že kombinační léčba fukoidanem a CT extraktem dále snížila objem exsudátů ve srovnání s individuálními účinky, ačkoli kombinace vyšších dávek (54+162 mg/kg a 90+270 mg/kg) nevykazovaly další účinnost na nejnižší kombinaci dávek (18+54 mg/kg) (obrázek 2A). Obsah N stupně ve váčku se také drasticky zvýšil po injekci karagenanu (obrázek 2B). Ve srovnání s mírným účinkem fukoidanu CT extrakt výrazně snížil koncentraci N stupně. Kombinovaná léčba fukoidanem a CT extraktem dále snižovala hladinu NO v závislosti na dávce. Podobně byl zvýšený obsah PGE2 synergicky potlačen kombinační terapií fukoidanem a CT extraktem (obrázek 2C).

Paralelně se zánětlivými mediátory ve váčku se počet zánětlivých buněk drasticky zvýšil injekcí karagenanu: 37,8, 4,8 a 24,1 násobek kontrolních hladin pro neutrofily, monocyty a lymfocyty, v daném pořadí (tabulka 1). Fucoidan a CT extrakt však významně snížily infiltraci zánětlivých buněk, ve které byl fukoidan poněkud lepší než CT extrakt. Neočekávaně nebylo při současném podávání fukoidanu a CT extraktu dosaženo žádného synergického účinku v infiltraci zánětlivých buněk.

Jak lze usuzovat z infiltrace zánětlivých buněk v exsudátech, podkožní tkáň obklopující vzduchové váčky vykazovala závažné zánětlivé léze (obrázek 3). Bylo pozorováno obrovské množství buněk v zesílené podkožní tkáni vystavené karagenanu (obrázek 3B), ve srovnání s téměř normálními rysy u kontrolních zvířat (obrázek 3A). Takové zánětlivé léze byly pozoruhodně zmírněny léčbou fukoidanem (obrázky 3C a 3D) nebo CT extraktem (obrázky 3E a 3F).

Je pozoruhodné, že vyšší protizánětlivé účinky byly získány kombinační terapií s fukoidanem a CT extraktem (obrázky 3G-3I).

Diskuse

Při použití modelu zánětu vzduchových váčků indukovaného arageenanem in viv, injekce vzduchu do zad hlodavců indukuje proliferaci buněk, které se rozvrstvují na povrchu dutiny a vytvářejí strukturu podobnou synoviu. V tomto modelu injekce karagenanem indukované infiltrace zánětlivých buněk zvýšila exsudát, což svědčí o vaskulárním prosakování. Vzduchový vak slouží jako zásobník zánětlivých buněk a mediátorů, které lze snadno měřit v tekutině, která se lokálně hromadí.

Mezi různými zánětlivými mediátory, které mohou indukovat vaskulární permeabilitu, je dobře známo, že NO a PGE2 jsou hlavními faktory zapojenými do patogeneze mnoha zánětlivých onemocnění. Jsou také známé jako mediátory indukce a vnímání bolesti. iNOS, který je exprimován a aktivován v různých typech buněk stimulací TNF- a/nebo LPS během zánětu, produkuje vysoké trvalé koncentrace NO. NO je důležitou regulační molekulou v různých fyziologických funkcích, jako je vazodilatace vedoucí k vaskulárnímu prosakování. PGE2, který je generován z kyseliny arachidonové prostřednictvím COX, přispívá k rozvoji mnoha zánětlivých onemocnění a nadprodukce PGE2 v reakci na různé zánětlivé stimulace je spojena s up-regulací hladin COX-II a progresí zánětu. Proto byly dráhy TNF- - NO a COX-II-PGE2 považovány za dva hlavní proudy zánětlivých procesů, které jsou blokovány inhibitory iNOS (kortikosteroidy) a COX (NSAID).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZÁKAZ ZÁNĚTLIVÝCH NEMOC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V této studii společné podávání fukoidanu a CT extraktu snížilo objem exsudátu ve vaku, což naznačuje, že mají supresivní aktivitu proti vaskulárnímu prosakování (obrázek 2A). Ve srovnání s individuálními účinky každého fukoidanu a CT extraktu se kombinační léčba dále zvýšila, což znamená, že sloučeniny 2. stupně působí synergicky. Takové synergické účinky mezi fukoidanem a CT extraktem byly podpořeny jejich aktivitami na hladinách NO a PGE2 v exsudátech (obrázky 3B a 2C).

Je však zajímavé, že bylo potvrzeno, že fukoidan přímo neinhibuje aktivaci makrofágů in vitro test (obrázek 1A). Podobně inhibiční potenciál fukoidanu na akumulaci NO a PGE2 in vivo byl relativně nižší než u CT extraktu (obrázky 2B a 2C). Takový mechanismus účinku fukoidanu se liší od přímé inaktivace buněk extraktem CT (obrázek 1B). Pro srovnání, fukoidan projevoval vysokou účinnost při inhibici infiltrace zánětlivých buněk ve váčcích (tabulka 1). Fucoidan byl lepší než CT extrakt v blokování migrace neutrofilů, monocytů a lymfocytů do míst poškození tkáně vyvolané karagenanem. Zajímavé je, že nedošlo k žádnému synergickému antimigračnímu účinku, který ukazuje na různé mechanismy působení mezi fukoidanem a CT extraktem: tj. fukoidan blokuje infiltraci zánětlivých buněk, zatímco CT extrakt inhibuje aktivaci buněk.

Polymorfonukleární buňky, zejména neutrofily, jsou hlavními buněčnými složkami rekrutovanými do akutních zánětlivých míst vyvolaných karagenanem. Kromě toho, následné zánětlivé buňky, jako jsou makrofágy a lymfocyty, také hrají ústřední roli v zánětlivém procesu sekrecí cytokinů. Při předběžném ošetření fukoidanem nebo CT extraktem byl počet bílých krvinek, které migrovaly do vzduchových váčků s injekcí karagenanu, výrazně potlačen. Tento výsledek byl v souladu s účinkem, kterého by bylo dosaženo kortikosteroidy, jako je dexamethason, ale ne NSAID včetně indometacinu. Proto se předpokládá, že fukoidan a CT extrakt mají zčásti vlastnosti steroidů.

Kromě blokujícího účinku na chemotaxi zánětlivých buněk se zdá, že CT extrakt potlačuje aktivaci makrofágů. To bylo potvrzeno jeho inhibičním působením na NO in vitro a in vivo, což je hlavní zánětlivý mediátor produkovaný makrofágy. Účinek CT extraktu na makrofágy by tedy mohl být způsoben supresí exprese mRNA a/nebo přímou inhibicí aktivity iNOS v těchto buňkách.

PGE2 je také jedním z hlavních zánětlivých mediátorů. Zvyšuje se paralelně s tkáňovým edémem, který je potlačován NSAID, inhibitory COX. Karagenan může zvýšit produkci PGE2 indukcí COX-II mRNA a COX-II proteinu v exsudátu váčku. V tomto modelu karagenan významně zvýšil množství PGE2 a bylo podstatně potlačeno CT extraktem. Je zajímavé poznamenat, že tento výsledek byl v souladu s účinkem, kterého by se dosáhlo u NSAID indometacinu. Z výsledků se proto usuzuje, že extrakt z CT má další vlastnosti NSAID. Celkově vzato se má za to, že CT extrakt uplatňoval kortikosteroidy i účinky podobné NSAID v modelu zánětu vyvolaného karagenanem a že fukoidan zesilovalprotizánětlivé účinky CT extraktublokováním infiltrace zánětlivých buněk.

Ačkoli definování přesného mechanismu účinku vyžaduje další studium, směs fukoidanu a CT extraktu výrazně zmírnila zánětlivé příznaky tím, že blokovala dráhy TNF-–NO a COX-II–PGE2 při zánětu vzduchových váčků vyvolaném karagenanem. Tato zjištění poskytují důkaz, že kombinovaná léčba fukoidanem a CT extraktem může být slibným kandidátem na úlevu od různých typů zánětů, které reagují na kortikosteroidy nebo NSAID.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZÁKAZ ZÁNĚTLIVÝCH NEMOC PHGS75% ECH 30% ACT 12%