Stx2 indukuje diferenciální genovou expresi a narušuje geny cirkadiánního rytmu v proximálním tubulu Ⅱ

3. Diskuse

3.1. Proximální tubulární patologie u pacientů se STEC a zvířecích modelů

Oligurie je znamenímakutní tubulární nekróza(ATN). Kvůli ATN ucpávají odloučené epiteliální buňky lumen tubulů, aby se snížil průtok tekutiny, který se projevuje jako oligurie. U pacientů se STEC jsou oligurie a anurie často nálezy, které naznačují ATN. Snížení funkce proximálního tubulu během časnějších stadií infekčního onemocnění STEC bylo prokázáno zvýšením 2MG a NAG v moči [3,33]. B2MG je 12 kDa malý protein, který je volně filtrován přes glomeruly a ve zdravém stavu je zcela absorbován proximálními tubuly. Jakmile jsou však proximální tubuly poškozeny, zvyšuje se množství 2 MG v moči, což slouží jako biomarker pro funkci proximálních tubulů. NAG je velký lysozomální enzym o velikosti 130 kDa a hlavní glukosidáza v proximálním tubulu. Vzhledem k velké velikosti nemůže glomerulus filtrovat NAG, zatímco poškozené proximální tubuly vylučují NAG do moči. Zvýšení NAG v moči je tedy dalším biomarkerem poškození proximálních tubulů. Glomerulární histopatologie, jako jsou fibrinově obstrukční kapiláry, je častým nálezem u pacientů se STEC; výše uvedené údaje o moči však naznačují poškození proximálních tubulů u dřívějšího onemocnění. Také moč pacientů se STEC obsahuje odlitky skládající se z tubulárního epitelu, který je výsledkem odlupování poškozených proximálních tubulárních buněk [1]. Na zvířecích modelech se odlupování proximálních tubulárních buněk často vyskytuje jak v modelech infekce STEC, tak v modelech s injekčním podáním Stx [25–27,34]. V současné studii jsme zjistili odlupování proximálních tubulárních buněk v Stx2-injikovaných myších ledvinách, což naznačuje Stx2-indukovanou proximální tubulární alteraci (obrázek 1). Také jsme detekovali Stx2 receptor Gb3 u myší iproximální tubuly lidských ledvins luminální boční expresí, která ukazuje na přímou interakci Stx2 s proximálními tubuly (obrázky 2 a 3). PDK4 fosforyluje pyruvátdehydrogenázu, aby inhibovala její aktivitu, což má za následek snížení využití glukózy a zvýšení metabolismu tuků v reakci na prodloužené hladovění a hladovění. Chrání odloučené epiteliální buňky před odloučením indukovanou buněčnou smrtí (anoikis) [35]. PDK4 měl zpočátku vrchol za 4 hodiny, poté další vrchol za 8 hodin (obrázek 5A). Po 12 hodinách se snížila, ale od té doby se postupně zvyšovala až do 72 hodin s log2-násobnou změnou a skončila s 3 (12-násobnou změnou) (obrázek 5A). K oddělení epiteliálních buněk došlo v myších proximálních tubulárních buňkách s injekcí Stx2- (odlupování) s relativně neporušenou morfologií (obrázek 1), což může být odrazem upregulace PDK4.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRAKTNÍ PRÁŠEK NA LEDVINY

Protože NHERF1 (SLC9A3R1) přispívá k normální buněčné adherenci k extracelulární matrici [36], organizaci aktinového cytoskeletu a udržování morfologie buněk, může mít snížená exprese tohoto genu důsledky, jako je odlupování buněk (obrázek 5K).

Účinek Stx2 na proximální tubuly se zdá být důležitým faktorem pro infekční onemocnění STEC; avšak změny v genové expresi zaměřené na in vivo proximální tubulární buňky nebyly dříve dostupné. Keepers a kol. [37] prokázali odlišně exprimované geny (DEG) v ledvinách myší s injekcí Stx2+LPS tak, že většina dřívějších a do značné míry změněných genů pocházela z vlivu LPS a geny, které byly změněny velmi pozdě, jsou z efektu Stx2 . Jejich data ukázala cenný pohled na rozdílné genové exprese ledvin, ale neoddělovala typy buněk, které byly za tuto změnu zodpovědné. V současné studii jsme se pokusili vyhledat DEG, které jsou spojeny s proximálními tubulárními buňkami, porovnáním dat z mikročipů z myšíledviny a lidské primární proximální tubulárníbuňky, které byly ošetřeny Stx2.

3.2. Proximální tubulární faktory podílející se na Stx2-indukované patologii ve vztahu ke známým aktivitám Stx2 v buňkách exprimujících Gb3

3.2.1. Aktivita (I), Transdukce signálu indukovaná vazbou Stxs na Gb3

B podjednotky Stxs indukují fosforylaci nereceptorové src tyrosinkinázy Yes [4]. Fosforylovaný Yes svou kinázovou aktivitou aktivuje downstream signální molekuly a vede k remodelaci cytoskeletu [5]. Je známo, že fosforylace proteinu YAP (YAP) v Y357 pomocí Yes indukuje jadernou translokaci YAP, kde působí jako transkripční koaktivátor k indukci cílových genů, jako je CTGF [38]. Matricelulární proteiny CYR61 (CCN1) a CTGF (CCN2) jsou vylučovány do extracelulární matrix (ECM) a přispívají k udržení adheze buňka-ECM vazbou receptorových integrinů a heparansulfátových proteoglykanů (HSPG) navázaných na povrchu buněk [39,40]. Klíčovou molekulou transkripce CCN1 a 2 je YAP a je udržována neaktivní (fosforylovaná na serinovém zbytku 127) v normálním stavu pod Hippo signalizační dráhou. Jakmile je detekována nízká adheze mezi buňkami, YAP (S127) již není fosforylován, což mu umožňuje vstoupit do jádra a transkripce CCN1 a 2 se zvyšuje [41–43]. CCN1 a 2 působí jako molekuly pro hojení ran, které opravují tkáň ztracenou o buňky [38,44]. V našem souboru dat měly CCN1 a 2 malé vrcholy v dřívějším časovém bodě (6 hodin). To může odrážet Stx2 vazbou indukovanou aktivaci Yes. V pozdějších hodinách mohlo sloughing spustit další aktivaci YAP vypnutím hroší signalizační dráhy k indukci větší exprese CCN1 a 2 po 12 hodinách nebo později (obrázek 5C).

3.2.2. Aktivita (II), Vyvolání ER-Stress/UPR

Stx dosáhnou ER, kde štěpené A1 fragmenty a B podjednotky napodobují nesbalené proteiny [9,10,45,46]. Glukózou regulovaný protein 78 kDa (Grp78, vazebný imunoglobulinový protein (Bip)) ukotvuje tři klíčové proteiny UPR Inositol vyžadující enzym-1 (Ire{10}}), endoplazmatickou retikulum kinázu podobnou proteinkináze R (PERK ) a aktivaci transkripčního faktoru 6 (ATF6) v membráně ER během normálního stavu. Díky vyšší afinitě Grp78 k nesbaleným proteinům však tyto ukotvené proteiny uvolňuje. ATF6 se aktivuje po uvolnění a zvyšuje mR NAs CHOP (DDIT3) a X-box vazebný protein 1 (XBP-1), zatímco Ire-1 spojuje XBP-1 mRNA za vzniku XBP{{ 22}} protein, který přispívá k transkripci CHOP (DDIT3). Aktivace PERK vede k aktivaci ATF4, která také zvyšuje CHOP (DDIT3) mRNA. Proto je zvýšení CHOP (DDIT3) mRNA charakteristickým znakem UPR [47,48]. Uvádí se, že Stxs indukují UPR a CHOP (DDIT3) je v našem souboru dat upregulován (obrázek 5D–G).

GDF15 patří do rodiny transformujícího růstového faktoru beta (TGF). Nedávno se ukázalo, že GDF15 zprostředkovává úbytek hmotnosti vyvolaný diabetickým lékem metforminem [49]. U myší podávaných perorálně metforminem byla střevní a renální GDF15 mRNA zvýšena, což vedlo ke zvýšení sérového GDF15. Cirkulující GDF15 působí prostřednictvím receptoru omezeného na mozkový kmen k potlačení příjmu potravy a snížení tělesné hmotnosti [50]. U myší, kterým byl podáván metformin, je zvýšený renální GDF15 alespoň částečně pod regulací CHOP (DDIT3). V našem souboru údajů o ledvinách myší s injekcí Stx{12}} se CHOP (DDIT3) zpočátku zvýšil po 4 hodinách s velmi malým vrcholem a poté začal mít rostoucí trend směrem k 48 hodinám, kdy si udržel úroveň log{{16 }}násobná změna kolem 1,3 (obrázek 5E). Podle shlukové analýzy STRING dostává GDF15 aktivní vstup z transkripčních faktorů CHOP (DDIT3) a ATF3 (obrázek 5E) [51,52]. Hmotnost myší injikovaných Stx2-začala klesat nebo se odchylovat od kontroly fyziologickým roztokem po 24 hodinách (obrázek S3B). Zvýšení mRNA GDF15 v ledvinách po 12 hodinách mohlo ovlivnit mozkový kmen ke snížení příjmu potravy, což se zase projevilo jako úbytek hmotnosti (obrázky 5E a S3B). Protože hladina exprese GDF15 byla po 24 hodinách nadále vysoká, myši nadále ztrácely váhu (obrázky 5E a S3B).

Při ER-stresu se PERK uvolňuje z Grp78 (Bip) a oligomerizuje, aby fosforyloval a inhiboval eIF2, což vede ke globální represi translace, s výjimkou několika proteinů reagujících na UPR, jako jsou ATF4, CHOP a Grp78. GADD34 (regulační podjednotka proteinové fosfatázy 1 15A (PPP1R15A)) je jedním ze zvýšených proteinů pod inhibicí asociovanou s fosforylovaným eIF2 (eIF2 (P)) a upregulovanou v našem souboru dat (obrázek 5D,G). GADD34 je proteinová fosfatáza-1, která defosforyluje eIF2 (P), aby negativně regulovala inhibici syntézy proteinů indukovanou UPR [53]. Výraz GADD34 (PPP1R15A) se stane log2-násobnou změnou větší než 1 po 12 hodinách Stx2 v naší datové sadě a nadále se zvyšuje až do 24 hodin, kdy se ustálí (log2-násobná změna se rovná 2,1) a zachová si tuto hodnotu úroveň až do konce (obrázek 5D,G). To naznačuje, že Stx2-indukované UPR mělo negativní zpětnou vazbu po 12 hodinách. Zvýšená transkripce a translace CHOP (DDIT3, GADD153) je charakteristickým znakem ER-stresu a vzor diferenciální exprese se podobá GADD34 s tím rozdílem, že log2 větší než 1 se objeví po 24 hodinách a poté postupně stagnuje (log2 se rovná 1,3) (obrázek 5D,G). Také CEBPB, převládající dimerizační partner CHOP, je v našem souboru dat upregulován (obrázek 5D, G). Tyto výsledky naznačují, že zatímco Stx2-indukovaný ER stres začíná velmi brzy v časovém průběhu, zvyšuje účinek až na 24 hodin a udržuje tuto úroveň ER stresu až do konce, zatímco negativní zpětná vazba se také vyrovnává současně

3.2.3. Aktivita (III), aktivita proteinu inaktivujícího ribozom (RIP).

Odštěpením adeninu z rRNA inhibují Stxs de novo syntézu proteinů. Depurinovaná rRNA ovlivňuje alteraci ribozomální morfologie, která aktivuje signální transdukci [11] známou jako ribotoxická stresová reakce (RSR), což vede k charakteristické aktivaci genu (viz další odstavec).

3.2.4. Aktivita (IV), aktivita ribotoxické reakce na stres (RSR).

ZAK (MAPKKK) je známá kináza v RSR a aktivuje dráhy JUN N terminální kinázy (JNK) a p38 MAPK [12,15]. Stx1 indukuje expresi JUN a FOS mRNA v lidských střevních epiteliálních buňkách a tato událost vyžadovala Stx1 s pozitivní aktivitou RIP, o kterém se předpokládá, že je pod kontrolou RSR [15]. Je známo, že další downstream molekula RSR, p38 MAPK, indukuje geny časné odpovědi, jako jsou JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 a ATF3 [54], z nichž všechny byly v našem souboru dat rozdílně exprimovány. Je také známo, že dráhy JNK a p38 MAPK jsou aktivovány následnými událostmi Ire{13}} pod UPR (obrázky 4B,D a 5B,E,F) [47]. Díky tomu mohou Stxs aktivovat tyto dvě cesty prostřednictvím RSR a/nebo UPR. Ukázalo se také, že dráha kinázy regulované extracelulárním signálem (ERK) 1/2 je downstream od RSR [55] a je známo, že gen DUSP1 (MKP1) je indukován dráhou ERK1/2 [56]. Stx1 a anisomycin (další inhibitor syntézy proteinů) jsou schopny indukovat expresi DUSP1 v buňkách Caco-2 [57]. V našem souboru dat byla indukována exprese DUSP1 a to může znamenat aktivaci ERK1/2 (obrázek 4B, D).

3.2.5. Aktivita (V), konkrétní genová transkripce vedoucí k cytokinu

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 po 24 a 48 hodinách (obrázek 5F). To naznačuje, že jsou indukovány geny klobouku pod oběma cestami NF-KB, IκB (klasická) a RelB (alternativní). Protože diferenciální exprese CHOP (DDIT3) překračuje log2 větší než 1 po 24 hodinách, myší ledvina podléhá UPR, takže aktivovaný PERK fosforyluje podjednotku alfa eukaryotického faktoru 2 iniciace translace (eIF2), aby inhiboval translaci NFKBIA [60]. Z tohoto důvodu nemusí zvýšení NFKBIA mRNA inhibovat velkou část dráhy NF-KB, takže je umožněna transkripce zánětlivých faktorů (obrázek 5L).

Sobbe a kol. [61] ukázali, že jak klasická (RelA-p50), tak alternativní (RelB-p52) NF-κB dráha byla aktivní u myší s injekcí Stx detekujících upregulaci RelA-cílových cytokinů CCL20, CXCL1 a CXCL10, které byly také odlišně exprimovány v našem datový soubor (obrázek 5L).

3.2.6. Aktivita (VI), Stxs-indukovaná apoptóza

Štěpená kaspáza 3 byla nalezena u buněčné smrti spojené se Stxs [13,15,62]. Bylo ukázáno, že k aktivaci kaspázy-3 nebo indukci apoptózy pomocí Stxs dochází v kontextu RSR a UPR. U Stxs-indukované RSR jsou zapojeny obě dráhy p38 MAPK a JNK [15] a je také popsána aktivace ERK [55]. Na druhé straně je známo, že UPR indukuje dráhy NF-KB, JNK a p38 MAPK. Ukázalo se, že CHOP (DDIT3) pod UPR se podílí na apoptóze [63] a bylo prokázáno také na apoptóze spojené se Stxs [13]. Bylo také popsáno zapojení JNK do apoptózy indukované UPR [64]. V našem datovém souboru je do RSR a UPR zapojeno několik stupňů, jako je CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN a JUNB (obrázek 5B, F).

3.3. Cirkadiánní dysregulace pomocí Stx2

U pacientů se STEC-HUS dochází ke zvýšení sérového endotelinu-1 (ET-1, EDN1) [65]. Experimentálně také Stx2 indukuje expresi EDN1 aktivací signálních transdukčních kaskád zahrnujících MAPK [66], zatímco je známo, že UPR indukuje transkripci EDN1 [67]. V našem souboru dat léčba Stx2 indukovala expresi EDN1 v myších ledvinových i lidských proximálních tubulárních buňkách (obrázek 5G). Protože exprese genu EDN1 byla společným jmenovatelem myších ledvinových a lidských proximálních tubulárních epiteliálních buněk, ukazuje to, že k expresi EDN1 dochází, alespoň částečně, v proximálních tubulárních epiteliálních buňkách in vivo kromě endoteliálních buněk. Secernovaný ET-1 také indukuje expresi EGR1 prostřednictvím aktivace MAPK [68]. Naše data potvrzují upregulaci EGR1 v načasování, když je EDN1 upregulován (obrázek 5H). EGR1 indukuje expresi klíčového faktoru cirkadiánního rytmu PER1 [69], čímž upravuje amplitudu dalších cirkadiánních faktorů (obrázek 5H).

V cirkadiánní regulaci heterodimer CLOCK-BAML1 (ARNTL) upreguluje PER1 a CRY1. Na oplátku se heterodimer PER1-CRY1 váže na CLOCK-BAML1 (ARNTL), aby potlačila další jejich vlastní transkripci, a tím vytvořila negativní smyčku cirkadiánního rytmu. Expresní vrcholy pozitivních regulačních genů (CLOCK a BAML1 (ARNTL)) a negativních regulačních genů (PER1 a CRY1) se tak stávají každou hodinu, kdy se CLOCK a BAML1 (ARNTL) zvýší exprese, PER1 a CRY1 se sníží, a vzor se v následujících hodinách přepne. Když jsme do grafu přidali hodnoty log2-násobné změny CLOCK a BAML1 (ARNTL) (obrázek 5J), během dřívějších časových bodů vykazovaly PER1 a BAML1 (ARNTL) opačný rytmický vzor s ostrými/úzkými vrcholy, po 24 hodinách se však vrcholy začaly otupovat a plynule narůstat bez rytmu. To znamená, že Stx2 ovlivnil renální cirkadiánní rytmus včetně proximálních tubulů. I když je zapotřebí další potvrzovací experiment, naše data v kombinaci s publikovanou literaturou, která popisuje účinek PER1 na renální cirkadiánní regulaci při stimulu [70,71], naznačují možné zapojení Stx2 do poruchy cirkadiánního rytmu a účinky na funkce proximálních tubulů snížením genů renálních hodin- regulované faktory, jako je SGLT1 (SLC5A1) (obrázek 5K). Skutečně jsme pozorovali glukosurii u myší s injekcí Stx{30}}, které se reprodukovaly v jiné studii s myšmi s injekcí Stx{31}} [21], což ukazuje na dysfunkci SGLT1 (SLC5A1) v proximálních tubulech (tabulka 3). Pokud je nám známo, jedná se o první zprávu naznačující účast Stx2 na poruše cirkadiánního rytmu ledvin.

4. závěr

Určili jsme důležité geny týkající se expresí spojených s proximálními tubuly, které byly změněny Stx2. Předpokládá se, že diferenciální exprese těchto genů je výsledkem aktivit Stx2, jako je indukce UPR, RSR spojená s depurinací rRNA a transdukce signálu indukovaná vazbou Gb3 receptoru plazmatické membrány. Nejvíce exprimovaný gen, GDF15, může ovlivnit úbytek hmotnosti způsobený Stx2 prostřednictvím receptorů s omezením mozkového kmene snížením příjmu potravy. Extracelulární matrix a buněčná adheze mohou být ovlivněny PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 a CTGF, které způsobují Stx2-specifickou histopatologii a odlupování. Kromě toho může porucha renálního cirkadiánního rytmu Stx2 vést k funkčním defektům proximálních tubulárních tkání, jako je reabsorpce glukózy.

5. Materiály a metody

5.1. Zvířata Myši

(C57BL/6, samec, 19–22 g, bez specifického patogenu) byly zakoupeny od Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japonsko). Potrava a voda byly podávány ad libitum. Myši byly udržovány standardním cyklem 12 hodin: 12 hodin světlo-tma, ve kterém je světlo zapnuto v 7 hodin ráno a vypnuto v 19 hodin. Teplota zvířat v místnosti byla udržována kolem 24 °C. Všechny postupy byly schváleny Univerzitním výborem pro péči o zvířata.

5.2. Lidská ledvinová tkáň

V této studii byla použita tkáň mrtvoly bez jakýchkoli osobních identifikátorů a je považována za vyňatou podle směrnic univerzity pro vyšetřování lidí.

5.3. Buněčná kultura

Primární kultura lidských renálních proximálních tubulárních epiteliálních buněk (RPTEC) byla zakoupena od Clonetics (Walkersville, MD, USA) a udržována při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Buňky byly kultivovány v kultivačním médiu pro renální epiteliální buňky doplněné lidským epidermálním růstovým faktorem, hydrokortisonem, epinefrinem, inzulínem, trijodthyroninem, transferinem, GA-1000 a FBS.

5.4. Purifikace Stx2 bez LPS Odstranění LPS ze Stx2 bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [72]. Stručně řečeno, kolona s konjugovanou protilátkou anti-Stx2 11E10 byla použita k získání frakce Stx2 a tato frakce následně prošla přes Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) k odstranění LPS. Frakce Stx2 byla filtrována pomocí 0,2 um filtru a hladina LPS byla testována pomocí testu na lyzát amebocytů Limulus (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). Bylo stanoveno, že frakce Stx2 má méně než 0,03 endotoxinové jednotky (EU)/ml. Typ varianty Stx2 byl Stx2a.

5.5. Podání Stx2 myším Dávka 2LD50 (5 ng Stx2/20 g tělesné hmotnosti), která usmrtí myši do čtyř dnů (obrázek S3A), byla injikována myším intraperitoneálně v objemu 0,1 ml ve fyziologickém roztoku bez LPS. (Otsuka pharmaceutical, Japonsko). Injekce toxinu byla provedena mezi 7 a 9 hodinou ranní, ve které myši s delším časovým průběhem dostávaly Stx2 v 7 hodin ráno a následovalo 24, 48 a 72 hodin odběru vzorků v 7 hodin ráno.

5.6. Sběr moči a měření glukózy v moči Po 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 a 84 hodinách injekce Stx2 byla odebrána moč a 10 µl bylo nakapáno na Fuji dry chem slide GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japonsko) a glukóza v moči byla měřena pomocí Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) v zařízení spravovaném společností. Jako 0 hodinový vzorek byla použita moč z injekce před Stx2. Sběr moči byl proveden u dvou myší

5.7. Zpracování tkání Po 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 a 72 hodinách injekce Stx2 byly tři myši v každém časovém bodě usmrceny CO2 a byly odebrány ledviny. Polovina jedné ledviny byla fixována 4% paraformaldehydem/fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem po dobu 7 dnů při 4 °C a zpracována pro parafinový řez. Další polovina ledviny byla použita k extrakci RNA pro mikročipovou analýzu. Tři myši bez jakékoli léčby byly použity jako normální (naivní nebo 0 h) kontrola. Třem myším byl injikován PBS (vehikulum) a usmrceny v 72 h a sloužily jako kontrola vehikula, aby se ukázalo, že existují zanedbatelné změny v genové expresi ve srovnání s normální kontrolou.

5.8. Stain Periodic Acid-Schiff (PAS) Parafínové řezy byly hydratovány a obarveny 0,5% roztokem kyseliny jodisté, poté následovalo opláchnutí destilovanou vodou. Řezy byly přeneseny do Schiffova činidla. Poté, co byly řezy důkladně promyty 0,6% roztokem hydrogensiřičitanu sodného, ​​byly kontrastně obarveny hematoxylinem.

5.9. Ošetření Stx2 v lidském RPTEC Buňky RPTEC byly ošetřeny 10 ng/ml Stx2 po dobu 6, 13 a 19 hodin při 37 °C, 5 % CO2. RPTEC bez ošetření Stx2 byl použit jako kontrola. V každém časovém bodě byly provedeny dvě biologické repliky. Po promytí PBS byly buňky použity pro extrakci RNA.

5.10. Volně plovoucí imunofluorescenční barvení Pro zpracování volně plovoucích řezů byla normální myš perfundována a fixována, jak je popsáno v Obata et al. [69]. Myší ledviny byly poté vypreparovány a ponořeny do 4% PFA/PBS na 3 hodiny při 4 °C za mírného míchání. Tkáně byly promyty PBS a kryoprotekovány 30% sacharózou/PBS při 4 °C přes noc nebo dokud neklesly ke dnu. Silné zmrazené řezy (50 um) byly nařezány posuvným mikrotomem se zmrazeným nastavením. Řezy byly blokovány 1:50 kozí anti-krysí IgM protilátkou v PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) po dobu 1 hodiny a inkubovány s anti-Gb3/CD77 protilátkou 1:100 v blokování roztok nebo izotypová kontrola (krysí IgM) v odpovídající koncentraci jako primární protilátka přes noc při 4 ◦C. Po promytí byly řezy inkubovány se sekundární protilátkou (anti-krysí IgM Alexa Fluor 488, ředění 1:2000 v PBS) po dobu 2 hodin při 4 °C. Řezy byly obarveny pro další sondy AQP1 (ředění 1:1000, Sigma-Aldrich Japonsko, Tokio, Japonsko) a CD31 (550274, ředění 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) se sekundárními protilátkami proti králičím IgG Alexa Fluor 546 (1:2000 ředění v PBS) a anti-myší IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 ředění v PBS), v tomto pořadí. Po promytí PBS bylo barveno 40 ,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI, D21490, Thermo Fisher) po dobu 15 minut při 4 °C. Řezy byly ponořeny do kapaliny v jamce 96-jamkové destičky (ve tvaru U) s drobným ruměncem při každé výměně roztoku. Krok promývání byl proveden ve větších jamkách, jako jsou 12- nebo 6-jamkové destičky. Pro krycí sklíčko byla použita vodná montážní média. Pro preparaci lidské tkáně byla posmrtná ledvina fixována ve 20% formalínu po dobu 2 týdnů a zpracována pro volně plovoucí preparaci jako pro myší tkáň s jednou výjimkou, anti-lidskou CD31 protilátkou (CBL468, ředění 1:20, Merck KGaA, Darmstadt , Německo).

5.11. Microarray analýza

Polovina ledviny se ponoří do 2 ml RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) při 4 °C a celková RNA se extrahuje soupravou Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Byla použita pole Mouse Genome 430A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Soubory CEL byly získány a normalizovány pomocí robustního vícečipového průměrování (RMA), výpočtu počtu kopií RNA a násobných změn proti 0 h byly provedeny v R (v.3.6.0) s jeho balíčkem affy [73] a RankProd 2.0 [74]. Data jsou zobrazena v log{14}}násobku hodnot změn. Soubor dat je uložen v Gene Expression Omnibus (GEO) (přístupové číslo GSE172465). Z buněk RPTEC byla celková RNA extrahována pomocí RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokio, Japonsko). Celý lidský genomový oligonukleotidový microarray (44K oligonukleotidový DNA microarray, Agilent Technologies, Tokio, Japonsko) byl použit pro microarray experimenty. Vzorky celkové RNA byly použity pro přípravu cDNA sond značených Cy5- a Cy{18}}. Fluoroforem značené vzorky byly hybridizovány na každém skleněném podložním sklíčku a promyty, poté skenovány DNA microarray skenerem (model G2505A; Agilent Technologies). Software Feature Extraction and Image Analysis (Agilent Technologies) byl použit k lokalizaci a vymezení každého bodu v poli a k ​​integraci intenzit, které byly poté filtrovány a normalizovány pomocí lokálně vážené metody vyhlazování bodového grafu. Reprodukovatelnost mikročipové analýzy byla hodnocena dvěma opakováními výměny barviv v každém experimentu. Byly porovnány rozdíly v expresi mRNA mezi kontrolou a RPTEC ošetřenými Stx{22}}sklízenými po 6, 10 nebo 19 hodinách. Data ve formátu TXT ze softwaru GeneSpring byla použita k určení názvů genů z ID sondy a převedení změn skládání na změny log{26}}složek. Soubor dat je uložen na GEO (přístupové číslo GSE172466).

5.12. Bioinformatická analýza mikročipových dat a vizualizace V obou myších ledvinách a RPTEC microarray datech geny, které jsou společné oběma a kde změna exprese byla více než 2-násobně nižší nebo vyšší (nebo log2-násobná změna je buď menší než -1 nebo větší než 1) v kterémkoli časovém bodě byly vybrány R. Navíc v datech mikročipů myší ledvin. Genové změny, které odpovídají kubickým křivkám, byly vybrány pomocí R balíčku maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (poslední přístup 4. ledna 2022)] [75]. Kubická křivka je vhodná pro přizpůsobení nárůstu nebo poklesu těchto genů v průběhu času. Vyšší polynomiální stupeň, jako je kubická křivka, umožňuje vybrat geny s vícenásobnými změnami v průběhu času lépe než kvadratická křivka. Geny, které se chovaly podobnou trajektorií, byly seskupeny a jejich vzorce poklesu/přírůstku byly vizualizovány tepelnou mapou pomocí gplotů R balíčku [https://CRAN.R-project.org/package{10}}gplots (naposledy přístupné 4. ledna 2022)] [76]. Byla přiřazena genová ontologie (GO) a funkce GO mezi běžnými geny byly obohaceny pomocí Metascape [http://metascape.org (poslední přístup 4. ledna 2022)] [77]. Spojení/vztah společných genů byly analyzovány pomocí STRING [https://string-db.org/ (poslední přístup 4. ledna 2022)] [78]. Asociace mezi společnými geny byla hledána ručně i pomocí funkce dolování textu STRING.

Reference

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Hemolyticko-uremický syndrom.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vítský, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Hemolyticko-uremický syndrom: Studie renálních patologických změn.Dopoledne. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Poškození tubulární funkce verotoxinem přispívá k poškození ledvin pozorovanému u hemolyticko-uremického syndromu.J. Infect.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Aktivace kinázy rodiny Src ano indukovaná vazbou toxinu Shiga na globotriaosylceramid (Gb3/CD77) v mikrodoménách s nízkou hustotou, nerozpustných v detergentech.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Vazba toxinu Shiga na globotriaosylceramid indukuje intracelulární signály, které zprostředkovávají remodelaci cytoskeletu v buňkách odvozených z lidského renálního karcinomu.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furinem indukované štěpení a aktivace Shiga toxinu.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Redukce proteinových disulfidových vazeb v oxidačním prostředí. Disulfidový můstek A-podjednotky cholerového toxinu je redukován v endoplazmatickém retikulu.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Pán, JM; Roberts, LM Proteinová disulfidizomeráza redukuje ricin na jeho řetězce A a B v endoplazmatickém retikulu.Biochem. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shiga toxin je transportován z endoplazmatického retikula po interakci s luminálním chaperonem HEDJ/ERdj3.Infikovat. Immun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga toxin B-podjednotka se váže na chaperon BiP a nukleolární protein B23.Biol. Buňka2006, 98, 125–134. [CrossRef]