Protizánětlivé iridoidy ze stonků Cistanche Deserticola pěstované v poušti Tarim
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
ABSTRAKTNÍ
Aby bylo možné určit chemické složkyCistanche deserticolakultivovaný v poušti Tarim, byl systematicky prováděn fytochemický výzkum. Složky byly izolovány pomocí silikagelu, Sephadexu LH-20, MCI gelu, ODS kolonové chromatografie a semipreparativní HPLC. Jejich struktury byly stanoveny na základě MS a NMR spektroskopických analýz, chemickými metodami a/nebo srovnáním s literárními údaji. Protizánětlivé aktivity izolátů byly hodnoceny z hlediska jejich inhibičních účinků na lipopolysacharidem (LPS) indukovanou produkci oxidu dusnatého (NO) v BV-2 myších mikrogliálních buňkách. Bylo izolováno a identifikováno devět iridoidů jakocistanche desertosideA (1), cistanin (2), cistachlorin (3), 6-deoxykatalpol (4), glurosid (5), kankanosid A (6), ajugol (7), bartsiosid (8) a {{9 kyselina epi-loganová (9). Sloučenina 9 vykazovala silnou inhibici produkce NO s hodnotou IC50 5,2 μmol·L-1, srovnatelnou s pozitivní kontrolou kvercetinem (4,3 μmol·L-1). Sloučenina 1 byla novým iridoidem a sloučeniny 5, 6 a 8 byly z tohoto druhu izolovány poprvé.
[KLÍČOVÁ SLOVA] Cistanche deserticola; iridoidy; Objasnění struktury; Protizánětlivá aktivita
Úvod
Cistanches Herba(Roucongrong v čínštině) patřící do čeledi Orobanchaceae, je rozšířen především v severní Africe, Arábii a asijských zemích [1]. Jako dobře známé tonikum v tradiční čínské medicíně (TCM), stonkyCistanchedeserticolaaCistanchetubulosase již dlouho používají v Číně a Japonsku k léčbě nedostatku ledvin, ženské neplodnosti, chorobné leukorey, neurastenie a stařecké zácpy [2-3]. Předchozí fytochemické výzkumy měly
[Financování výzkumu] Tento projekt byl finančně podpořen Čínskou národní nadací pro přírodní vědy (č. 81222051), Projektem vědeckého výzkumu tradiční čínské medicíny (č. 201307002) a Národním programem výzkumu a vývoje klíčových technologií „New Drug Innovation“ v Číně.
Tito autoři nemají žádný střet zájmů, který by mohli prohlásit. Publikováno společností Elsevier BV Všechna práva vyhrazena s uvedením přítomnostifenylethanoidové glykosidy(PhGs), iridoidy, lignany a polysacharidy vCistanchedruhy [4] a některé z izolátů vykazovaly neuroprotektivní, hepatoprotektivní, protizánětlivé, antibakteriální, antivirové a antioxidační účinky [5-6].
Koncem 90. let minulého století byla za účelem ochrany ropného pole Tazhong a kontroly pouště založena rostlina na fixaci písku Haloxylon ammodendron (CA Mey.) Bunge, hostitelCistanchedeserticola, byl zavlečen ze severu na jih od Sin-ťiangu a velké množstvíC. deserticolabyly kultivované. Klimatické podmínky a růstové prostředí na jihu se velmi liší od toho na severu Sin-ťiangu. Zda chemické složkyCistanchedeserticolapěstované v jižním Sin-ťiangu se liší nebo ne, není jasné. Aby bylo možné určit chemické složkyCistanchedeserticolakultivovaný v poušti Tarim byl v této studii systematicky proveden fytochemický výzkum. Zde je popsána izolace a strukturní objasnění nového iridoidního glykosidu (1) spolu s osmi známými analogy (2–9) spolu s jejich protizánětlivými aktivitami.
Protizánětlivý účinekCistanche deserticola
Výsledky a diskuse
85% vodný ethanolový extrakt ze stonkůCistanchedeserticolase suspenduje v H20 (10 1) a extrahuje se postupně EtOAc (10 1 x 3) a n-BuOH. Extrakty EtOAc a n-BuOH byly podrobeny silikagelu, Sephadexu LH-20, MCI gelu a ODS sloupcové chromatografii (CC) a semipreparativní HPLC za získání jednoho nového (1) a osmi známých iridoidů ({ {9}}) (obr. 1).
Sloučenina 1 byla izolována jako bílý amorfní prášek s negativní optickou rotací ([a]20 –118.0, c 0,1, MeOH). Jeho IR spektrum vykazovalo silné absorpční pásy kolem 3 393 cm-1, které lze připsat hydroxylovým skupinám. Má molekulový vzorec C16H26O9 určený kvazimolekulárním iontem při m/z 385.{13}} [M plus Na] plus (Vypočteno pro C16H26O9Na, 385.{18}}) a m/z 401 .122 8 [M plus K] plus (Vypočteno pro CHOK, 401.120 8) korelace od H-1 do C-1′, H-10 do C-7, C-8 a C-9 a od H-11 do C-3, C-4 a C{{32 }} také podpořil výše uvedené vysvětlení.
Stereochemie sloučeniny 1 byla stanovena porovnáním chemických posunů a vazebných konstant s údaji z literatury a analýzou spektra NOESY. Vztah H-5 k H-9 byl určen jako cis z jejich vazebné konstanty (10,5 Hz) [8-9]. U nejpřirozenějších iridoidů jsou konfigurace C-1-OH, H-5 a H-9 a 13C NMR chemické posuny C{{10} } a C-1′ jsou obecně na δC 93–98 a 97–1{103}}1. Zatímco v případě konfigurace - jsou rezonance C-1 a C-1′ v průměru posunuty o 5–6 dolů [10-11]. 13C NMR data com{23}} v (plus)-HR-ESIMS a podporovaná 13C NMR daty (tabulka 1), indikující 4 stupně nenasycenosti. Kyselá hydrolýza – 1 tabulka 1 1H NMR (500 MHz) a 13C NMR (125 MHz) data 1 (5 v ppm, J v Hz) sloučeniny 1 se 2 moly, L kyseliny trifluoroctové poskytlo D-glukózu, který byl identifikován analýzou jeho silanových derivátů GC analýzou. Relativní konfigurace na anomerním centru glukosylu byla přiřazena od interakční konstanty 8,0 Hz. 1H a 13C NMR data (tabulka 1) sloučeniny 1, která byla jednoznačně přiřazena různými 2D NMR experimenty, ukázala signály přiřaditelné dvěma methylům při 5H 1,23 (3H, s, H-10) a 1,52 (3H, br. s, H-11), jeden methylen při δH 1,70 (1H, dt, J=13,5, 5,5 Hz, H-6) a 1,92–1,98 (1H, m, H -6), tři methiny při δH 2,47 (1H, br d, J= 10,5 Hz, H-9), 2,67–2,72 (1H, m, H-5 ) a 3,62 (1H, t-like, J= 5,5 Hz, H-7) a ,-nenasycená acetalová skupina 5H 5,40 (1H, d, J=2). 0 Hz, H-1), 5,92 (1H, br s, H-3), spolu s -D-glukopyranosylovým anomerním protonem při 8H 4,61 (1H, d, J=8). 0 Hz, H{104}}′). Údaje 1H a 13C NMR sloučeniny 1 byly velmi podobné údajům na lankanské straně A (6), s výjimkou zjevně odstíněných signálů H-7 [5H 3,62 (1H, t-like, J=5 0,5 Hz)] a C-7 (δC 79,8), což ukazuje na hydroxylaci C-7 polohy [7]. Tento odpočet byl podpořen analýzami 1H-1H COZY z H-1/H-9/H-5/H-6/H{{127} } a korelací HMBC od H-7 do C-5, C-6, C-8, C-9 a C-10 ( Obr. 2). Druhý HMBC
Zde uvedená libra 1 (Tabulka 1) indikovala normální - konfigurace pro C-1-OH, H-5 a H-9. Relativní konfigurace H-7 a H3-10 byly určeny ze spektra NOESY (obr. 2), ve kterém byly korelace NOE mezi H-1 a H3-10, a mezi H3-10 a H-7 naznačuje, že všechny tyto protony jsou na stejné ploše. Žádná korelace NOESY mezi H3-10 a H-9 nenaznačuje, že H-9 a H3-10 jsou na opačné straně molekuly. Proto byla struktura sloučeniny 1 objasněna jako 7-hydroxyl-lankanská strana A pojmenovanácistadesertosidA.
Známé sloučeniny byly identifikovány jako určité (2) [12],cistachlorin(3) [12], 6-deoxykatalpol (4) [13], glukosid (5) [14], Lankanská strana A (6) [7], Lugol (7) [15], bartsiosid (8) [16] a 8-epi-organická kyselina (9) [17] srovnáním s NMR daty s daty uvedenými v literatuře. Protizánětlivé aktivity těchto izolovaných iridoidů byly hodnoceny z hlediska jejich inhibičních účinků na LPS-indukovanou produkci NO v mikrogliálních buňkách BV-2 a jejich cytotoxicita byla nejprve testována na buňkách BV-2 s léčbou LPS po dobu 24 h. Čistoty izolátů jsou všechny vyšší než 95 procent na základě1H NMR spektroskopické analýzy. Všechny izoláty nevykazovaly žádnou významnou cytotoxicitu při koncentraci 40 μmol·L−1 v BV-2 buňkách (tabulka 2). Sloučenina 9 vykazovala silný inhibiční účinek na produkci NO s hodnotou IC50 5,2 μmol·L-1, srovnatelnou s pozitivní kontrolou kvercetinem (4,3 μmol·L-1 ), zatímco ostatní nevykazovaly žádný významný účinek při testech. koncentrace 40 μmol·L−1 (tabulka 2). Předběžná analýza vztahu struktura-aktivita ukázala, že přítomnost karboxylové skupiny v poloze C-4 ve sloučenině 9 by mohla souviset s její významnou aktivitou. Stručně řečeno, jeden nový a osm známých iridoidů bylo izolováno ze stonkůC. deserticolakultivované v Tarimské poušti a sloučenina 9 vykazovala pozoruhodný inhibiční účinek na LPS-indukovanou produkci NO v BV-2 mikrogliálních buňkách. Všechny známé iridoidy byly dříve hlášeny z volné přírodyC. deserticola[7, 12-17], a proto neexistuje žádný zřejmý rozdíl v chemickém složení iridoidů a fenylethanoidů meziC. deserticolapěstované v poušti Tarim s ostatními stanovišti, ve spojení s naší poslední zprávou [19].
Cistanche deserticola: Protizánětlivý účinek
Experimentální
Obecné experimentální postupy
IR spektra byla zaznamenána na infračerveném spektrometru Nicolet Nexus 470 FT. NMR spektra byla získána na spektrometru Varian Inova-500. Hmotnostní spektra HR byla měřena na hmotnostním systému Bruker APEX IV FT-MS (7{15}} T) vybaveném zdrojem ESI. ESI-MS byly měřeny na MS spektrometru Agilent 6320 iont trap. Optické rotace byly měřeny na polarimetru Rudolph AUTOPOL IV. Teploty tání byly stanoveny na přístroji pro měření teploty tání X-4 s digitálním displejem (nekorigováno). Semi-preparativní HPLC byla prováděna na přístroji Waters 600 s kolonou ODS (Alltech, 250 mm x 10 mm ID, 5 um). GC analýzy byly provedeny na plynovém chromatografu VARIAN CP-3800 s DB-5 kolonou (0,25 mm × 30 m). Sloupcová chromatografie byla provedena na silikagelu (200–300 mesh, Qingdao Marine Chemistry Ltd., Čína), MCI gelu (CHP20P, 75–150 μmol·L−1, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japonsko), Sephadex LH{{24 }} (Amersham Biosciences, Švédsko) a ODS C18 (40–63 μm; Merck, Německo). TLC byla prováděna na skleněných předem potažených silikagelových GF254 deskách. Skvrny byly vizualizovány pod UV světlem nebo postřikem 5% roztokem kyseliny sírové v ethanolu.
Přírodní materiál
Stonky C. deserticola byly shromážděny v poušti Tarim, Ujgurská autonomní oblast Xinjiang, Čína a identifikoval je profesor TU Peng-Fei. Vzor voucheru (č. CD201011) byl uložen v Herbáři Centra moderního výzkumu tradiční čínské medicíny Pekingské univerzity. Extrakce a izolace Usušené stonky C. deserticola (15,3 kg) byly jemně nakrájeny a extrahovány 85% vodným ethanolem (120 1 x 1 h x 3). Koncentrovaný zbytek (4,5 kg) byl suspendován v H2O (10 1) a extrahován EtOAc (10 1 x 3) a n-BuOH (10 NAN Ze-Dong, et al. / Chin J Nat Med, 2016, 14(1) ): 6165 – 64 – D × 3) postupně. Sloučeniny 2–6 byly získány z extraktu EtOAc, zatímco sloučeniny 1 a 7–9 byly získány z extraktu n-BuOH.
EtOAc extrakt (65,8 g) se podrobil silikagelu CC (200–300 mesh) za použití gradientového rozpouštědlového systému CHCl3/MeOH ( 50: 1, 20: 1, 10: 1, 6: 1, 2: 1 a 1: 1), abyste získali deset zlomků (p. 1– Fr. 10). Fr. 2 (5,3 g) se oddělilo pomocí Sephadexu LH-20CC, eluce směsí CHCl3/MeOH (1:1), čímž se získaly tři hlavní frakce (Fr. 2-1, Fr. 2-2 a Fr. 2-3). Fr. 2-3 se oddělil na silikagelu CC za použití PE/Me2CO (50 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2 : 1, 1 : 1 a 0 : 1), čímž se získaly čtyři frakce ( P. 2-3-1–P. 2-3-4). Fr. 2-3-2 byl separován na silikagelu CC, eluován s PE/CHCl3/MeOH (8:8:1), čímž byla získána sloučenina 3 (20,6 mg). Sloučenina 2 byla získána od Fr. 2-3-3 po čištění chromatografií na silikagelu CC, s elucí PE/CHCl3/MeOH (5:5:1). Fr. 4 (2,5 g) se oddělilo pomocí Sephadexu LH-20 CC, eluce CHCl3/MeOH (1:1), za získání tří frakcí (Fr. 4-1, Fr. 4-2 a Fr. 4-3). Fr. 4-2 byl podroben MCI gelu CC (MeOH/H20, 10:90 až 90:10, obj./obj.), čímž byly získány tři hlavní frakce (Fr. 4-2-1, Fr. 4-2-2, a Fr. 4-2-3). Fr. 4-2-1 byl purifikován semipreparativní HPLC [CH3CN-H20 (10:80)] za získání sloučeniny 4 (32,3 mg) a 5 (15,0 mg), zatímco Fr. 4-2-2 byl purifikován semipreparativní HPLC [CH3CN-H20 (10:80)], čímž byla získána sloučenina 6 (8,3 mg). Extrakt n-BuOH (536 g) se podrobil silikagelu CC (200–300 mesh) za použití gradientového rozpouštědlového systému CHCl3/MeOH (20:1, 10:1, 6:1, 2:1, 1: 1, 0:1), čímž se získá deset hlavních frakcí (Fr. D1–Fr. D10). Fr. D5 (3,0 g) byl podroben MCI gelu CC (MeOH/H20, 10:90 až 80:20, objem/objem), čímž byly získány tři frakce (Fr. D5-1–Fr.D5-3} ). Fr. D5-2 (120 mg) se oddělil silikagelem CC (200–300 mesh, 10,0 g; PE/EtOAc/MeOH 3 : 3 : 1), čímž se získala sloučenina 8 (12,5 mg). Fr. D8 (4,5 g) byl separován pomocí Sephadexu LH-20 CC, eluován MeOH, čímž byly získány tři frakce (Fr. D8-1–Fr. D8-3). Fr. D8-3 byl separován přes otevírací ODS kolonu (MeOH/H20, 20:80 až 80:20, V/V), čímž byly získány tři frakce (Fr. D8-3-1–Fr. D{{157 }}). Fr. D8-3-1 byl podroben semipreparativní HPLC [CH3CN-H20 (8:90)] za poskytnutí sloučeniny 1 (2,3 mg). Fr. D9 (10,1 g) byl separován na koloně Sephadex LH-20, eluován MeOH, za získání tří hlavních frakcí (Fr. D9-1–Fr. D9-3). Fr. D9-3 byl vystaven koloně MCI gelu (MeOH/H20, 0:100 až 50:50, objem/objem), čímž byly získány sloučeniny 7 (15,3 mg) a 9 (45,5 mg). Cistadesertosid A (1): Bílý amorfní prášek. [] 20 D –118,0 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) vmax: 3 393, 1 071, 1 028 cm-1; (plus)-HRESI-MS m/z 385.146 9 [M plus Na] plus (Vypočteno pro C16H26O9Na, 385.148 5) a m/z 401.120 8 [M plus K] plus (vypočteno pro C16H26O9K, 401.122 8); Data1H NMR a13C NMR, viz tabulka 1.
Kyselá hydrolýza sloučeniny 1
Sloučenina 1 (1,{2}} mg) byla míchána při 90 stupních po dobu 5 hodin s 2 mol.L-1 CF3COOH (EtOH:H20, 1:1, 2 ml). Po ochlazení na teplotu místnosti byl roztok zahuštěn za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn ve 2 ml pyridinu s 0,1 mol.L-1 hydrochloridem methylesteru L-cysteinu a míchán při 60 stupních po dobu 1,5 hodiny. Po ochlazení a zahuštění se na směs působí trimethylchlorsilanem (TMSCl) a hexamethyldisilazanem (HMDS) (1:2, objemově, 0,5 ml) v pyridinu (2 ml), poté se míchá při 60 °C. stupně po dobu 0,5 hodiny. Poté byl roztok zakoncentrován do sucha a zbytek byl rozdělen mezi H20 a n-hexan (2 x 3 ml) [18]. n-hexanová frakce byla analyzována pomocí GC za použití DB-5 kolony (0,25 mm x 30 m). Teploty injektoru a detektoru byly obě nastaveny na 220 stupňů. Na pec byl aplikován systém teplotního gradientu, počínaje teplotou 140 stupňů po dobu 1 minuty a zvyšující se až na 250 stupňů rychlostí 4 stupně.min-1. Vrchol hydrolyzátu cukerného derivátu byl identifikován porovnáním retenčního času s autentickým vzorkem D-glukózy (19,24 min) po podobném zpracování s TMSC1/HMDS.Inhibice produkce NO
NO inhibiční aktivity izolovaných sloučenin byly hodnoceny proti LPS-indukovaným BV-2 mikrogliálním buňkám Griessovou metodou s použitím soupravy pro stanovení NO (Nanjing-Jiancheng BioTech Institute, Nanjing, Jiangsu, Čína), jak bylo popsáno dříve [19], a kvercetin byly použity jako pozitivní kontrola. Kromě toho byla pomocí MTT testu hodnocena životaschopnost buněk.
Přínos cistanche: protizánětlivý
Reference
[1] Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa N, et al. Nové fenylethanoidové glykosidy zCistanche tubulosa(Schrenk) Háček. F. Já [J]. Chem Pharm Bull, 1987, 35(8): 3309-3314.
[2] Kultivační techniky hlavních léčivých rostlin Xinjiang [M]. Xinjiang: Xinjiang Institute of Traditional Chinese and Ethnologic Medicines Ed, Xinjiang Science and Technology Press, 2004: 84-88.
[3] Výbor pro čínský lékopis, Čínský lékopis [M]. sv. I, Peking: China Medical Science and Technology Press, 2010: 126.
[4] Jiang Y, Tu PF. Analýza chemických složek v Cistanche
druh [J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(11): 1970-1979.
[5] Pan J, Yuan CS, Lin CJ a kol. Farmakologické aktivity a mechanismy přírodních fenylpropanoidních glykosidů [J]. Pharmazie, 2003, 58(11): 767-775.
[6] Fu GM, Pang HH, Wong Y. Přirozeně se vyskytující fenylethanoidové glykosidy: potenciální vodítka pro nová terapeutika [J]. Curr Med Chem, 2008, 15(25): 2592-2613.
[7] Xie HH, Morikawa T, Matsuda H a kol. Monoterpenové složky zCistanche tubulosa-chemické struktury kankanosidů AE a kankanolu [J]. Chem Pharm Bull, 2006, 54(5): 669-675.
[8] Foderaro TA, Stermitz FR. Chemie Scrophulariaceae. Část 24. Iridoidní glykosidy z druhů Penstemon: AC-5, C-9 trans-iridoidní a C-8 epimerní páry [J]. Phytochemistry, 1992, 31(12): 4191-4195.
[9] Krull RE, Stermitz FR. Transfúzované iridoidní glykosidy z Penstemon mucronatus [J]. Phytochemistry, 1998, 49(8): 2413-2415.
[10] Takeda Y, Yagi T, Matsumoto T, et al. Nepetanudosidy a iridoidní glukosidy mající novou stereochemii z Nepeta nuda ssp. albiflora [J]. Phytochemistry, 1996, 42(4): 1085-1088.
[11] Takeda Y, Ooiso Y, Masuda T, et al. Iridoidní a eugenolové glykosidy z Nepeta camera [J]. Phytochemistry, 1998, 49(3): 787-791.
[12] Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, et al. Studie o složkách Cistanchis herba. II. izolace a struktury nových iridoidů,cistanin a cistachlorin[J]. Chem Pharm Bull, 1984, 32(5): 1729-1734.
[13] Arslanian RL, Harris GH, Stermitz FR. Chemie Scrophulariaceae. 7. Některé iridoidní glukosidy, včetně nového 6-deoxykatalpolu, z indických druhů štětců příbuzných Castilleja miniata [J]. J Nat Prod, 1985, 48(6): 957-961.
[14] Sticher O, Weisflog A. Stanovení a izolace iridoidních glukosidů z Galeopsis tetrahit (Labiatae) a objasnění struktury glurosidu [J]. Pharm Acta Helv, 1975, 50(11): 394-403.
[15] Nishimura H, Sasaki H, Morota T, et al. Chemické a biologické studie na Rehmanniae Radix. Část 3. Šest iridoidních glykosidů z Rehmannia glutinosa [J]. Phytochemistry, 1989, 28(10): 2705-2709.
[16] Junior P. Další iridoidi z druhu Penstemon [J]. Planta Med, 1984, 50(6): 530.
[17] Boros CA, Stermitz FR. Iridoidy. Aktualizovaná recenze. Část I [J]. J Nat Prod, 1990, 53(5):1055-1147.
[18] Jian R, Zeng KW, Tu PF a kol. Protineurozánětlivé složky z Asparagus cochinchinensis [J]. Fitoterapie, 2013, 84: 80-84.
[19] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP a kol. Fenylethanoidové glykosidy s protizánětlivými aktivitami ze stonkůCistanche deserticolakultivovaný v poušti Tarim [J]. Fitoterapie, 2013, 89: 167-174.
