Synergické protizánětlivé účinky extraktu Laminaria Japonica Fucoidan a Cistanche Tubulosa
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Abstraktní
Theprotizánětlivéúčinky fukoidanu aCistanche tubulosa (CT) extrakty byly zkoumány v kultivačním systému makrofágů Vitro a in vivo modelu zánětu vzduchových váčků indukovaného karagenanem.Cistanche Tubulosaextrakt inhiboval produkci oxidu dusnatého z aktivovaných makrofágových buněk RAW 264.7, zatímco fukoidan byl neaktivní. In vivo model zánětu vzduchových váčků, karagenanem indukovaná vaskulární exsudace a zvýšené koncentrace oxidu dusnatého a prostaglandinu E2 v exsudátech byly synergicky potlačeny současným podáváním fukoidanu resp.Cistanche Ttubulosavýpis. Kromě toho byl zánět tkáně podstatně zmírněn kombinační terapií. Nedošlo však k žádnému synergickému účinku protizánětlivébuněčná infiltrace, i když fukoidan a CT(Cistanche tubulosa)extrakt každý výrazně snížil počet buněk. Proto se předpokládá, že fukoidan blokuje infiltracizánětlivébuňky, zatímco CT (Cistanche tubulosa) extrakt inhibuje aktivaci buněk a jejich kombinační léčba by mohla být slibným kandidátem na úlevu od různých typů zánětů.
Klíčová slova: Carrageenan, zánět, fukoidan, extrakt z Cistanche tubulosa.
Jako imunitní odpověď proti cizím antigenům uvolňují makrofágy prozánětlivé cytokiny, jako je tumor nekrotizující faktor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), IL-6 a další [1,2]. Takové cytokiny indukují chemotaktický příliv granulocytů, monocytů, lymfocytů a žírných buněk do poškozené tkáně, což podporuje odstranění antigenu a obnovu tkáně [3,4]. Nadměrná infiltrace a aktivace buněk však zhoršuje poškození tkáně, což vede k edému (cévní exsudaci) a bolesti, což jsou dobře známé jevy zánětu.
TNF- je důležitým faktorem pro indukci exprese genu syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v několika buněčných liniích. Aktivace iNOS vede k produkci oxidu dusnatého (NO)[5-7], který nejen moduluje několik fyziologických funkcí, jako je baktericidní a vazodilatace ale také způsobuje zánět [8,9]. Po poškození tkáně degradací fosfolipáz fosfolipidů buněčné membrány vzniká kyselina arachidonová. Kyselina arachidonová je dále rozkládána cyklooxygenázou (COX) na prostaglandiny (PG) [10]. Nadměrné množství PGE2 tvořeného COX-II indukuje několik cytokinů pro zánět. Protože NO i PGE2 působí jako hlavní faktory zánětu a indukce bolesti, jsou dráhy TNF- a COX-II-PGE2 hlavními proudy zánětlivého procesu, které jsou inhibovány kortikosteroidy a nesteroidnímiprotizánětlivéléky (NSAID), respektive [10,11].
I když existuje několik steroidů a NSAID pro léčbu zánětlivých onemocnění, tyto léky mohou mít nežádoucí účinky na imunitní systém, gastrointestinální trakt, ledviny, játra, centrální nervový systém, krevní tlak a kardiovaskulární systém [12-14 ]. Proto je nutné minimalizovat nepříznivé účinky chemických terapeutik jejich náhradou nebo jejich používáním v kombinaci s přírodními produkty.
Fucoidan, sulfátový polysacharidový komplex z mořských řas, jako je Laminaria japonica a Cladosiphonokamuranus široce rozšířený v mnoha zemích, se již dlouhou dobu používá jako terapeutika v orientální medicíně. V předchozích studiích bylo prokázáno, že fukoidan má antioxidační, antikoagulační, protirakovinné aprotizánětlivéčinnosti [15,16]. V souladu s tím přitahují pozornost výzkumníků příznivé účinky fukoidanu na zánětlivá onemocnění, ischemii, imunitní dysfunkci a nádory [17,18]. Na druhou stranu,Cistanche tubulosa(CT) byl také široce používán pro tradiční léky v Číně. Bylo publikováno, že CT extrakt snižuje produkci TNF-á a IL-4, které jsou hlavními faktory produkce NO v zánětlivé dráze [19].
Tato předchozí zjištění nás vedla ke zkoumání kombinované účinnosti fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa)extrakt na 2 hlavní cesty zánětu. Abychom objasnili mechanismus účinku, analyzovali jsme NO a PGE2 v exsudátech ze zánětu vzduchových váčků vyvolaného karagenanem [20].
Materiály a metody
Materiály
Poločištěný fukoidan a vodní extrakt CT(Cistanche tubulosa)byly získány od Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan a CT extrakt byly udržovány při 4oC, smíchány (1:3) a rozpuštěny v purifikované vodě před použitím a orálně podávány v objemu 5 ml/kg
Buněčná kultura a kvantifikace NO
Buněčná linie myších makrofágů RAW 264.7 byla zakoupena od American Type Culture Collection (Manassas, USA) a kultivována v Dulbeccově modifikovaném orlím médiu (Sigma, St. Louis, USA) obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra a antibiotika [100 U/ml penicilinu ( Sigma) a 100 ug/ml streptomycinu (Sigma)]. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2 při 37 °C.
Posoudit účinky fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa)extrakt na sekreci NO, buňky RAW 264.7 (1×106 buněk/ml) byly inkubovány s fukoidanem nebo CT extraktem (1–320 µg/ml) po dobu 5 minut a následně interferonem- (IFN- 10 U/ml) a lipopolysacharid (LPS, 10 ug/ml) po dobu 24 hodin. V našich předběžných studiích bylo potvrzeno, že ošetření pomocí IFN-plus LPS pro aktivaci buněk RAW 264.7 neovlivnilo životaschopnost buněk až do 24 hodin a že fukoidan a CT extrakt nebyly cytotoxické do 1 mg/ml. Jako indikátor NO byla měřena koncentrace dusitanu (NO2–), oxidovaného produktu NO. Kultivační médium bylo smícháno se stejným objemem Griessova činidla (1 procento sulfanilamidu, 0,1 procenta naftylethylendiamidu ve 2,5 procentech kyseliny fosforečné) [21] a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Koncentrace dusitanů byla analyzována při 540 nm, kde byl použit NaN02 pro vytvoření standardní křivky.
Zvířata a léčba
Samci myší ICR (ve věku 7 týdnů) byli zakoupeni od Daehan Biolink (Eumseong, Korea) a umístěni v místnosti s konstantními podmínkami prostředí (22±2ºC; 40-70 procenta relativní vlhkosti; 12-hodina světla -tmavý cyklus;150-300 lux jas). Krmivo pro pelety a čištěná voda byly dostupné ad libitum. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny výborem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Chungbuk National University (CBNU), Korea a byly provedeny podle standardních operačních postupů (SOP) LaboratoryAnimal Research Center, CBNU.
Myši (n{0}}/skupina) byly perorálně léčeny fukoidanem (18 nebo 54 mg/kg), CT(Cistanche tubulosa)extrakt (54 nebo 162 mg/kg) nebo jejich směs (18 plus 54, 54 plus 162 nebo 90 plus 270 mg/kg) jednou denně po dobu 7 dnů. Nízké dávky fukoidanu (18 mg/kg) a CT extraktu (54 mg/kg) pocházely z odhadovaných dávek pro člověka 100 mg/tělo (70 kg) a 300 mg/tělo po převodu povrchové plochy tělesné hmotnosti (Km{14 }} pro člověka/Km=3 pro myš). Vysoké dávky fukoidanu a CT extraktu byly nastaveny na 3 násobky, samostatně nebo ve směsi, a směs s nejvyšší dávkou byla fixována na 5 násobek, aby se vyhodnotily maximální synergické účinky.
Na 1. den fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa)ošetření extraktem bylo myším subkutánně injikováno 10 ml sterilního vzduchu do zadní strany, aby se vytvořil váček [22,23]. Po 2 a 5 dnech se do vaku znovu vstříklo 5 ml vzduchu. Jednu hodinu po konečném ošetření byl do sáčku injikován 1 ml karagenanu (1 procento ve fyziologickém roztoku; Sigma) nebo jeho vehikulum (fyziologický roztok).
Analýzy exsudátů
Vzduchový vak byl promyt 1 ml studeného fyziologického roztoku 6 hodin po injekci karagenanu a byl zaznamenán čistý objem výplachové tekutiny. Celkový počet zánětlivých buněk, neutrofilů, monocytů a lymfocytů byl stanoven za použití colter counter. Koncentrace NO a PGE2 byly stanoveny Griessovým činidlem (Sigma) a enzymovým imunotestem (EIA) za použití korelát-EIA kitu (Assay Designs, Ann Arbor, AnnArboUSA).
Histopatologické vyšetření
Tkáň lemující váček byla odstraněna a fixována v neutrálním roztoku formalínu. Tkáňová sklíčka zalitá v parafínu byla obarvena hematoxylinem-eosinem a vyšetřena pod světelným mikroskopem na zánětlivé léze.
Statistická analýza
Výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SE. Srovnání experimentálních skupin byla provedena jednosměrnou analýzou rozptylu následovanou korekcí Tukeyho testu. P-hodnota<0.05 was="" considered="" statistically="">
Výsledek
Buněčná kultura RAW 264.7 in vitro, léčba IFN- a LPS výrazně zvýšila produkci NO (obrázek 1). Předběžné ošetření fukoidanem (1–320 µg/ml) neovlivnilo uvolňování NO z makrofágové buněčné linie (obrázek 1A). Ve srovnání s tím ČT(Cistanche tubulosa)extrakt (32–320 µg/ml) významně potlačuje produkci NO, svědčí oprotizánětlivéaktivita (obrázek 1B).
Injekce karagenanu do vzduchového vaku myši výrazně zvýšila objem exsudátu ve vaku (obrázek 2). Taková zvýšená exsudace byla zmírněna léčbou fukoidanem (18 mg/kg) a CT(Cistanche tubulosa)extrakt (54 a 162 mg/kg). Zejména kombinační léčba fukoidanem a CT(Cistanche tubulosa)extrakt dále snížil objem exsudátů ve srovnání s jednotlivými účinky, ačkoli kombinace vyšších dávek (54 plus 162 mg/kg a 90 plus 270 mg/kg) nevykazovaly další účinnost oproti kombinaci nejnižších dávek (18 plus 54 mg/kg) (Obrázek 2A). Obsah NO ve sáčku se také drasticky zvýšil po injekci karagenanu (obrázek 2B). Ve srovnání s mírným účinkem fukoidanu, CT(Cistanche tubulosa)extrakt výrazně snížil koncentraci NO. Kombinovaná léčba fukoidanem a extraktem CT dále snížila hladinu NO v závislosti na dávce. Podobně byl zvýšený obsah PGE2 synergicky potlačen kombinační terapií fukoidanem a CT(Cistanche tubulosa)extrakt (obrázek 2C). Paralelně se zánětlivými mediátory ve váčku se injekcí karagenanu drasticky zvýšil počet zánětlivých buněk: 37,8, 4,8 a 24,1krát kontrolní hladiny pro neutrofily, monocyty a lymfocyty (tabulka 1) . Nicméně fukoidan a CT(Cistanche tubulosa)extrakt významně snížil infiltraci zánětlivých buněk, ve které byl fukoidan poněkud lepší než extrakt CT. Neočekávaně nebylo při současném podávání fukoidanu a CT dosaženo žádného synergického účinku v infiltraci zánětlivých buněk(Cistanche tubulosa)výpis.
Jak lze usuzovat z infiltrace zánětlivých buněk v exsudátech, podkožní tkáň obklopující vzduchové váčky vykazovala závažné zánětlivé léze (obrázek 3). Bylo pozorováno obrovské množství buněk v zesílené podkožní tkáni vystavené karagenanu (obrázek 3B), ve srovnání s téměř normálními rysy u kontrolních zvířat (obrázek 3A). Takové zánětlivé léze byly pozoruhodně zmírněny léčbou fukoidanem (obrázky 3C a 3D) nebo CT(Cistanche tubulosa)extrakt (obrázky 3E a 3F). Je pozoruhodné, že vyšší protizánětlivé účinky byly získány kombinovanou terapií s fukoidanem a CT(Cistanche tubulosa)extrakt (obrázky 3G-3I)
Diskuse
Pomocí in vivo modelu zánětu vzduchových váčků vyvolaného karagenanem indukuje injekce vzduchu do zad hlodavců proliferaci buněk, které se rozvrstvují na povrchu dutiny a vytvářejí strukturu podobnou synoviu. V tomto modelu injekce karagenanem indukované infiltrace zánětlivých buněk zvýšila exsudát, což svědčí o vaskulárním prosakování. Vzduchový vak slouží jako zásobník zánětlivých buněk a mediátorů, které lze snadno měřit v tekutině, která se lokálně hromadí.
Mezi různými zánětlivými mediátory, které mohou indukovat vaskulární permeabilitu, je dobře známo, že NO a PGE2 jsou hlavními faktory zapojenými do patogeneze mnoha zánětlivých onemocnění [24,25]. Jsou také známé jako mediátory indukce a vnímání bolesti[10,11]. iNOS, který je exprimován a aktivován v různých typech buněk stimulací TNF- a/nebo LPS během zánětu, produkuje vysoké trvalé koncentrace NO [3,5-7]. NO je důležitou regulační molekulou v různých fyziologických funkcích, jako je vazodilatace vedoucí k vaskulárnímu prosakování [8,9]. nadprodukce PGE2 v reakci na různé zánětlivé stimulace je spojena s up-regulací hladiny COX-II a progresí zánětu [28]. Proto byly dráhy TNF- -NO a COX-II-PGE2 považovány za dva hlavní proudy zánětlivých procesů, které jsou blokovány inhibitory iNOS (kortikosteroidy) a COX (NSAID) [22,29].
V této studii současné podávání fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa)extrakt redukoval objem exsudátu ve vaku, což naznačuje, že mají supresivní aktivitu proti vaskulárnímu prosakování (obrázek 2A). Ve srovnání s jednotlivými účinky každého fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa)extraktu se kombinační léčba dále zvýšila, což znamená, že tyto dvě sloučeniny působí synergicky. Takové synergické účinky mezi fukoidanem a CT extraktem byly podpořeny jejich aktivitami na hladinách NO a PGE2 v exsudátech (obrázky 3B a 2C).
Je však zajímavé, že bylo potvrzeno, že fukoidan přímo neinhibuje aktivaci makrofágů invitro testu (obrázek 1A). Podobně inhibiční potenciál fukoidanu na akumulaci NO a PGE2 v biologickém testu byl relativně nižší než u CT(Cistanche tubulosa)extrakt (obrázky 2B a 2C). Takový mechanismus účinku fukoidanu se liší od přímé inaktivace buněk extraktem CT (obrázek 1B). Pro srovnání, fukoidan projevoval vysokou účinnost při inhibici infiltrace zánětlivých buněk ve váčcích (tabulka 1). Fucoidan byl lepší než CT extrakt v blokování migrace neutrofilů, monocytů a lymfocytů do míst poškození tkáně vyvolané karagenanem. Zajímavé je, že nedošlo k žádnému synergickému antimigračnímu účinku, který by naznačoval různé mechanismy působení mezi fukoidanem a extraktem CT: tj. fukoidan blokuje infiltraci zánětlivých buněk, zatímco CT(Cistanche tubulosa)extrakt inhibuje aktivaci buněk.
Polymorfonukleární buňky, zejména neutrofily, jsou hlavními buněčnými složkami rekrutovanými do akutních zánětlivých míst vyvolaných karagenanem. Kromě toho, následné zánětlivé buňky, jako jsou makrofágy a lymfocyty, také hrají ústřední roli v zánětlivém procesu sekrecí cytokinů [22,30,31]. Při předběžné léčbě fukoidanem nebo CT(Cistanche tubulosa)extraktu byl počet bílých krvinek, které migrovaly do vzduchových váčků injikovaných karagenanem, výrazně potlačen. Tento výsledek byl v souladu s účinkem, kterého by bylo dosaženo u kortikosteroidů, jako je dexamethason, ale nikoli u NSAID včetně indometacinu [23,30]. Proto se předpokládá, že fukoidan a CT(Cistanche tubulosa)extrakt má zčásti vlastnost steroidů.
Kromě blokujícího účinku na chemotaxi zánětlivých buněk, CT(Cistanche tubulosa)Zdá se, že extrakt potlačuje aktivaci makrofágů. To bylo potvrzeno jeho inhibičním působením na NO in vitro a in vivo, což je hlavní zánětlivý mediátor produkovaný makrofágy. Tedy účinek CT(Cistanche tubulosa)Extrakt na makrofázích může být způsoben supresí exprese mRNA a/nebo přímou inhibicí aktivity iNOS v těchto buňkách.
PGE2 je také jedním z hlavních zánětlivých mediátorů. Zvyšuje se paralelně s tkáňovým edémem, který je potlačován NSA, inhibitory COX [21,22]. Karagenan může zvýšit produkci PGE2 indukcí COX-II mRNA a COX-II proteinu v exsudátu váčku [32]. V tomto modelu karagenan významně zvýšil množství PGE2 a bylo podstatně potlačeno CT(Cistanche tubulosa)výpis. Je zajímavé poznamenat, že tento výsledek byl v souladu s účinkem, kterého by se dosáhlo u NSAID indometacinu [23]. Z výsledků se tedy usuzuje, že extrakt z CT má další vlastnost NSAID. Celkově vzato se má za to, že ČT(Cistanche tubulosa)extrakt projevoval jak kortikosteroidy, tak účinky podobné NSAID v modelu zánětu vyvolaného karagenanem a že fukoidan zvýšilprotizánětlivéúčinky CT extraktu blokováním infiltrace zánětlivých buněk.
Ačkoli definování přesného mechanismu účinku vyžaduje další studium, směs fukoidanu a CT(Cistanche tubulosa) extrakt výrazně zmírnil zánětlivé příznaky blokováním drah TNF-–NO a COX-II–PGE2 při zánětu vzduchových váčků vyvolaném karagenanem. Tato zjištění poskytují důkaz, že kombinovaná léčba fukoidanem a CT(Cistanche tubulosa)extrakt může být slibným kandidátem na úlevu od různých typů zánětů, které reagují na kortikosteroidy nebo NSAID.
Reference
1. Den R. Nežádoucí reakce na inhibitory TNF u revmatoidní artritidy. Lancet 2002; 359(9306): 540-541.
2. Feldmann M, Brennanová FM, Maini RN. Role cytokinů u revmatoidní artritidy. Annu Rev Immunol 1996; 14: 397-400.
3. Eigler A, Sinha B, Hartmann G, Endres S. Zkrocení TNF: strategie k omezení tohoto prozánětlivého cytokinu. Immunol Today 1997;18(10): 487-492.
4. Ershler WB, Keller ET. Zvýšená exprese genu interleukinu-6související s věkem, nemoci v pozdním věku a křehkost. Annu Rev Med2000; 51: 245-270.
5. Adams V, Nehrhoff B, Späte U, Linke A, Schulze PC, Baur A, Gielen S, Hambrecht R, Schuler G. Indukce exprese iNOS v kosterním svalu pomocí IL-1 a aktivace NFκB: in vitro andin vivo studie. Cardiovasc Res 2002; 54(1): 95-104.
6. Xie QW, Whisnant R, Nathan C. Promotor myšího genu kódujícího na vápníku nezávislou syntázu oxidu dusnatého uděluje indukovatelnost interferonem a bakteriálním lipopolysacharidem. J ExpMed 1993; 177(6): 1779-1784.
7. Yui Y, Hattori R, Kosuga K, Aizawa H, Hiki K, Kawai C. Purifikace syntázy oxidu dusnatého z krysích makrofágů. J BiolChem 1991; 266(19): 12544-12547.
8. Marletta MA, Yoon PS, Iyengar R, Leaf CD, Wishnok JS. Makrofágová oxidace L-argininu na dusitany a dusičnany: oxid dusnatý je meziprodukt. Biochemistry 1998; 27(24): 8706-8711.
9. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Oxid dusnatý: fyziologie, patofyziologie a farmakologie. Pharmacol Rev 1991; 43(2):109-142.
10. Pang L, Hoult JR. Cytotoxicita tetrandrinu, antisilikotického alkaloidu, vůči makrofágům, doprovázená nadprodukcí prostaglandinů. Biochem Pharmacol 1997; 53(6): 773-782.
11. Hunskaar S, Hole K. Formalínový test u myší: disociace mezi zánětlivou a nezánětlivou bolestí. Bolest 1987; 30:103-114.
12. Lester RS, Knowles SR, Shear NH. Rizika systémového užívání kortikosteroidů. Dermatol Clin 1998; 16(2): 277-288.
13. Lichtenstein DR, Syngal S, Wolfe MM. Nesteroidníprotizánětlivéléky a gastrointestinální trakt. Dvousečný meč. Arthritis Rheum 1995; 38(1): 5-18.
14. Mukherjee D, Nissen SE, Topol EJ. Riziko kardiovaskulárních příhod spojených se selektivními inhibitory COX-2. JAMA 2001; 286(8):954-959.
15. Feldman SC, Reynaldi S, Stortz CA, Cerezo AS, Damont EB. Antivirové vlastnosti frakcí fukoidanu z Leathesiadifformis. Fytomedicína 1999; 6(5): 335-340.
16. Wang J, Zhang Q, Zhang Z, Song H, Li P. Potenciální antioxidační a antikoagulační kapacita nízkomolekulárních fukoidanových frakcí extrahovaných z Laminaria japonica. Int J Biol Macromol2010; 46(1): 6-12.
17. Bojakowski K, Abramczyk P, Bojakowska M, Zwoliñska A, Przybylski J, Gaciong Z. Fucoidan zlepšuje renální průtok krve v časném stádiu renálního ischemického/reperfuzního poškození u potkanů. JPhysiol Pharmacol 2001; 52(1): 137-143.
18. Li N, Zhang Q, Song J. Toxikologické hodnocení fukoidanu extrahovaného z Laminaria japonica u potkanů Wistar. Food ChemToxicol 2005; 43(3): 421-426.
19. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, Isoda H. Inhibiční účinek akteosidu izolovaného z Cistanche tubulosa na uvolňování chemických mediátorů a produkci zánětlivých cytokinů buňkami RBL-2H3 a KU812. Planta Med 2010; 76(14): 1512-1518.
20. Shin S, Jeon JH, Park D, Jang JY, Joo SS, Hwang BY, Choe SY, Kim YB.Protizánětlivéúčinky ethanolového extraktu z angeliky gigas v modelu zánětu karagenanu a vzduchu.Exp Anim 2009; 58(4): 431-436.
21. Hevel JM, Marletta MA. Stanovení syntázy oxidu dusnatého. MethodsEnzymol 1994; 233: 250-258.
22. Romano M, Faggioni R, Sironi M, Sacco S, Echtenacher B, DiSanto E, Salmona M, Ghezzi P. Carrageenan indukoval akutní zánět v modelu synoviálního vaku u myší. Role tumor nekrotizujícího faktoru. Mediators Inflamm 1997; 6(1): 32-38.
23. Wallace JL, Chapman K, McKnight W. Limitedprotizánětlivéúčinnost inhibice cyklooxygenázy-2 při zánětu vaku karagenanu a vzduchu. Br J Pharmacol 1999; 126(5): 1200-1204.
24. Guslandi M. Oxid dusnatý a zánětlivá onemocnění střev. Eur J Clin Invest 1998; 28(11): 904-907.
25. Ritchlin CT, Haas-Smith SA, Li P, Hicks DG, Schwarz EM. Mechanismy TNF- - a RANKL-zprostředkovaná osteoklastogeneze a kostní resorpce u psoriatické artritidy. J Clin Invest 2003;111(6): 821-831.
26. Minghetti L. Cyklooxygenáza-2 (COX-2) u zánětlivých a degenerativních onemocnění mozku. J Neuropathol Exp Neurol 2004;63(9): 901-910.
27. St-Onge M, Flamand N, Biarc J, Picard S, Bouchard L, DussaultAA, Laflamme C, James MJ, Caughey GE, Cleland LG, BorgeatP, Pouliot M. Charakterizace tvorby prostaglandinu E2 prostřednictvím cyklooxygenázy (COX){ {3}} dráha v lidských neutrofilech.Biochim Biophys Acta 2007; 1771(9): 1235-1245.
28. Choi YH, Park HY.Protizánětlivéúčinky spermidinu v mikrogliálních buňkách BV2 stimulovaných lipopolysacharidy. J Biomed Sci2012; 19:31.
29. Wallace JL, Chapman K, McKnight W. Limitedprotizánětlivéúčinnost inhibice cyklooxygenázy-2 při zánětu vaku karagenanu a vzduchu. Br J Pharmacol 1999; 126(5): 1200-1204.
30. Oliveira de Melo J, da Conceição Torrado Truiti M, Muscará MN,Bolonheis SM, Dantas JA, Caparroz-Assef SM, Cuman RK,Bersani-Amado CA.Protizánětlivéaktivita surového extraktu a frakcí listů Nectandra falcifolia. Biol Pharm Bull2006; 29(11): 2241-2245.
31. Zanardo RC, Brancaleone V, Distrutti E, Fiorucci S, Cirino G, Wallace JL. Sirovodík je endogenní modulátor zánětu zprostředkovaného leukocyty. FASEB J 2006; 20(12): 2118-2120.
32. Masferrer JL, Zweifel BS, Manning PT, Hauser SD, Leahy KM, Smith WG, Isakson PC, Seibert K. Selektivní inhibice indukovatelné cyklooxygenázy 2 in vivo jeprotizánětlivéa nenulové erogenní. Proč Natl Acad Sci USA 1994; 91(8): 3228-3232.
