Studie o ochranné funkci cistanche na ledvinách: Androgen-dependentní rozdíly v množství CYP MRNA v prasečí ledvině

Androgen-dependentní rozdíly v množství CYP mRNA v ledvinách prasat

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Již dříve jsme uváděli androgen-dependentní rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množstvích mRNA izoforem CYP v prasečích játrech. Abychom objasnili, zda existují takové rozdíly mezi pohlavími a plemenyledvinajsme zkoumali množství několika CYP mRNA v ledvinách pomocí obou pohlaví 5-měsíčních prasátek Landrace, Meishan a/nebo jejich kříženců F1 (LM a ML). Byly zjištěny významné rozdíly mezi pohlavími v množství několika CYP mRNA: muž < žena="" pro="" cyp2a19="" a="" cyp3a29;="" a="" samec=""> samice pro CYP4A24/25 u všech plemen. Pohlavní rozdíly v množství mRNA CYP2B22 (samci < samice)="" a="" mrna="" cyp2c33="" a="" cyp2c49="" (samci=""> samice) byly také pozorovány u všech plemen kromě prasat Landrace. Kromě toho byl významný rozdíl mezi pohlavími (samci < samice)="" v="" mrna="" cyp3a46="" nalezen="" pouze="" u="" prasat="" lm="" a="" ml.="" u="" prasat="" landrace="" ani="" meishan="" nebyly="" nalezeny="" žádné="" významné="" rozdíly="" mezi="" pohlavími="" pro="" mrna="" cyp1a1,="" cyp1a2="" a="" cyp4b1.="" množství="" mrna="" cyp2c33="" a="" cyp4a24/25="" u="" samců="" bylo="" vyšší="" u="" prasat="" meishan="" než="" u="" prasat="" landrace.="" další="" experimenty="" s="" použitím="" prasat="" ošetřených="" kastrací="">testosteronpropionát ukázal, že rozdíly mezi pohlavími a plemenem v množství těchto CYP mRNA byly, alespoň částečně, závislé na hladinách sératestosteron. Kromě toho účinky androgenu na množství CYP mRNA v ledvinách nemusí nutně korelovat s účinky v játrech, což naznačuje, že existuje tkáňově selektivní faktor zodpovědný za expresi genů CYP související s androgeny. OchranaCistanchenaledvinyje všestranný, což se připisuje prvkům, jako je echinakosid, verbascosid, flavonoidy a celkové glykosidy fenethylalkoholu obsažené vCistanche. Cistanchemůže nejen chránitledvinypřed větším poškozením, ale také opravit stávající poškozeníledviny. Proto,Cistancheje nejčastěji používanou bylinou v receptech tradiční čínské medicíny.Cistanchemá extrémně vysokou léčivou hodnotu.

klíčová slova:testosteron; CYP;ledvina; rozdíl pohlaví; rozdíl plemene; prase;ledvinabuňka;Cistanche

Misaki Kojima a Masakuni Degawab

Jednotka živočišného genomu, Ústav pro vědu o hospodářských zvířatech a pastvinách, Národní organizace pro výzkum zemědělství a potravin (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japonsko: a bLaboratory of Molecular Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japonsko. Přijato 16. dubna 2021; přijato 19. května 2021

ÚVOD

Enzymy metabolizující léky (DME), jako jsou CYP, sulfotransferázy (SULT) a uridin-5′-difosfát (UDP)-glukuronosyltransferázy (UGT), hrají důležitou roli v metabolismu xenobiotik, včetně léků a endogenních sloučenin, jako jsou steroidní hormony a lipidy.1,2) Prasata domácí (Sus scrofa domesticus), včetně miniprasat, jsou důležitá ve farmakologických a toxikologických studiích kvůli podobnosti funkce DME mezi lidmi a prasaty, zejména CYP.3–7) Již dříve jsme uvedli pohlaví a rozdíly mezi plemeny v množství jaterních DME mRNA, včetně izoforem CYP, mezi prasaty Landrace a Meishan, a dále jsme prokázali, že hladina androgenů v séru je jedním z kritických faktorů způsobujících tyto rozdíly.8)

Cistanchetubulosabránínemoc ledvin,kliknutím sem získáte vzorek

Theledvinastejně jako játra jsou důležitou tkání odpovědnou za metabolismus a vylučování xenobiotik včetně léků a endogenních sloučenin a jsou jedním z nejčastějších cílů toxicity vyvolané léky.9,10) Bylo hlášeno, že izoformy CYP patřící mezi U prasat existují rodiny CYP1, CYP2, CYP3 a CYP4ledvina.11–15) Většina těchto izoforem CYP hraje důležitou roli v metabolismu xenobiotik a/nebo lipidů u pokusných zvířat a lidí.9,10,16,17) Dále exprese izoforem Cyp4a a Cyp4b u myšíledvinaje regulován androgeny.18–21)

V této studii jsme nejprve zkoumali rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množství mRNA CYP (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 a CYP4B1) vledvinaof Meishan, Landrace a jejich kříženci F1 prasat. Dále jsme zkoumali, zda je androgen kritickým faktorem určujícím rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množství těchto CYP mRNA u prasat.ledvinapokusy s kastrací a/nebo podávánímtestosteronpropionát (TP).

MATERIÁLY A METODY

Zvířata

Byla použita prasata Landrace, Meishan a jejich kříženci F1 (LM, samice Landrace × samec Meishan; ML, samice Meishan × samec Landrace), stejně jako prasata použitá v našich předchozích studiích.22) Stručně řečeno, prasata byla chována v Národním institutu vědy o hospodářských zvířatech a pastvinách, Tsukuba, Japonsko. Všechna prasata byla krmena komerční obilnou stravou a byla jim poskytnuta voda ad libitum. Prasata byla zabita elektrickým omráčením s následným vykrvácením mezi 10:00 a 11:00 dopolední. Někteří samci prasat Landrace a Meishan byli kastrováni ve věku 1 měsíce a usmrceni ve věku 5 měsíců. Část ledvin nebo jater z každého prasete byla rychle odebrána, zmražena v kapalném dusíku a udržována při -80 stupních až do následných analýz.

Tato studie byla schválena Výborem pro péči o zvířata Národního institutu pro vědu o hospodářských zvířatech a pastvinách (č. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Se všemi zvířaty bylo zacházeno humánně podle pokynů výboru.

Androgenní léčba

Jak je popsáno v předchozích zprávách,23,24)testosteronpropionát (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) rozpuštěný v kukuřičném oleji byl injikován intramuskulárně pětkrát v 48-hodinových intervalech do zadní nohy každého prasete v dávce 10 mg/kg tělesná hmotnost; prasata byla usmrcena 24 hodin po poslední injekci.

Množství séraTestosteron

Množství sératestosteronu jednotlivých samců prasat byla měřena pomocíTestosteronSouprava pro enzymový imunosorbentní test (ELISA) (Enzo Life Sciences Inc., NY, USA) podle pokynů výrobce, jak bylo popsáno dříve.24) Navíc byla také použita data získaná v našich předchozích studiích.24,25)

Množství CYP mRNA

Celková RNA byla připravena z jednotlivých tkání pomocí TRIzol Reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) a použita ke stanovení množství CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A4 mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1. Množství těchto mRNA bylo hodnoceno pomocí RT-PCR v reálném čase s použitím systému 7500 Real-Time PCR System a zelené hlavní směsi SYBR (PE Applied Systems, Tokyo, Japonsko), jak bylo popsáno dříve,25) kromě mRNA CYP3A. Množství mRNA CYP3A22, CYP3A29 a CYP3A46 bylo zkoumáno pomocí Eagle Taq Master Mix s ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branch burg, NJ, USA), jak bylo uvedeno dříve.22) Sady primerů a sondy TaqMan používané v současnosti studie byly stejné jako v našich předchozích studiích22,25) kromě CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 a CYP4B1, kde byly sekvence primerů následující: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (dopředu) a 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (zpět); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (vpřed) a 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (reverzní); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (vpřed) a 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (reverzní); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (dopředu) a 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (zpět). Jako vnitřní standard byl použit ribozomální protein L7 (RPL7). Množství každé cDNA bylo hodnoceno metodou relativní standardní křivky podle PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Standardní křivky pro stanovení množství mRNA CYP byly vytvořeny pomocí RT-reakční směsi s celkovou RNA z jater 5-měsíčních samic prasat Landrace nebo z ledvin 5-měsíců starých samice prasat Landrace nebo Meishan, podle účelu

Statistické analýzy

Statisticky významné rozdíly byly hodnoceny Tukeyho post hoc testem po ANOVA nebo Studentovým t-testem. Korelace mezi uvedenými parametry byly stanoveny regresní analýzou.

VÝSLEDEK

Množství CYP mRNA v ledvinách prasat Landrace a Meishan

Množství mRNA CYP byla nejprve měřena v ledvinách obou pohlaví 5-měsíčních prasat Landrace a Meishan. Pro srovnání množství každé CYP mRNA mezi ledvinami a játry bylo množství každé CYP mRNA v ledvinách vyjádřeno jako relativní poměr k odpovídajícímu množství v játrech 5-měsíčních samic prasat Landrace, a výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

U všech vyšetřovaných prasat byla množství mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1 v ledvinách mnohem vyšší než v játrech, zatímco u ostatních CYP byla opačná (tabulka 1). Kromě toho, ačkoliv mRNA CYP2E1 a CYP3A22 byly detekovány v ledvinách, tato množství byla u každého plemene nižší než jedna tisícina množství v játrech (data nejsou uvedena).

U obou plemen prasat byla množství mRNA CYP2A19 a CYP3A29 nižší u samců než u samic (tabulka 1, obr. 1). Naopak množství mRNA CYP4A24/25 u obou plemen prasat bylo významně vyšší u samců než u samic. Kromě toho u prasat Meishan byla množství mRNA CYP2C33 a CYP2C49 významně vyšší u samců než u samic. Žádné takové rozdíly mezi pohlavími v množství mRNA CYP2C33 a CYP2C49 nebyly pozorovány u prasat Landrace. U žádného z plemen prasat nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi pohlavími v množství mRNA CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 a CYP4B1, ačkoliv rozdíl mezi pohlavími v množství mRNA CYP2B22 u prasat Meishan byl podle Studentova t-testu významný. Kromě toho byla mRNA CYP3A46 detekována u obou pohlaví prasat Landrace, zatímco u obou pohlaví prasat Meishan byla pod detekčním limitem.

Breed  differences  in  the  amounts  of  several  CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those  in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29  mRNAs  were the  opposite.  A  significant  breed  difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25  mRNA  was  also  observed in  males,  but  no  such  difference  was  found in  females.  Furthermore, the  breed  differences  (Landrace >Meishan) v množstvích mRNA CYP1A1, CYP1A2 a CYP2A19 mezi prasaty Landrace a Meishan stejného pohlaví byly také pozorovány.

Vliv androgenu na genovou expresi reprezentativních pohlavně příbuzných CYP K objasnění androgenní závislosti genové exprese CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 a CYP3A29) v ledvinách byly účinky kastrace a/nebo TP léčby zkoumali pomocí 5-měsíčních prasat Meishan a Landrace (obr. 1). U kastrovaných samců obou plemen bylo množství mRNA CYP2A19 vyšší než u odpovídajících intaktních samců. Navíc léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic obou plemen prasat vedla ke snížení množství mRNA. Množství mRNA CYP2B22 a CYP3A29 se zvýšilo u kastrovaných prasat Meishan, ale nikoli u kastrovaných prasat Landrace, ve srovnání s odpovídajícími intaktními samci. Léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic obou plemen prasat vedlo ke snížení množství těchto mRNA, ačkoli nebyly pozorovány žádné významné účinky TP na mRNA CYP2B22 u kastrovaných prasat Meishan a mRNA CYP3A29 u kastrovaných prasat Landrace z důvodu velkého inter- individuální rozdíl.

Tabulka 1. Relativní množství mRNA renálních izoforem CYP u 5-měsíčních prasat Landrace a Meishan

Obr. 1. Účinky kastrace a/nebo podávání TP na množství mRNA CYP v ledvinách 5-měsíčního prasete

TP byl injikován intramuskulárně do {{0}}měsíčního kastrovaného samce a intaktní samice prasat Landrace a Meishan, jak je popsáno v části Materiály a metody. Množství každé CYP mRNA v ledvině bylo stanoveno pomocí RT-PCR v reálném čase a normalizováno na množství RPL7 jako vnitřního standardu. Standardní křivky byly vytvořeny pomocí RT-reakční směsi s celkovou RNA z ledvin 5-měsíčních samic prasat Landrace, kromě stanovení množství mRNA CYP2C49, kde byly standardní křivky vytvořeny pomocí RT-reakční směsi s celkovou RNA z ledvin 5-měsíčních samic prasat Meishan. Každý sloupec představuje průměr každé experimentální skupiny a každý sloupec představuje standardní odchylku (SD) průměru (n= 6 pro intaktní samce a samice prasat Landrace a Meishan; n= 3 pro ostatní). a,b Významné rozdíly od odpovídajících intaktních samců prasat byly hodnoceny Tukeyho post hoc testem: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,d="" významné="" rozdíly="" od="" odpovídajících="" tp="" neléčených="" prasat,="" jak="" bylo="" hodnoceno="" studentovým="" t-testem:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" čtverce="" v="" cyp2b22="" a="" cyp3a29="" označují="" prasata="" meishan="" a="" landrace,="" v="" tomto="" pořadí,="" se="">

Množství mRNA CYP2C33 se snížilo u kastrovaných prasat Meishan, ale nikoli u kastrovaných prasat Landrace, ve srovnání s odpovídajícími intaktními samci, a léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic obou plemen prasat měla za následek zvýšení množství mRNA. U prasat Meishan bylo množství mRNA CYP2C49 také sníženo kastrací a léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic vedla ke zvýšení jejího množství. Žádné takové účinky kastrace nebo léčby TP nebyly pozorovány u prasat Landrace.

Obr. 2. Účinky kastrace a/nebo podávání TP na množství mRNA CYP4A24/25 a CYP4B1 v ledvinách a játrech 5-měsíčních prasat

TP byl injikován intramuskulárně do {{{{1{13}}}}}}měsíčního kastrovaného samce a intaktní samice prasat Landrace a Meishan, jak je popsáno v části Materiály a metody. Množství každé CYP mRNA v ledvinách a játrech bylo stanoveno pomocí RT-PCR v reálném čase a normalizováno na množství RPL7 jako vnitřního standardu. Standardní křivky byly vytvořeny pomocí RT-reakční směsi s celkovou RNA z ledvin 5-měsíčních samic prasat Landrace. Každý sloupec představuje průměr v každé experimentální skupině a každý sloupec představuje SD průměru (n= 6 pro intaktní samce a samice prasat Landrace a Meishan; n= 3 pro ostatní). Významné rozdíly od odpovídajících intaktních samců prasat byly hodnoceny Tukeyho post hoc testem: ap < 0.01.="" b,c="" významné="" rozdíly="" od="" odpovídajících="" tp="" neošetřených="" prasat,="" jak="" bylo="" hodnoceno="" studentovým="" t-testem:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>

To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25  and  CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex  difference  (male >samice) v množství CYP4A24/25 mRNA je zde pozorován v ledvinách prasete (tab. 1). Proto, abychom objasnili účinky androgenu na expresi těchto mRNA v ledvinách a játrech prasat Landrace a Meishan, zkoumali jsme nejen účinky kastrace, ale také účinky léčby TP kastrovaných samců a intaktních samic ( Obr. 2). Množství CYP4A24/25 mRNA v ledvinách bylo u prasat Landrace i Meishan sníženo kastrací a léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic obou plemen prasat měla za následek zvýšení jejího množství. V játrech obou plemen prasat však nebyly pozorovány žádné takové účinky kastrace a také nebyl pozorován žádný pohlavní rozdíl v množství mRNA CYP4A24/25. Stejně tak nebyl u obou plemen prasat pozorován žádný významný vliv léčby TP na množství jaterní mRNA CYP4A24/25, ačkoli zvýšení jejího množství léčbou TP bylo pozorováno pouze u kastrovaných samců prasat Landrace. Kromě toho mRNA CYP4B1 nevykazovala žádný rozdíl mezi pohlavími v ledvinách (obr. 2 a tabulka 1) ani v játrech pro každé plemeno prasat. U obou plemen prasat se množství mRNA CYP4B1 významně nezměnilo kastrací a/nebo léčbou TP (obr. 2).

Již dříve jsme zjistili, že léčba TP vedla ke zvýšení množství mRNA CYP3A46 v játrech prasat Landrace.22) Účinky léčby TP a kastrace na množství mRNA v ledvinách byly proto dále zkoumány pomocí {{3} }měsíční prasata Landrace (obr. 1). Přestože kastrace samců neměla žádný významný vliv na množství mRNA CYP3A46 v ledvinách, léčba TP kastrovaných samců a intaktních samic vedla ke snížení množství mRNA CYP3A46. Kromě toho byla mRNA CYP3A46 pod detekčním limitem jak v ledvinách, tak v játrech všech prasat Meishan léčených kastrací a/nebo TP.22)

Genetické faktory odpovědné za expresi mRNA CYP související s pohlavím

We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and  that  the  amount  is  determined  by  autosomal  dominant  inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/ml a u 5-měsíčních samců prasat Landrace<23 ng>

In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in  females,  while  the  converse  was  observed  for  CYP2C33 and CYP4A24/25.  For CYP2C49 mRNA,  a  significant  sex  difference (males >samic) byl pozorován u ML prasat, ale nebyl pozorován žádný významný rozdíl u LM prasat kvůli značným interindividuálním rozdílům mezi samci LM prasat. mRNA CYP3A46 byla detekována u prasat LM a ML, stejně jako u prasat Landrace, a rozdíl mezi pohlavími (samci< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">

Obr. 3. Pohlavní rozdíly v množství mRNA CYP v ledvinách 5-měsíčních prasat LM a ML

Množství mRNA každého CYP v ledvině bylo stanoveno pomocí RT-PCR v reálném čase a normalizováno na množství RPL7 jako vnitřního standardu. Standardní křivky byly vytvořeny pomocí RT-reakční směsi s celkovou RNA z ledvin 5-měsíčních samic prasat Landrace, s výjimkou stanovení množství mRNA CYP2C49, kde byly standardní křivky vytvořeny pomocí RT-reakce směs s celkovou RNA z ledvin 5-měsíčních samic prasat Meishan. Každý kruh ukazuje jednotlivé prase (n= 6 a 9 pro samce a samice prasat LM, v tomto pořadí; n= 7 a 10 pro samce a samice prasat ML, v tomto pořadí). Pruh ukazuje průměr v každé skupině. a,b Významné rozdíly mezi samci a samicemi v každém plemeni byly hodnoceny Studentovým t-testem: ap < 0,05,="" bp=""><>

Vztah mezi množstvím sérového testosteronu a expresí pohlavně příbuzných CYP mRNA v ledvinách

Předpokládá se, že koncentrace sérového androgenu je jedním z kritických faktorů produkujících rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množství několika CYP mRNA v ledvinách prasat. Proto byl vztah mezi sérovou koncentrací androgenů a expresí CYP mRNA (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 a CYP4A24/25) v ledvinách dále zkoumán pomocí 1-, { {17}} a 5-měsíční prasata. Některá z 1-měsíčních prasat (nedospělých,< 10 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">

The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>Cca. 30 ng/ml) sérového testosteronu byly nízké ve srovnání s těmi u všech prasat s nízkými koncentracemi sérového testosteronu (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">

Množství mRNA CYP2C33 a CYP4A24/25 se však zvýšilo v závislosti na koncentraci testosteronu v séru u všech zkoumaných plemen prasat (obr. 5). Množství mRNA CYP2C49 se zvýšilo v závislosti na koncentraci testosteronu v séru u prasat Meishan, LM a ML, ale ne u prasat Landrace. Kromě toho bylo pozorováno malé zvýšení množství mRNA CYP2C49 u 1-měsíčních prasat Landrace a Meishan léčených TP. To naznačuje, že exprese takového účinku spojeného s TP je závislá na úrovni exprese TP-responzivního transkripčního faktoru (faktorů) pro expresi genu CYP2C49, který se účastní zrání.

DISKUSE

V této studii jsme zpočátku zjistili rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množství několika mRNA CYP v ledvinách pomocí 5-měsíčních prasat Landrace a Meishan a jejich potomků F1 (LM a ML). Následně, abychom objasnili účinek androgenu na množství renálních CYP mRNA, jsme zkoumali účinky kastrace a/nebo léčby TP na tato množství. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Analýzou těchto rozdílů mezi pohlavími a plemeny ve vztahu ke koncentraci sérového testosteronu jsme zde prokázali, že sérový testosteron je alespoň jedním z kritických faktorů, které způsobují tyto rozdíly v množství každé CYP mRNA v ledvina.

Obr. 4. Negativní korelace mezi koncentracemi testosteronu v séru a množstvím mRNA CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 a CYP3A46 v ledvinách prasat

Koncentrace testosteronu v séru a množství mRNA CYP byly měřeny tak, jak je popsáno v části Materiály a metody. Některé ze sérových koncentrací testosteronu u jednotlivých prasat byly převzaty z dříve získaných dat.24,25) Každý symbol představuje každé jednotlivé prase. Otevřené čtverce a kosočtverce, 1-měsíční samci a samice prasat Landrace a Meishan (n= 3 pro obě pohlaví prasat Landrace a Meishan); šedé čtverce, 3-měsíční samci prasat Landrace a Meishan (n= 4 pro prasata Landrace a n= 6 pro prasata Meishan); uzavřené čtverce a kosočtverce, 5-měsíční samci a samice prasat Landrace a Meishan (n{11}} pro obě pohlaví prasat Landrace a Meishan); uzavřené a otevřené trojúhelníky, 5-měsíční samci a samice prasat LM (n= 6 pro samce a n= 9 pro samice); uzavřené a otevřené obrácené trojúhelníky, 5-měsíční samci a samice prasat ML (n= 7 pro samce a n= 10 pro samice); uzavřené a otevřené kruhy, 1-měsíční samci a samice prasat Landrace a Meishan léčených TP (n= 3 pro obě pohlaví prasat Landrace a Meishan). Korelace byly zkoumány pomocí dat ze všech testovaných zvířat a stanoveny regresní analýzou, kde r je korelační koeficient.

Již dříve jsme nalezli rozdíly mezi pohlavími (muži< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">

Tabulka 2. Shrnutí androgenově závislých rozdílů mezi pohlavími a plemeny v genové expresi izoforem CYP v ledvinách prasat

These  sex  and  breed  differences  can  be  explained  by  the  differences  in  the  concentration  of  serum  testosterone  in  male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>Cca. 40 ng/ml), zatímco koncentrace prasat Landrace měly nízké koncentrace (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">Cca. 20 ng/ml sérového testosteronu, rozdíly mezi pohlavími (muž< female)  in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because  clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/ml sérového testosteronu, rozdíly mezi pohlavími v jejich množství byly pozorovány u prasat Meishan, LM a ML, ale ne u prasat Landrace. V souladu s tím se předpokládá, že takové rozdíly mezi pohlavími a plemeny jsou závislé na koncentracích testosteronu v séru. Tuto hypotézu dále podporují experimenty s použitím kastrovaných a/nebo TP-léčených prasat. Konkrétně množství těchto mRNA u kastrovaných samců (<12 ng  testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/ml při léčbě TP. V důsledku toho se u prasat léčených TP množství mRNA CYP2C33 a CYP4A24/25, CYP2C33 a CYP4A24/25 mRNA zvýšila stejně nebo více než u 5-měsíčních samců prasat Meishan a množství mRNA CYP2B22, CYP3A29 a CYP3A46 se snížily stejně jako u odpovídajících samců prasat.

Předpokládá se, že rozdíl v profilu sekrece růstového hormonu (GH) mezi samci a samicemi u mnoha zvířat, zejména u hlodavců, má za následek rozdíly mezi pohlavími v množství několika enzymů metabolizujících léky, včetně CYP, v játrech.26) Například rozdíly mezi pohlavími v množství mRNA izoforem Ugh, Sult a Cyp4a v myších játrech jsou ovlivněny sekrecí GH mužského typu a/nebo androgenem, zatímco tyto rozdíly mezi pohlavími jsou primárně regulovány androgenem v ledvinách.21,27 ,28) Navíc se navrhuje transakční lokus, nazvaný GH-dependent repression (GDR), který reguluje gen pro samičí specifickou steroidní 15 -hydroxylázu (Cyp2a4) v myších játrech,29), ale tento gen je popsán být recipročně regulován androgeny v játrech a ledvinách samců myší.30) Naopak jsme již dříve zjistili, že u prasat Landrace s rozdílem pohlaví v profilu sekrece GH31) nebyly žádné rozdíly mezi pohlavími v množství jaterní mRNA. několik izoforem CYP, SULT a UGT které vykazují rozdíly mezi pohlavími u prasat Meishan.22–25,32) Proto se předpokládá, že takové rozdíly mezi pohlavími u prasat jsou závislé hlavně na rozdílech v koncentraci testosteronu v séru. Nicméně, protože sekreční profil GH je modifikován androgenem,33–35) možnost, že změny v množství mRNA pozorované při kastraci a/nebo podání TP nastanou, alespoň částečně, prostřednictvím androgenem zprostředkované změny v GH vzorec sekrece nelze vyloučit.

Breed  differences  in  amounts  of  the  mRNAs  of  CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1  between  sex-matched  Landrace  and  Meishan  pigs  were  also  observed  in  the  kidney  (Table  1),  while  no  such  clear  breed  differences  were  observed  in  the  liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA,  individual  differences  in  each  breed  of  pig  were  observed  regardless  of  serum  testosterone  concentration,  suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig  breeds  are  not  genetically  homogeneous.  Interestingly,  CYP3A46 mRNA was  clearly  detected in  both the  kidney  and  the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in  both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was  clearly  detected  in  both  the  kidney  and  the  liver  of  LM  and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25)  is  determined  by  autosomal  dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum  testosterone (>40 ng/ml), rozdíl mezi pohlavími v množství mRNA CYP3A46 byl pozorován u prasat LM a ML, ale ne u prasat Landrace. Tato zjištění silně naznačují, že genetické (plemeno) a tkáňově selektivní faktory spolu se sérovým testosteronem se podílejí na hladinách exprese několika genů CYP souvisejících s pohlavím a plemenem. Bohužel tyto faktory zůstávají nejasné.

Na závěr zde prokazujeme, že existují rozdíly mezi pohlavími a plemeny v množstvích mRNA izoforem CYP2, CYP3 a CYP4 rodiny v ledvinách prasat, a silně naznačujeme, že tyto rozdíly jsou závislé na genetických faktorech hostitele, včetně koncentrace sérového androgenu. . Dále ukazujeme tkáňové rozdíly mezi ledvinami a játry v expresi genů CYP souvisejících s pohlavím/androgenem a silně naznačujeme, že za expresi genů CYP související s androgeny je odpovědný tkáňově selektivní faktor. V budoucnu je zapotřebí výzkum k identifikaci genetického hostitelského faktoru souvisejícího s pohlavím a tkáňově selektivního faktoru odpovědného za regulaci genů CYP. V každém případě, protože androgen je jedním z hostitelských faktorů určujících hladiny exprese několika CYP odpovědných za metabolismus léčiv, měření koncentrace testosteronu v séru se považuje za příspěvek k vývoji vhodné individuální léčby léčivy.

Poděkování

Tato práce byla částečně podpořena grantem na vědecký výzkum od Japonské společnosti na podporu vědy (č. 19K06463, MK). Autoři děkují Tsukuba Operation Unit 7, Technical Support Center of Central Region, NARO, Tsukuba, Japan za péči o zvířata a za odběr tkání.

REFERENCE

1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Metabolismus léčiv v játrech. Clin. Liver Dis., 21, 1–20 (2017).

2) Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Lidské cytochromy P450 ve zdraví a nemoci. Philos. Trans. R. Soc. Londýn. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).

3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Srovnání xenobiotika metabolizujícího lidského, prasečího, hlodavčího a rybího cytochromu P450. Toxikologie, 375, 10–27 (2017).

4) Nielsen SD, Bauhaus Y, Zamaratskaia G, Junqueira MA, Blaabjreg K, Petrat-Melin B, Young JF, Rasmussen MK. Konstitutivní exprese a aktivita cytochromu P450 u konvenčních prasat. Res. Vet. Sci., 111, 75–80 (2017).

5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotický metabolizující cytochrom P450 u prasat, slibný zvířecí model. Curr. Drug Metab., 12, 507–525 (2011).

6) Schelstraete W, Clerck LD, Govaert E, Millecam J, Devreese M, Deforce D, Bocxlaer JV, Croubels S. Charakterizace prasečího jaterního a střevního léčiva metabolizujícího CYP450: srovnání s lidskými ortology z hlediska kvantitativního, aktivního a selektivního. Sci. Rep., 9, 9233 (2019).

7) Skaanild MT. Cytochrom vepřů P450 a metabolismus. Curr. Pharm. Des., 12, 1421–1427 (2006).

8) Kojima M. Rozdíly mezi pohlavími a plemenem v konstitutivní genové expresi jaterních enzymů metabolizujících léky u prasat Meishan a Landrace: Rozdíly zprostředkované testosteronem. Jpn. Agric. Res. Q., 54, 7–12 (2020).

9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Nové modely ledvin ke zkoumání metabolismu, transportu a toxicity léčiv a xenobiotik. Drug Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).

10) Rytíři KM, Rowland A, Miners JO. Renální metabolismus léčiv u lidí: potenciál lékových a endobiotických interakcí zahrnujících cytochrom P450 (CYP) a UDP-glukuronosyltransferázu (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587-602 (2013).

11) Kojima M, Morozumi T. Klonování šesti kompletních cDNA kódujících enzymy prasečího cytochromu P450 a genová exprese těchto enzymů v játrech a ledvinách. J. Health Sci., 50, 518-529 (2004).

12) Lundell K. Klonování a exprese dvou nových hydroxyláz mastných kyselin vepřových jater a ledvin [cytochrom P450 (CYP)4A24 a CYP4A25]. Biochem. J., 363, 297-303 (2002).

13) Nannelli A, Chirulli V, Longo V, Gervasi PG. Exprese a indukce rifampicinem CAR- a PXR-regulovaných CYP2B a CYP3A v játrech, ledvinách a dýchacích cestách prasat. Toxikologie, 252, 105–112 (2008).

14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Exprese a indukovatelnost CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 a CYP3A fenobarbitalem v prasečích játrech, ledvinách, tenkém střevě a nosních tkáních. Xenobiotica, 40, 525–535 (2010).

15) Shang H, Guo K, Liu Y, Yang J, Wei H. Konstitutivní exprese mRNA CYP3A v miniaturních prasečích tkáních Bama. Gene, 524, 261–267 (2013).

16) Imaoka S, Hiroi T, Tamura Y, Yamazaki H, Shimada T, Komori M, Degawa M, Funai Y. Mutagenní aktivace 3-methoxy-4-amino azobenzenu myším ledvinovým cytochromem P450 CYP4B1: Klonování a charakterizace myšího CYP4B1. Oblouk. Biochem. Biophys., 321, 255-262 (1995).

17) Jarrar YB, Lee SJ. Molekulární funkčnost genetických polymorfismů cytochromu P450 4 (CYP4) a jejich klinické důsledky. Int. J. Mol. Sci., 20, 4274 (2019).

18) Hiratsuka M, Matsuura T, Watanabe E, Sato M, Suzuki Y. Pohlavní rozdíly v konstitutivní úrovni renálních aktivit hydroxylázy kyseliny laurové a proteinů souvisejících s CYP4A u myší. Biol. Pharm. Bull., 19, 512-517 (1996).

19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Androgen-dependentní renální mikrozomální cytochrom P-450 zodpovědný za N-hydroxylaci a mutagenní aktivaci 3-methoxy-4-aminoazobenzenu v BALB/c myš. Cancer Res., 50, 2729-2733 (1990).

20) Isern J, Meseguer A. Hormonální regulace a charakterizace 5'-lemující oblasti myšího genu Cyp4b1. Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 139-147 (2003).

21) Zhang Y, Klaassen CD. Hormonální regulace izoforem Cyp4a v myších játrech a ledvinách. Xenobiotica, 43, 1055–1063 (2013).

22) Kojima M, Degawa M. Pohlavní rozdíly v konstitutivních hladinách mRNA CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 a CYP3A46 v prasečích játrech: Srovnání mezi prasaty Meishan a Landrace. Drug Metab. Pharmacokinet., 31, 185–192 (2016).

23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Nový rozdíl související s pohlavím v konstitutivní expresi jaterních enzymů podrodiny cytochromu P4501A u prasat Meishan. Biochem. Pharmacol., 75, 1076-1082 (2008).

24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Androgenem zprostředkovaná down-regulace genů podrodiny CYP1A v prasečích játrech. J. Endocrinol., 207, 203-211 (2010).

25) Kojima M, Degawa M. Hladina androgenu v séru je určena autozomálně dominantní dědičností a reguluje geny CYP související s pohlavím u prasat. Biochem. Biophys. Res. Commun., 430, 833–838 (2013).

26) Waxman DJ, Holloway MG. Pohlavní rozdíly v expresi jaterních enzymů metabolizujících léky. Mol. Pharmacol., 76, 215-228 (2009).

27) Buckley DB, Klaassen CD. Mechanismus genderově odlišné exprese mRNA UDP glukuronosyltransferázy v myších játrech a ledvinách. Drug Metab. Dispos., 37, 834–840 (2009).

28) Alnouti Y, Klaassen CD. Mechanismy genderově specifické regulace myších sulfotransferáz (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).

29) Aida K, Negishi M. Trans-působící lokus reguluje transkripční represi genu steroidní 15 -hydroxylázy specifické pro samice u samců myší. J. Mol. Endocrinol., 11, 213-222 (1993).

30) Squires EJ, Negishi M. Reciproční regulace pohlavně závislé represe testosteron 15 -hydroxylázy (P-45015) v játrech a ledvinách samců myší androgenem. Důkaz pro jeden gen. J. Biol. Chem., 263, 4166-4171 (1988).

31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Sekreční vzory a rychlost metabolické clearance prasečího růstového hormonu u prasat vybraných pro růst. J. Anim. Sci., 66, 3068-3072 (1988).

32) Kojima M, Degawa M. Pohlavní rozdíly v konstitutivní genové expresi sulfotransferáz a UDP-glukuronosyltransferáz v prasečích játrech: Androgenem zprostředkovaná regulace. Drug Metab. Pharmacokinet., 29, 192–197 (2014).

33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Regulace sekrece GH pohlavními steroidy. Eur. J. Endocrinol., 151 (Suppl. 3), U95–U100 (2004).

34) Dubreuil P, Pelletier P, Couture Y, Lapierre H, Petitclerc D, Moris set J, Gaudreau P, Brazeau P. Kastrace a účinky testosteronu na endogenní a somatokrininem indukované uvolňování růstového hormonu u intaktních a kastrovaných samců prasat. Domest. Anim. Endocrinol., 6, 15-24 (1989).

35) Giustina A, Veldhuis JD. Patofyziologie neuroregulace sekrece růstového hormonu u pokusných zvířat a lidí. Endokr. Rev., 19, 717-797 (1998).