Abstraktní

Východiska: Ledviny jsou vysoce komplexní orgán s mnoha funkcemi, které jsou nezbytné pro zdraví. Onemocnění ledvin nastává, když jsou ledviny poškozené a nefungují správně. Jednobuněčná analýza je výkonná technika, která poskytuje bezprecedentní pohled na normální a abnormální typy ledvinových buněk a změní naše chápání mechanismů běžných onemocnění ledvin.

Souhrn: Naše chápání patogeneze onemocnění ledvin je omezeno neúplnou molekulární charakterizací typů buněk odpovědných za funkci ledvin. Aplikace jednobuněčné technologie ve výzkumu ledvin odhalila buněčnou heterogenitu, profily genové exprese a molekulární dynamiku ve vývoji a progresi onemocnění ledvin. Jednobuněčná analýza renálních organoidních tkání a tkání aloštěpů poskytla nový pohled na renální organogenezi, mechanismy onemocnění a terapeutické výsledky. Celkově lepší pochopení heterogenity renálních buněk a molekulární dynamiky renálního onemocnění zlepší diagnostickou přesnost a pomůže identifikovat nové terapeutické strategie v nefrologii.

Klíčové sdělení: V tomto přehledovém článku shrnujeme nedávný jednobuněčný výzkum onemocnění ledvin a diskutujeme o dopadu jednobuněčné technologie na základní a klinický výzkum ledvin.

Klíčová slova

Jednobuněčná technologie; Nemoc ledvin; imunitní buňka; ledvinový organoid; aloštěp;Výhody Cistanche.

Úvod

Ledviny jsou dva orgány ve tvaru fazole odpovědné za filtrování odpadu, přebytečné vody a dalších nečistot v krvi a za produkci moči. Ledviny také regulují pH, hladinu soli a draslíku a krevní tlak; kontrolovat tvorbu červených krvinek; a aktivovat formu vitamínu D, která pomáhá tělu vstřebávat vápník. k dnešnímu dni trpí přibližně 850 milionů lidí na celém světě onemocněním ledvin, včetně chronického onemocnění ledvin (CKD), akutního poškození ledvin, selhání ledvin a mnoha dalších stavů. Onemocnění ledvin nastává, když jsou ledviny poškozeny a nejsou schopny plnit své funkce. Poškození může být způsobeno cukrovkou, vysokým krevním tlakem a řadou dalších chronických (dlouhodobých) stavů. Onemocnění ledvin může vést k dalším zdravotním problémům, včetně osteoporózy, poškození nervů, podvýživy a srdečních chorob. Současnými léčebnými strategiemi pacientů zůstávají transplantace ledvin nebo dialýza, které jsou nákladné.

Různé buňky v ledvinách, včetně epiteliálních, tylakoidních, endoteliálních a neuronálních buněk, stejně jako sítě imunitních buněk, interagují za účelem udržení normální funkce ledvin. Hlubší pochopení heterogenity zdravých ledvin a procesů, které jsou základem onemocnění ledvin, zpřesní molekulární a histopatologickou fenotypovou definici ledviny a podpoří vývoj nových klasifikací onemocnění. Jednobuněčná technologie je potenciálně výhodná při identifikaci buněčných podtypů, stavů a ​​změn frekvence během nástupu a progrese onemocnění ledvin. V posledních letech, s rychlým rozvojem vysoce výkonné technologie sekvenování jednobuněčné RNA (scRNA-seq), byl zkonstruován komplexní buněčný atlas normální ledviny pro výzkum ledvinové precizní medicíny. Projekt Kidney Precision Medicine Project (KPMP) byl vyvinut globálně za účelem získávání biopsií lidských ledvin, vytváření atlasů ledvinové tkáně, definování subpopulací onemocnění a nakonec identifikace klíčových buněk, cest a cílů pro nové terapie. Na základě jednobuněčného transkripčního souboru dat spojených s ledvinami výzkumníci také analyzovali profily genové exprese ACE2, TMPRSS2 a SLC6A19 v podtypech renálních buněk, což je zásadní pro pochopení patogeneze koronaviru 2 těžkého akutního respiračního syndromu. V tomto přehledu zaměříme se na (1) vývoj a aplikaci jednobuněčné technologie, (2) využití scRNA-seq ke studiu vývoje a progrese onemocnění ledvin, (3) molekulární mapování imunitních buněk u onemocnění ledvin, ( 4) aplikace scRNA-seq na orgány podobné ledvinám a (5) použití scRNA-seq k hloubkovému studiu renálních aloštěpů (obrázek 1).

Pro získání klikněte semúčinky Cistanche na ledviny

Vývoj a aplikace jednobuněčné transkriptomické technologie

Jedna buňka je základní jednotkou života. Techniky analýzy jednotlivých buněk způsobily revoluci v naší schopnosti identifikovat složení buněk, sledovat molekulární dynamiku a odhalit patologické mechanismy. Analýza časné globální jednobuněčné genové exprese byla provedena pomocí technik microarray a qPCR. Tietjen a kol. použili jednobuněčné mikročipy ke sledování profilů molekulární exprese jednotlivých neuronů a progenitorových buněk a k definování signálních drah v různých vývojových stádiích. Kromě toho analýza jednobuněčné exprese identifikovala několik vyvíjejících se podtypů buněk, které mají nové pankreatické geny, což poskytuje nový pohled na vývoj pankreatu. Tato třída vyvinula techniky jednobuněčné qPCR a použila je ke studiu klíčových regulačních genů ve vývoji myších blastocyst a diferenciaci hematopoetických linií.

S příchodem sekvenačních technologií nové generace prokázala scRNA-seq jasné výhody při rozlišování různých izoforem, alelické exprese a nových transkriptů v jednotlivých buňkách za nižší cenu. v roce 2009 Tang a kol. ohlásili první jednobuněčné sekvenování celého transkriptomu mRNA, což prokázalo složitost transkripčních variant v jednotlivých myších oocytech nebo oocytech. smart-seq was 2012 byl vyvinut k detekci transkriptů plné délky v jednotlivých buňkách a jeho aplikací na vzácné buňky vědci identifikovali kandidátní biomarkery pro melanomové cirkulující nádorové buňky. O rok později byl představen Smart-seq2 s vylepšeným reverzním přepisem, pokrytím čtení, zkreslením a přesností. Nedávný vývoj v Smart-seq3 výrazně zlepšil jeho citlivost při detekci tisíců jednobuněčných transkriptů při alelickém a izoformním rozlišení. Na rozdíl od amplifikačních metod založených na PCR, CEL-seq zachycuje účinné jednobuněčné transkriptomy pomocí multiplexní lineární amplifikace. Studie využívající CEL-seq ke studiu raného embryonálního vývoje Cryptobacterium hidradenoma odhalila jeho reprodukovatelné a citlivé výsledky při rozlišení jednotlivých buněk. První automatizovanou platformou scRNA-seq je Fluidigm C1, která využívá mikrofluidní systém k zachycení jednotlivých buněk v 96 nebo 384 komůrkách, následuje buněčná lýza, reverzní transkripce a PCR amplifikace.

Od roku 2015 jednobuněčný výzkum plně vstoupil do éry vysoké propustnosti, nízkých nákladů a automatizace s pokračující dostupností Drop-seq, inDrop, 10× Genomics, Seq-well, Microwell-seq a SPLiTseq. Drop-seq a inDrop oddělují jednotlivé buňky na kapičky o velikosti nanolitrů a smíchají je s jedinečným čárovým kódem pro označení každé buňky. Na druhé straně Cyto-seq, Seq-well a Microwell-seq umožňují vysoce výkonné jednobuněčné sekvenování mRNA zachycením buňky a kuličky čárového kódu do mikrojamky. Naše skupina zkonstruovala první atlas myších buněk a krajinu lidských buněk na úrovni jedné buňky pomocí Microwell-seq. V poslední době se vyšší propustnost a jednodušší metody nazývají SPLiT-seq a sci-RNA-seq pro scRNA-seq. Tyto metody používají samotnou buňku nebo jádro jako reakční komoru pro buňky označené čárovým kódem v několika kolech dělení poolu. Všechny buňky jsou poté podrobeny cDNA PCR amplifikaci a sekvenování. Cao a kol. použil sci-RNA-seq3 k analýze transkriptomů přibližně 2 milionů myších organogenních buněk a 4 milionů lidských fetálních buněk, čímž poskytl globální pohled na vývojové procesy savců. Vzkvétaly i další jednobuněčné technologie zahrnující genomické, proteomické a epigenomické analýzy; jsou však nad rámec tohoto příspěvku.

Výskyt a progrese onemocnění ledvin

Ledviny mohou být postiženy mnoha běžnými a závažnými onemocněními, včetně akutního poškození ledvin, glomerulonefritidy, vzestupných infekcí (pyelonefritidy) a rakoviny. Celkově je naše chápání patogeneze onemocnění ledvin omezeno neúplnou molekulární charakterizací buněčných typů odpovědných za orgánově specifické funkce. Abychom tuto mezeru ve znalostech uzavřeli, naše skupina a Park et al. zkonstruoval transkripční atlas zdravé myší ledviny pomocí scRNA-seq. Hlavní podtypy epiteliálních buněk renální jednotky zahrnovaly stopkové buňky, proximální tubulární epiteliální buňky, Henleův prstenec, distální tubuly a buňky sběrných kanálků. Studie identifikovala nový typ migračních buněk pro sběr populací duktálních buněk, což potvrdilo předchozí zjištění vzájemné konverze mezi interkalovanými buňkami a hlavními buňkami ve studiích scRNA-seq. Kromě toho Ransick a kol. analyzovali dospělé mužské a ženské ledviny a vytvořili anatomický atlas myších ledvinových elementů na úrovni jednotlivých buněk. Naše skupina také provedla Microwell-seq analýzu lidské fetální a dospělé ledvinové tkáně. Kromě epiteliálních buněk, endoteliálních buněk, stromálních buněk a imunitních buněk ve tkáni jsme identifikovali dříve nepopsané typy somatických buněk typu s ve fetální ledvině a nový typ migračních buněk v ledvině dospělých. Jednobuněčné molekulární profilování renálního vaskulárního systému odhalilo specializované expresní profily stavebních nefronů a odhalilo patogenezi renálního onemocnění. Kromě toho byly všechny typy glomerulárních buněk identifikovány ze zdravých myší a různých modelů onemocnění analýzou shlukování jednobuněčných transkriptomů a v modelech onemocnění byly detekovány nové geny související s onemocněním a regulační dráhy, jako je například hroší dráha aktivovaná v podocytech po nefrotoxické imunitní reakci. zranění.

Renální fibróza je charakteristickým znakem CKD a postihuje více než 10 procent světové populace. V modelu heterogenní koexistence renální fibrózy Kramann et al. použil scRNA-seq k potvrzení, že monocyty přispěly malým podílem myofibroblastů, ale že většina myofibroblastů byla odvozena z mezenchymálních buněk. Následně Kuppe a spol. [37] analyzovali transkriptom přibližně 135,{4}} buněk z proximálních a neproximálních tubulů a dále potvrdili, že různé izoformy MSC jsou hlavními přispěvateli k lidské renální fibróze. Kromě toho byl ve srovnávací analýze zdravých a fibrotických renálních monocytů identifikován gen specifický pro myofibroblasty, homolog 2 nahého keratinocytu (NKD2), jako potenciální terapeutický cíl pro lidskou renální fibrózu. Na základě 402 biopsií ledvin byl fibrinogen v moči předpovězen jako neinvazivní biomarker u pacientů s CKD.

Standardizované Cistanche

Diabetická nefropatie (DN) je charakterizována současným poškozením glomerulů a tubulárního intersticia. Relativně málo je však známo o tom, jak se buněčný stav a frekvence mění s nástupem onemocnění a progresí genové exprese. Pro objasnění změn v genové expresi glomerulárních buněk u myší DN Fu et al. provedli analýzu scRNA-seq a identifikovali několik nových potenciálních markerů glomerulárních buněk, včetně Magi2, Robo2, Ramp3 a Fabp4. U diabetické nefropatie (DKD) je regulace angiogenních a migračních drah změněna v endoteliálních buňkách, zatímco translační a proteinově stabilní regulační dráhy jsou vysoce obohaceny v tylakoidních buňkách. Celkově změny v molekulární dynamice endoteliálních a tylakoidních buněk pomohou identifikovat důležité patofyziologické faktory přispívající k progresi DN. Chung a kol. znázornil jednobuněčný transkriptom glomerulů na myším modelu diabetes mellitus. Genová exprese byla změněna v thylakoidech a podocytech ob/ob myší ve srovnání s kontrolami. Proliferativní dráhy byly indukovány v tylakoidních buňkách a dráhy související se smrtí buněk byly indukovány v podocytech, v souladu se změnami v poměru počtu buněk. Komplexní analýza publikovaných datových souborů DKD scRNA-seq identifikovala 17 klíčových genů, což obohatilo naše chápání molekulárních mechanismů, které jsou základem patogeneze DKD. Navíc nezaujaté sekvenování jednojaderné RNA (snRNA-seq) kryokonzervovaných vzorků lidských diabetických ledvin poskytlo 23 980 transkriptomů ze tří kontrolních a tří raných vzorků DN. Výsledky ukázaly buněčně specifické změny v genové expresi naznačující zvýšenou sekreci draslíku v lidské DN. Předchozí studie porovnávající scRNA-seq a snRNA-seq v ledvinách dospělých myší ukázala, že ta druhá měla účinnější záchytnou kapacitu. Například glomerulární podocyty, tylakoidní buňky a endoteliální buňky byly zachyceny pomocí snRNA-seq spíše než pomocí scRNA-seq. Aplikace snRNA-seq minimalizuje pseudoefekty enzymatického štěpení a lze ji provádět na zmrazených vzorcích, což by mělo vést k širší aplikaci k urychlení studia patologických mechanismů u různých onemocnění ledvin.

Přesný buněčný transkriptom může odhalit původ renálních nádorových buněk a transkripční trajektorie podporující maligní transformaci. mladý a spol. definovali normální a rakovinné typy lidských ledvinových buněk z katalogu 72 501 jednobuněčných transkriptomů. Identifikací specifických normálních buněčných korelátů renálních rakovinných buněk (RCC) studie poskytla důkaz pro hypotézu, že Wilmsovy nádorové buňky jsou aberantní fetální buňky a že RCC mohou pocházet z málo známého podtypu proximálních tubulárních buněk. Takže scRNA-seq poskytuje škálovatelnou experimentální strategii pro charakterizaci lidských buněk rakoviny ledvin s přesným kvantitativním buněčným molekulárním rozlišením.

Molekulární atlas imunitních buněk u onemocnění ledvin

Imunitní buňky jsou základní složkou lidských tkání a hrají důležitou roli ve fyziologickém a patologickém metabolismu. Schopnost imunitního systému rozpoznat patogenní nebo nebezpečné signály nebo maligní buňky je skutečně klíčová. Aplikace jednobuněčné technologie při studiu renálních imunitních buněk má potenciál usnadnit lepší pochopení úlohy imunitního systému v patogenezi zdravých ledvin a onemocnění, stejně jako identifikovat nové terapeutické strategie. Tyto snahy začínají mapovat složitou imunitní krajinu v ledvině a odhalovat vztah mezi imunitními buňkami rezidentními v tkáni a jejich vzájemně aktivovanými sousedy.

V roce 2018 poskytla aplikace scRNA-seq v myší tkáni ledvin komplexní krajinu imunitních buněk včetně rezidentních makrofágů, neutrofilů, B a T lymfocytů a NK buněk. O rok později byla založena bezprecedentní jednobuněčná studie časoprostorové organizace imunitních buněk lidských ledvin. Ve fetálních a dospělých ledvinách byly identifikovány sítě myeloidních a lymfoidních imunitních buněk v tkáni a studie identifikovaly postnatálně získané transkripční programy, které podporují obranu proti infekci. Kromě toho bylo předpovězeno, že cross-talk mezi zralými ledvinovými epiteliálními buňkami a imunitními buňkami rekrutuje antibakteriální makrofágy a neutrofily do nejcitlivějších oblastí ledvin. Celkově komplexní imunitní krajina ledvin přispívá ke studiu patogenních mechanismů a identifikaci terapeutických cílů u imunitních a infekčních onemocnění ledvin.

Lupusová nefritida (LN) je potenciálně smrtelné autoimunitní onemocnění, pro které jsou současné terapie neúčinné a často toxické. Molekulární a buněčné procesy vedoucí k poškození ledvin a heterogenita LN zůstávají nejasné. scRNA-seq použil Arazi et al. identifikovat 21 pro onemocnění specifických subpopulací myeloidních, T, přirozených zabíječů a B buněk u pacientů s LN. Podobně Der a kol. aplikovali scRNA-seq do tkání biopsie ledvin a kůže od pacientů s LN. Skóre odpovědi na interferon typu I tubulárních epiteliálních buněk bylo hlášeno jako vyšší u pacientů s LN než u zdravých kontrol. Kromě toho byly zánětlivé a fibrotické rysy tubulárních buněk spojeny s neúčinností léčby. V DKD analýza scRNA-seq ukázala významně vyšší počet imunitních buněk v diabetických glomerulech než u kontrol. Tyto studie naznačují, že profily genové exprese imunitních buněk v moči, kůži a ledvinách vysoce korelují, což naznačuje, že biopsie moči a kůže mohou být potenciálním zdrojem diagnostických a prognostických markerů pro onemocnění ledvin.

Nedávné studie prokázaly roli imunitních buněk v modelech renálního onemocnění s jednobuněčným rozlišením. Modely unilaterální ureterální obstrukce jsou široce používány pro renální intersticiální fibrózu, kdy makrofágy a zánětlivé buňky infiltrují renální intersticium, což vede k výrazným změnám renální hemodynamiky a metabolismu. scRNA-seq byla použita v modelech reverzibilní unilaterální ureterální obstrukce k disekci krajiny myeloidních buněk během progrese a regrese fibrózy. Conway a kol. odhalila heterogenitu v myeloidních buňkách s dynamickými změnami v relativních proporcích subpopulací, monocyty se rekrutují brzy v poranění, Ccr2 plus makrofágy se akumulují pozdě v poranění a nový shluk Mmp12 plus makrofágů hraje roli v procesu opravy. Při onemocnění ledvin a transplantaci je ischemicko-reperfuzní poškození (IRI) spojeno se zánětem a nárůstem leukocytů. experimentální modely IRI byly použity k posouzení funkční role 2 skupin vrozených lymfoidních buněk v ledvinách a data naznačují, že tyto buňky mají nadbytečné funkce při poškození ledvin. Aplikací scRNA-seq na model IRI transplantátu ledviny Kremann et al. zjistili, že následná infiltrace CXCR5 plus leukocyty vedla ke zvýšeným systémovým hladinám CXCL13. knRNA-seq byla také aplikována na myší model IRI od Kirita et al. k charakterizaci detailních buněčných odpovědí po poranění a k identifikaci odlišného prozánětlivého a profibrotického buněčného stavu proximálního tubulu. Kyselina močová, konečný oxidační produkt metabolismu purinů, je úzce spojena se zánětem ledvin u několika modelů onemocnění. Například NLRP3 (NOD-, LRR- a pyrin obsahující strukturální doména 3) snímá signály nadbytku kyseliny močové a zánětlivé vezikuly jsou aktivovány při hyperurikemické nefropatii. Specifické imunitní mechanismy, které jsou základem hyperurikémií indukovaného poškození ledvin, však nejsou známy. Očekává se, že v blízké budoucnosti bude realizována konstrukce krajiny zánětlivého těla na úrovni jednotlivých buněk v modelu hyperurikemie indukovaného poškození ledvin.

Imunitní infiltrace existuje v nádorech ledvin a je ovlivněna mikroprostředím nádoru. Předchozí studie ukázala, že populace makrofágů infiltrujících nádory exprimují vaskulární endoteliální růstový faktor A a jsou zapojeny do komplexní signální dráhy VEGF v tkáni RCC. Tato studie ukazuje, že scRNA-seq může řešit tumorigenezi a identifikovat domnělé patofyziologické mechanismy a buněčné signální sítě, které mohou sloužit jako cíle pro lékovou terapii. Celkově studie zdůrazňuje pokroky v scRNAseq, které poskytují pohled na imunitní systém a buněčné sítě fungující ve zdravých a nemocných ledvinách.

Bylinná cistanche

Aplikace scRNA-seq na ledvinové organoidy

Kromě studia nemocných ledvinových tkání se renální organoidy staly klíčovým nástrojem pro studium organogeneze a mechanismů onemocnění a mají potenciál urychlit vývoj terapií jako zdroje alternativních tkání. Souběžně vedly pokroky v scRNA-seq k podrobnější analýze různých buněčných subpopulací a změn genové exprese v orgánech podobných ledvinám.

Celkově je nutné lépe porozumět embryonálnímu vývoji ledvin na úrovni jednotlivých buněk, aby bylo možné řídit zrání orgánů podobných ledvinám. Jednobuněčné transkriptomické studie lidské fetální ledviny identifikovaly 22 typů buněk a odpovídající markerové geny.

Srovnání různých vývojových stádií ukazuje kontinuitu molekulární dynamiky buněk nohy. Další jednobuněčná analýza byla provedena na lidských fetálních ledvinách a orgánech podobných ledvinám pocházejícím z embryonálních kmenových buněk. Srovnávací analýza vývojových trajektorií jednotlivých buněk v ledvině odhalila podobné profily genové exprese in vivo a in vitro, s výjimkou podocytů v pozdním stádiu, což naznačuje neúplný proces zrání orgánů podobných podocytům. Transplantační experimenty dále naznačují, že tylakoidní a vaskulární lumen lze optimalizovat pomocí modelů organoidů. Nedávná studie využívající posteriorní renální mezenchymální a ureterální buňky podobné pupenům k vytvoření renálních organoidů ukázala, že scRNA-seq zlepšila zrání proximálních tubulů a snížila populace mimo cílových buněk. Analýza scRNA-seq renálních organoidů pocházejících z lidských pluripotentních kmenových buněk (PSC) byla provedena Subramanianem et al. a Wu a kol. Ve srovnání s lidskými fetálními a dospělými ledvinovými jednobuněčnými datovými soubory, různé orgány podobné ledvinám vykazovaly do značné míry reprodukovatelné buněčné typy, ale s různými proporcemi buněk v důsledku přítomnosti necílových buněk. Kromě toho analýza sítě transkripčních faktorů odhalila dráhy renální organoidní diferenciace, což zvýrazňuje sílu jednobuněčné technologie při charakterizaci a vedení diferenciace organoidů.

Závěrem lze říci, že orgány podobné lidským ledvinám jsou užitečným zdrojem pro modely těžby nemocí, potenciální regulační mechanismy, vysoce výkonný screening léků a nakonec regenerační terapie. Tyto studie zdůrazňují potenciální použití scRNA-seq v renálních modelových systémech k objasnění in vivo fyziologických a patologických procesů a poskytují vodítko pro budoucí výzkum v diagnostice a léčbě onemocnění ledvin.

Pohled do aloštěpů ledvin pomocí scRNA-seq

Alogenní transplantace ledviny je jednou z nejúčinnějších klinických léčebných postupů u konečného onemocnění ledvin. Jednobuněčná technologie nabízí možnost přesně a přesně charakterizovat typy a stav renálních buněk pomocí vzorků lidské biopsie po alogenní transplantaci. První publikovaná zpráva o bioptických vzorcích po transplantaci ledvin analyzovala 8746 jednobuněčných transkriptomů a definovala odlišné zánětlivé reakce. Monocyty tvořily neklasickou skupinu CD16 plus a klasickou skupinu CD16-; endoteliální buňky vykazovaly klidový stav a 2 stavy odmítnutí zprostředkované protilátkou. Tato zjištění přispívají k našemu lepšímu pochopení imunitní rejekce při transplantaci ledviny. Ve srovnávací studii renálních monocytů od příjemců a dárců vykazovaly vzorky renální biopsie významně odlišnou expresi transkripčních genů. U příjemců byly pozorovány makrofágy aktivované zánětem a cytotoxicky exprimované T buňky. Podobně Liu a kol. analyzovali buňky z chronického odmítnutí transplantátu ledvin a porovnávali zdravé dospělé ledviny na úrovni jednotlivých buněk. Nekontrolovaná shluková analýza odhalila, že zvýšený počet imunitních buněk a myofibroblastů ve skupině s chronickou rejekcí ledvinového transplantátu může přispívat k renální rejekci a fibróze. Zejména nedávná studie zobrazila první jednobuněčný atlas moči dospělých a identifikovala populace ledvinových kmenových/progenitorových buněk SOX9 plus v moči. Progenitorové buňky úspěšně proliferovaly a diferencovaly se in vivo, získaly některé vlastnosti tubulárních buněk a poskytly potenciálně užitečný zdroj pro budoucí terapii transplantace ledvin. Celkově technologie scRNA-seq poskytuje nové a bystré vhledy do odmítnutí lidského ledvinového transplantátu, což v konečném důsledku zlepšuje diagnostickou přesnost a urychluje přijetí interpretace molekulární biopsie.

Doplňky Cistanche

Závěr

V posledním desetiletí se scRNA-seq stala nepostradatelným nástrojem pro analýzu diferenciální genové exprese napříč celým transkriptomem pro studium fyziologické biologie a identifikaci molekulárních regulačních abnormalit u onemocnění. Na rozdíl od tradičních diskrétních fenotypů může molekulární charakterizace na úrovni jedné buňky poskytnout systematický standard pro charakterizaci fenotypů onemocnění ledvin. Aplikace jednobuněčné technologie ve zdravé tkáni ledvin nebo ve vzorcích klinické biopsie ledviny poskytuje komplexní molekulární atlas ledviny a rozšiřuje naše chápání nefrologie. Renální jednobuněčný atlas bude nedílnou součástí mezinárodní práce Human Cell Atlas, jejímž cílem je vytvořit komplexní a systematickou referenční mapu lidského těla. V budoucích studiích se očekává, že jednobuněčné ultra-vysokopropustné a prostorové transkriptomové analýzy rozšíří naše chápání ledvin. Integrace multi-omických dat dále zlepší personalizovanou diagnostiku a léčbu onemocnění ledvin.

REFERENCE

1. Kriz W, Bankir L. Standardní nomenklatura pro struktury ledvin. Renální komise Mezinárodní unie fyziologických věd (IUPS). Kidney Int. 1988 Jan; 33(1):1–7.

2. Kurts C, Panzer U, Anders HJ, Rees AJ. Imunitní systém a onemocnění ledvin: základní pojmy a klinické důsledky. Nat Rev Immunol. říjen 2013;13(10):738–53.

3. Luyckx VA, Al-Aly Z, Bello AK, Bellorin Font E, Carlini RG, Fabian J a kol. Cíle udržitelného rozvoje jsou důležité pro zdraví ledvin: aktualizace pokroku. Nat Rev Nephrol. leden 2021;17(1):15–32.

4. Clark AR, Greka A. Síla jednoho: pokroky v jednobuněčné genomice v ledvinách. Nat Rev Nephrol. 2020 února;16(2):73–4.

5. Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, Sun H, Lai S a kol. Mapování atlasu myších buněk pomocí microwell-seq. Buňka. únor 2018;172(5):1091–107.e17.

6. Park J, Shrestha R, Qiu C, Kondo A, Huang S, Werth M a kol. Jednobuněčná transkriptomika myší ledvin odhaluje potenciální buněčné cíle onemocnění ledvin. Věda. květen 2018; 360(6390):758–63.

7. Hochane M, van den Berg PR, Fan X, Bérenger-Currias N, Adegeest E, Bialecka M, et al. Jednobuněčná transkriptomika odhaluje dynamiku genové exprese vývoje ledvin lidského plodu. PLoS Biol. 2019 Únor; 17(2): e3000152.

8. Han X, Zhou Z, Fei L, Sun H, Wang R, Chen Y a kol. Konstrukce lidské buněčné krajiny na úrovni jedné buňky. Příroda. květen 2020; 581(7808):303–9.

9. Liao J, Yu Z, Chen Y, Bao M, Zou C, Zhang H a kol. Jednobuněčné sekvenování RNA lidské ledviny. Sci Data. leden 2020;7(1):4.

10. Přesná medicína v nefrologii. Nat Rev Nephrol. 2020 List;16(11):615.

11. Chen QL, Li JQ, Xiang ZD, Lang Y, Guo GJ, Liu ZH. Lokalizace genů SARS-CoV-2 souvisejících s buněčným receptorem v ledvinách pomocí jednobuněčné transkriptomové analýzy. Kidney Dis. červenec 2020; 6 (4): 258–70.

12. Tietjen I, Rihel JM, Cao Y, Koentges G, Zakhary L, Dulac C. Jednobuněčná transkripční analýza neuronálních progenitorů. Neuron. 2003 duben;38(2):161–75.

13. Chiang MK, Melton DA. Jednobuněčná transkriptová analýza vývoje pankreatu. Dev Cell. březen 2003;4(3):383–93.

14. Guo G, Huss M, Tong GQ, Wang C, Li Sun L, Clarke ND a kol. Rozlišení rozhodnutí o osudu buněk odhalené analýzou exprese jednobuněčného genu od zygoty po blastocystu. Dev Cell. 2010 duben;18(4):675–85.

15. Guo G, Luc S, Marco E, Lin TW, Peng C, Kerenyi MA a kol. Mapování buněčné hierarchie pomocí jednobuněčné analýzy repertoáru buněčného povrchu. Cell Stem Cell. říjen 2013;13(4):492–505.

16. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: revoluční nástroj pro transkriptomiku. Nat Rev Genet. leden 2009;10(1):57–63.

17. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N a kol. Analýza celého transkriptomu mRNA-Seq jedné buňky. Metody Nat. 2009 květen;6(5):377–82.

18. Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR a kol. Kompletní mRNA-seq z jednobuněčných hladin RNA a jednotlivých cirkulujících nádorových buněk. Nat Biotechnol. Srpen 2012;30(8):777–82.

19. Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Smart-seq2 pro citlivé profilování transkriptomu v plné délce v jednotlivých buňkách. Metody Nat. listopad 2013;10(11): 1096–8.

20. Hagemann-Jensen M, Ziegenhain C, Chen P, Ramsköld D, Hendriks GJ, Larsson AJM a kol. Počítání jednobuněčné RNA při rozlišení alel a izoforem pomocí Smart-seq3. Nat Biotechnol. června 2020;38(6):708–14.

21. Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-seq:single-cell RNA-seq multiplexovanou lineární amplifikací. Cell Rep. 2012 Sep;2(3): 666–73.

22. Yanai I, Hashimshony T. CEL-seq2-jednobuněčné sekvenování RNA pomocí multiplexní lineární amplifikace. Metody Mol Biol. 2019;1979: 45–56.

23. Streets AM, Zhang X, Cao C, Pang Y, Wu X, Xiong L a kol. Mikrofluidní jednobuněčné celobuněčné sekvenování transkriptomu. Proč Natl Acad Sci USA A. 2014 květen;111(19):7048–53.

24. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. Kapkové čárové kódy pro jednobuněčnou transkriptomiku aplikované na embryonální kmenové buňky. Buňka. květen 2015;161(5): 1187–201.

25. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Vysoce paralelní profilování exprese jednotlivých buněk v celém genomu pomocí nanolitrových kapiček. Buňka. 2015 květen;161(5):1202–14.

26. Fan HC, Fu GK, Fodor SP. Profilování výrazů. Kombinatorické značení jednotlivých buněk pro genovou expresní cytometrii. Věda. únor 2015; 347(6222):1258367.

27. Gierahn TM, Wadsworth MH, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R, et al. Seq-well: přenosné, levné sekvenování RNA jednotlivých buněk s vysokou propustností. Metody Nat. 2017 duben;14(4):395–8.

28. Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R, et al. Komplexní jednobuněčné transkripční profilování mnohobuněčného organismu. Věda. Srpen 2017;357(6352): 661–7.

29. Rosenberg AB, Roco CM, Muscat RA, Kuchina A, Sample P, Yao Z a kol. Jednobuněčné profilování vyvíjejícího se myšího mozku a míchy s split-pool barcodingem. Věda. 2018 duben;360(6385):176–82.

30. Cao J, Spielmann M, Qiu X, Huang X, Ibrahim DM, Hill AJ a kol. Jednobuněčná transkripční krajina savčí organogeneze. Příroda. únor 2019;566(7745):496–502.

31. Cao J, O'Day DR, Pliner HA, Kingsley PD, Deng M, Daza RM a kol. Atlas lidských buněk exprese fetálních genů. Věda. 2020; 370(6518):370.

32. Chen L, Lee JW, Chou CL, Nair AV, Battistone MA, Păunescu TG a kol. Transkriptomy hlavních typů buněk sběrných kanálků ledvin u myší identifikovaných jednobuněčnou RNA-seq. Proč Natl Acad Sci USA A. 2017 Listopad;114(46): E9989–98.

33. Ransick A, Lindström NO, Liu J, Zhu Q, Guo JJ, Alvarado GF, et al. Jednobuněčné profilování odhaluje pohlaví, linii a regionální diverzitu v myších ledvinách. Dev Cell. 2019 Nov;51(3):399– 413.e7.

34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, Lis R, Zhang T, Lu T a kol. Molekulární determinanty vaskulární specializace nefronů v ledvině. Nat Commun. Prosinec 2019;10(1):5705.

35. Chung JJ, Goldstein L, Chen YJ, Lee J, Webster JD, Roose-Girma M, et al. Jednobuněčné transkriptomové profilování ledvinového glomerulu identifikuje klíčové typy buněk a reakce na poranění. J Am Soc Nephrol. říjen 2020;31(10): 2341–54.

36. Kramann R, Machado F, Wu H, Kusaba T, Hoeft K, Schneider RK, et al. Parabióza a jednobuněčné sekvenování RNA odhalují omezený příspěvek monocytů k myofibroblastům při fibróze ledvin. JCI Insight. 2018 květen;3(9): e99561.

37. Kuppe C, Ibrahim MM, Kranz J, Zhang X, Ziegler S, Perales-Patón J a kol. Dekódování myofibroblastů má původ ve fibróze lidské ledviny. Příroda. leden 2021;589(7841):281–6.

38. Wang H, Zheng C, Lu Y, Jiang Q, Yin R, Zhu P a kol. Fibrinogen v moči jako prediktor progrese CKD. Clin J Am Soc Nephrol. Prosinec 2017;12(12):1922–9.

39. Fu J, Akat KM, Sun Z, Zhang W, Schlondorff D, Liu Z a kol. Jednobuněčné RNA profilování glomerulárních buněk ukazuje dynamické změny u experimentálního diabetického onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 2019 duben;30(4):533–45.

40. Zhang Y, Li W, Zhou Y. Identifikace hub genů u diabetického onemocnění ledvin pomocí vícenásobné mikročipové analýzy. Ann Transl Med. Srpen 2020;8(16):997.

41. Wilson PC, Wu H, Kirita Y, Uchimura K, Ledru N, Rennke HG a kol. Jednobuněčná transkriptomická krajina časné lidské diabetické nefropatie. Proč Natl Acad Sci USA A. 2019 září;116(39):19619–25.

42. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Výhody jednojaderného sekvenování jednobuněčné RNA dospělé ledviny: vzácné typy buněk a nové buněčné stavy odhalené u fibrózy. J Am Soc Nephrol. 2019 led;30(1):23–32.

43. Young MD, Mitchell TJ, Vieira Braga FA, Tran MGB, Stewart BJ, Ferdinand JR a kol. Jednobuněčné transkriptomy z lidských ledvin odhalují buněčnou identitu renálních nádorů. Věda. Srpen 2018;361(6402):594–9.

44. Stewart BJ, Ferdinand JR, Young MD, Mitchell TJ, Loudon KW, Riding AM, et al. Časoprostorová imunitní zonace lidské ledviny. Věda. 2019 září;365(6460):1461–6.

45. Arazi A, Rao DA, Berthier CC, Davidson A, Liu Y, Hoover PJ a kol. Krajina imunitních buněk v ledvinách pacientů s lupusovou nefritidou. Nat Immunol. července 2019; 20 (7): 902–14.

46. ​​Der E, Ranabothu S, Suryawanshi H, Akat KM, Clancy R, Morozov P, et al. Jednobuněčné sekvenování RNA k rozboru molekulární heterogenity u lupusové nefritidy. JCI Insight. 2017 květen;2(9):e93009.

47. Der E, Suryawanshi H, Morozov P, Kustagi M, Goilav B, Ranabothu S, et al. Jednobuněčná transkriptomika tubulárních buněk a keratinocytů aplikovaná na lupusovou nefritidu odhaluje IFN typu I a dráhy relevantní pro fibrózu. Nat Immunol. 2019 Jul;20(7):915–27.

48. Conway BR, O'Sullivan ED, Cairns C, O'Sullivan J, Simpson DJ, Salzano A, et al. Jednobuněčný atlas ledvin odhaluje myeloidní heterogenitu v progresi a regresi onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. prosinec 2020; 31(12):2833–54.

49. Cameron GJM, Cautivo KM, Loering S, Jiang SH, Deshpande AV, Foster PS a kol. Vrozené lymfoidní buňky skupiny 2 jsou při experimentálním renálním ischemicko-reperfuzním poškození redundantní. Front Immunol. 2019;10:826.

50. Kreimann K, Jang MS, Rong S, Greite R, von Vietinghoff S, Schmitt R a kol. Ischemicko-reperfuzní poškození spouští uvolňování CXCL13 a nábor B buněk po alogenní transplantaci ledviny. Front Immunol. 2020;11:1204.

51. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Buněčné profilování myšího akutního poškození ledvin odhaluje konzervované buněčné reakce na poškození. Proč Natl Acad Sci USA A. 2020 Červenec;117(27):15874–83.

52. Wen L, Yang H, Ma L, Fu P. Role NLRP3 inflammasomem zprostředkovaných signálních drah v hyperurikemické nefropatii. Mol Cell Biochem. březen 2021;476(3):1377–86.

53. Nishinakamura R. Organoidy lidských ledvin: pokrok a zbývající výzvy. Nat Rev Nephrol. říjen 2019;15(10):613–24.

54. Tran T, Lindström NO, Ransick A, De Sena Brandine G, Guo Q, Kim AD, et al. In vivo vývojové trajektorie lidských podocytů informují in vitro o diferenciaci podocytů odvozených z pluripotentních kmenových buněk. Dev Cell. 2019 Jul;50(1):102–e6.

55. Uchimura K, Wu H, Yoshimura Y, Humphreys BD. Organoidy ledvin odvozené z lidských pluripotentních kmenových buněk se zlepšeným zráním sběrných kanálků a modelováním poranění. Cell Rep. 2020 Prosinec;33(11):108514.

56. Subramanian A, Sidhom EH, Emani M, Vernon K, Sahakian N, Zhou Y a kol. Jednobuněčné sčítání organoidů lidských ledvin ukazuje reprodukovatelnost a snížený počet necílových buněk po transplantaci. Nat Commun. 2019 List;10(1):5462.

57. Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, Kirita Y, Morris SA, Humphreys BD. Srovnávací analýza a upřesnění diferenciace organoidů ledvin odvozených z lidských PSC pomocí jednobuněčné transkriptomiky. Cell Stem Cell. 23. prosince 2018 (6):869–e8.

58. Czerniecki SM, Cruz NM, Harder JL, Menon R, Annis J, Otto EA a kol. Vysoce výkonný screening zlepšuje diferenciaci ledvinových organoidů od lidských pluripotentních kmenových buněk a umožňuje automatizované vícerozměrné fenotypování. Cell Stem Cell. června 2018;22(6): 929–e4.

59. Dvela-Levitt M, Kost-Alimova M, Emani M, Kohnert E, Thompson R, Sidhom EH, et al. Malá molekula se zaměřuje na TMED9 a podporuje lysozomální degradaci k reverzní proteinopatii. Buňka. Červenec 2019;178(3):521–e23.

60. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM a kol. Jednobuněčná transkriptomika vzorku biopsie aloštěpu lidské ledviny definuje různorodou zánětlivou odpověď. J Am Soc Nephrol. 2018 Aug;29(8):2069–80.

61. Malone AF, Wu H, Fronick C, Fulton R, Gaut JP, Humphreys BD. Využití exprimované variace jednoho nukleotidu a sekvenování jednobuněčné RNA k definování chimérismu imunitních buněk u odmítajícího transplantátu ledviny. J Am Soc Nephrol. 2020 září;31(9):1977–86.

62. Liu Y, Hu J, Liu D, Zhou S, Liao J, Liao G, et al. Jednobuněčná analýza odhaluje imunitní krajinu v ledvinách pacientů s chronickou rejekcí transplantátu. Teranostika. 2020; 10(19):8851–62.

63. Wang Y, Zhao Y, Zhao Z, Li D, Nie H, Sun Y a kol. Jednobuněčná analýza RNA-Seq identifikovala progenitorové buňky ledvin z lidské moči. Proteinová buňka. 2021 duben;12(4):305–12.

64. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. Sekvenování RNA: léta dospívání. Nat Rev Genet. 2019 List;20(11):631–56. 65 Regev A, Teichmann SA, Lander ES, Amit I, Benoist C, Birney E, et al. Atlas lidských buněk. Elife. 2017;12:6.

Mengmeng Jiang^a,b; Haide Chen^{b, c}; Guoji Guo^{a, b, c, d, e}

a: Liangzhu Laboratory, Zhejiang University Medical Center, Hangzhou, Čína;

b: Centrum pro kmenové buňky a regenerativní medicínu, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou, Čína;

c: Klíčová laboratoř provincie Zhejiang pro tkáňové inženýrství a regenerativní medicínu, Dr. Li Dak Sum & Yip Yio Chin, Centrum pro kmenové buňky a regenerativní medicínu, Hangzhou, Čína;

d: Centrum pro transplantaci kostní dřeně, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, Čína;

e: Ústav hematologie, Univerzita Zhejiang, Hangzhou, Čína