Studie účinků kalcitriolu proti stárnutí na lidské přirozené zabijácké buňky in vitro Ⅱ

3. Výsledky

Tato studie se zaměřila na anti-aging účinky kalcitriolu na NK buňky. Výsledky ukázaly, že kalcitriolsnížil expresi biomarkerů souvisejících se stárnutím včetně CD16, TIM3, PD-1, KIR azvýšil expresi NKG2A NK buněk. to takéinhibovala proliferaci NK buněkazatknout je ve fázi G1. kalcitriolsnižuje uvolňování zánětlivých faktorůjako IL-5, IL-13, IFN- a TNF- a měly určitéantioxidační účinky, který by mohl přispět k jehoúčinky proti stárnutí.

Klikněte sem, abyste poznali antioxidační účinky Cistanche a získali vzorek

3.1 Kalcitriol zvrátil expresi povrchových markerů stárnutí, zpomalil amplifikaci NK buněk a udržoval NK buňky ve fázi G1.

Senescentní NK buňky vykazovaly vysokou expresi biomarkerů souvisejících se stárnutím, jako je CD16, PD-1, TIM3 a KIR, a nízkou expresi NKG2A. Zjistili jsme, že hladiny exprese biomarkerů souvisejících se stárnutím NKG2A (obrázek 1a) (*P < 0.05) se zvýšily, zatímco exprese CD16 (obrázek 1b), TIM3 (obrázek 1c ), PD-1 (obrázek 1d) a KIR (obrázek 1e) (*P < 0,05) byly sníženy po léčbě kalcitriolem po dobu 72 hodin. Reverzní účinky pozitivně korelovaly s koncentrací kalcitriolu (doplňkový obrázek 1).

Expandovali jsme buňky ze vzorků lidské periferní krve in vitro. Poté jsme izolovali NK buňky (CD{0}}CD56 plus ) tříděním pomocí magnetických kuliček (obrázek 1f). Vytříděné NK buňky byly poté kultivovány s různými koncentracemi kalcitriolu nebo rapamycinu po dobu 72 hodin. Výsledky barvení CCK8 ukázaly, že rychlost růstu kalcitriolem ošetřených NK buněk s vysokou koncentrací (10- [7] M) byla pomalejší než u negativní kontrolní skupiny (NC) (*P < {{17 }}.05) (obrázek 1g). Kromě toho kalcitriol reguloval NK buněčný cyklus. Po ošetření kalcitriolem po dobu 48 hodin vykazovaly NK buňky vysoký posun závislý na koncentraci kalcitriolu směrem k G1 fázi (*P < 0,05), zatímco podíl buněk ve fázi G2 (# P < 0,05) se snížil. Podíl NK buněk ošetřených kalcitriolem v S fázi nevykazoval žádnou změnu, bez ohledu na koncentraci kalcitriolu (obrázek 1h, doplňkový obrázek 2). Poté jsme testovali, zda tato zástava fáze G1 odvozená od kalcitriolu vyvolala apoptózu NK buněk a zjistili jsme, že apoptotický biomarker NK buněk, imunoglobulin T buněk a doména inhibičního motivu na bázi tyrosinu imunoreceptoru (ITIM) (TIGIT) nevykazují žádnou významnou změnu (P > 0,05 , NS) (obrázek li). Tyto výsledky naznačují, že přidání kalcitriolu snížilo rychlost růstu NK buněk, snížilo jejich proliferaci a vyvolalo zástavu G1 fáze NK buněk namísto způsobení apoptózy.

3.2 Kalcitriol snižoval uvolňování zánětlivých cytokinů v NK buňkách a inhiboval cytotoxicitu NK buněk

Zánět je chronický zánět nízkého stupně. Urychluje stárnutí NK buněk, protože NK buňky se účastní tohoto chronického zánětu. Obrázek 2a ukazuje, že hladiny IL-5, IL-13, IFN- a TNF- významně poklesly ve všech skupinách než v negativní kontrole (*P < 0,05). IFN- a TNF- jsou dobře známé prozánětlivé cytokiny, ale některé studie také prokázaly prozánětlivé vlastnosti IL-5. Bylo hlášeno, že IL-13 přispívá k různým typům zánětů sliznic, jako je alergické astma, ulcerózní kolitida, eozinofilní ezofagitida a několik onemocnění souvisejících s fibrózou.

Cytotoxicita NK buněk však zahrnuje především uvolňování zánětlivých cytokinů a degranulaci buněk. Buňky K562 jsme označili DIO a společně kultivovali buňky DIO-K562 s NK buňkami ošetřenými kalcitriolem po dobu 4 hodin. Procento buněk DIO plus PI plus bylo nižší ve všech skupinách s poměrem efektor (E)/cíl (T) než v negativní kontrole (*P < 0.05) (obrázek 2b, C). Odvozená exprese shluku diferenciace 107 (CD107) indikovala nižší degranulaci (*P < 0,05) (obrázek 2d). Tyto výsledky ukazují inhibici funkce zabíjení NK kalcitriolem.

3.3 Kalcitriol aktivoval expresi SIRT1- ∆Exon8 a dráhu SIRT1/pERK související se stárnutím

Abychom prozkoumali účinky kalcitriolu proti stárnutí na NK buňky, detekovali jsme signální dráhy související se stárnutím pomocí imunoblotu. Byla provedena analýza westernovým přenosem, aby se vyhodnotily hladiny exprese VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 a PERK v NK buňkách ošetřených kalcitriolem. Statistická analýza ukázala, že kalcitriol aktivoval osu VDR/SIRT1/pERK při vysokých koncentracích. Mezitím kalcitriol aktivoval expresi SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Obrázek 3a).

Obrázek 1. Fenotyp související se stárnutím, buněčná expanze a analýza buněčného cyklu NK buněk. (ae) Lidské NK buňky ošetřené kalcitriolem nebo rapamycinem po dobu 72 hodin vykazovaly následující buněčné biomarkery: přirozený zabijácký člen A skupiny 2 (NKG2A), shluk diferenciace 16 (CD16), imunoglobulin T buněk a protein 3 obsahující mucinovou doménu ( TIM3) programovaná buněčná smrt-1 (PD-1) a zabíječský imunoglobulinový receptor (KIR), které souvisely se stárnutím. Jako pozitivní kontrola byl použit 50 nM rapamycin (RAPA). n=3 pro každou skupinu. *P < 0.05 a **P < 0.01 byly porovnány s negativní kontrolní skupinou (NC). (f) NK buňky (vpravo) izolované z lidských mononukleárních buněk periferní krve (PBMC, vlevo) pomocí magnetického třídění. (g) Analýza buněčné proliferace měřená soupravou pro počítání buněk 8 (CCK8). (h) Účinek kalcitriolu nebo rapamycinu na cel cyce v tříděných nk buňkách po ošetření po dobu 72 hodin, wp 0.0, 0,05 a fp < 0,05 indikovaly významné rozdíly ve fázi G1, S a G2. Všechny skupiny byly porovnány s NC, resp. n=3. ) Procento T-buněčných imunoglobulinů a NK buněk pozitivních na inhibiční motiv (M) doménu (TGI) na bázi imunoreceptorového tyrosinu po léčbě kalcitriolem nebo rapamycinem po dobu 72 hodin.*p < 0,05 a **p < 0,01 bylo porovnáno s NC. n=3.

3.4 Kalcitriol odolával stárnutí NK buněk indukovanému oxidačním stresem in vitro

Je široce přijímáno, že stárnutí je způsobeno akumulací oxidačního poškození v důsledku velkého množství důkazů nalezených v průběhu let [31]. Kultivovali jsme NK buňky s různými koncentracemi H2O2 po dobu 24 hodin a zjistili jsme, že 1{{1{{20}}}}0 μM byla nejbližší koncentrace ke střední letální dávce (LD50) (obrázek 3b) . Exprese TIM3 v populaci NK buněk se zvýšila přidáním H2O2, zatímco exprese se snížila po ošetření kalcitriolem (*P < 0,05) (obrázek 3c). Kromě toho byly stárnoucí NK buňky obarveny modře v přítomnosti -galaktosidázy. Tato modrá barva buněk je specifickým znakem senescentních buněk. Statistická analýza prokázala, že neošetřené NK buňky mají menší buněčnou galaktozidázovou aktivitu, zatímco NK buňky vystavené H2O2 vykazovaly zvýšenou galaktozidázovou aktivitu. Kalcitriol redukoval - galaktozidázu-pozitivní populaci, což ukazuje na přítomnost méně stárnoucích buněk (*P < 0,05) (obrázek 3d). Snížený potenciál mitochondriální membrány byl také pozorován u různých stárnoucích buněk z několika druhů savců. V této studii jsme hodnotili mitochondriální membránový potenciál NK buněk. Statistické výsledky ukázaly, že H202 významně snížil buněčnou aktivitu NK buněk ve srovnání s neošetřenými buňkami, zatímco kalcitriol zvýšil poškození způsobené H202 (*P < 0,05) (obrázek 3e).

Obrázek 2. Účinky kalcitriolu na funkce NK buněk. (a) Analýza cytokinu uvolněného kalcitriolem ošetřenými NK buňkami za 48 hodin. b) Výsledky fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) ukázaly mrtvé buňky K562 značené 3,3 -oktadecyl-oxakarbocyanin DlO) a propidium jodid (P). Buňky K562 byly kokultivovány s různými poměry Nk buněk ošetřených kalcitriolem na 4 h. (C) FACSanalýza mrtvých buněk K562 v testech zabíjení. (d) Degranulační účinky ošetřených Nk buněk v testech zabíjení. n=3 pro eaciyroup. *p < 0.05 a **p < 0,01 byly porovnány s NC

3.5 Kalcitriol odolával apoptóze NK buněk indukované oxidačním stresem in vitro

Dále jsme měřili počet apoptotických buněk. Výsledky průtokové cytometrie ukázaly, že ošetření 100μM H2O2 po dobu 24 hodin vedlo k významné apoptóze NK buněk. Léčba kalcitriolem však snížila apoptotický poměr (*P < 0,05) (obrázek 4a). Všechny výše uvedené výsledky prokázaly odolnost kalcitriolu proti oxidativnímu stresu způsobenému H2O2. Nicméně jsme detekovali apoptotické proteiny v NK buňkách pod oxidativním stresem. Před ošetřením H2O2 byl k NK buňkám přidán 10− [7] M kalcitriol na 24 hodin. Hladiny proteinů souvisejících s apoptózou, kaspázy-3 p17 a kaspázy-3 p20, se po léčbě H2O2 významně zvýšily. Kalcitriol snížil H2O2-odvozenou apoptózu a downreguloval expresi kaspázy-3, p17 a kaspázy-3 p20 (*P < 0,05) (obrázek 4b). Tyto výsledky ukázaly, že kalcitriol odolával apoptóze vyvolané H2O2.

Obrázek 3účinky proti stárnutíkalcitriolu na NK buňkách. (a) Exprese receptoru vitaminu D (VDR), sirtuinu 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 a kinázy endoplazmatického retikula podobné proteinkináze R (pERK) v NK buňkách byla detekována analýzou western blotting po léčbě kalcitriolem po dobu 48 hodin. Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) byla použita jako kontrola nanášení. Sloupcový diagram znázorňující výsledky Western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 a **P < 0.01 byly porovnány s NC (n=3). (b) Křivka mortality NK buněk po ošetření peroxidem vodíku (H2O2) po dobu 24 hodin. (c) Procento buněk TIM3 vykazujících vysokou expresi po ošetření 100 uM H2O2 po dobu 24 hodin. (d) Barvení a výsledky analýzy -galaktosidázou spojené se stárnutím. Senescentní buňky byly obarveny modře a označeny červenými šipkami. Měřítko, 50 μm. (e) NK buňky byly obarveny Hoechst a Chloromethyl-X-Rosaminem (CMXRos), aby se určilo umístění buněk a potenciál mitochondriální membrány. Stárnoucí a apoptotické buňky byly Hoechst plus CMXRos- a označeny bílými šipkami. Měřítko, 50 μm. Statistická analýza ukázala relativní intenzitu fluorescence. *P < 0,05 a **P < 0,01 byly porovnány se skupinou H2O2 na obrázcích C, D a E (n=3).

Obrázek 4. Antiapoptotické účinky kalcitriolu na NK buňky. (a) Antiapoptotické účinky kalcitriolu při poškození vyvolaném H2O2-. Analýza FACS ukázala procento apoptotických NK buněk po ošetření 100 μM H2O2 po dobu 24 hodin. (b) Hladiny exprese kaspázy-3 p20 a kaspázy-3 p17 v NK buňkách byly detekovány analýzou western blotting po ošetření 100 μM H2O2 po dobu 24 hodin. GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. Sloupcový diagram znázorňující výsledky Western blotting (n=3). *P < 0,05 bylo porovnáno se skupinou H2O2.

4. Diskuze

Dlouhodobá interakce mezi zánětem a oxidačním stresem je důležitým faktorem stárnutí. Zánět a oxidační stres jsou navíc synergické [32]. Přebytek ROS generovaný oxidačním stresem napadá tělesné buňky. Během tohoto procesu jsou zánětlivé faktory uvolněny aktivovaným imunitním systémem, aby zabily abnormální buňky, což vede k další tvorbě ROS. Nedostatek kalcitriolu může způsobit autoimunitní onemocnění, chronická metabolická onemocnění a nádory. Málo se však ví o účincích kalcitriolu proti stárnutí na imunitní systém, zejména na NK buňky.

V této studii jsme zkoumali účinky kalcitriolu proti stárnutí na NK buňky. Zjistili jsme, že kalcitriol zvyšuje expresi NKG2A, zatímco in vitro snižuje expresi KIR. Subpopulace NK buněk CD56− CD16 plus, o které je známo, že souvisí s chronickým zánětem, je u starších pacientů významně zvýšena [33]. Snížení exprese CD16 vyvolané kalcitriolem lze tedy připsat jeho protizánětlivému účinku. TIM-3 a PD-1 byly hlášeny jako inhibiční a depleční receptory NK buněk. Naše studie ukázala, že cal citriol downreguloval hladiny exprese TIM-3 a PD-1 a zabránil apoptóze NK buněk.

Kromě toho kalcitriol inhiboval expanzi NK buněk a udržoval populaci NK buněk ve fázi G1 in vitro. Buňky v S-fázi však nebyly ovlivněny. TIGIT, který je známý jako kontrolní faktor NK buněk, zůstal nezměněn. Tyto výsledky ukazují, že Obrázek 4. Antiapoptotické účinky kalcitriolu na NK buňky. (a) Antiapoptotické účinky kalcitriolu při poškození vyvolaném H2O2-. Analýza FACS ukázala procento apoptotických NK buněk po ošetření 100 μM H2O2 po dobu 24 hodin. (b) Hladiny exprese kaspázy-3 p20 a kaspázy-3p17 v NK buňkách byly detekovány analýzou western blotting po ošetření 100 μM H2O2 po dobu 24 hodin. GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. Sloupcový diagram znázorňující výsledky Western blotting (n=3). *P < 0,05 bylo porovnáno se skupinou H2O2. BIOENGINEERED 6851kalcitriol nevedl ke smrti NK buněk, ale pouze zpomalil rychlost expanze NK buněk.

Je dobře známo, že zánět vede k imunosenescenci [34,35]. Dále jsme zjistili, že kalcitriol snižuje hladiny IL-5, IL-13, IFN- a TNF- v NK buňkách. Cytotoxicita NK buněk je částečně zprostředkována uvolňováním zánětlivých faktorů [36]. Navíc došlo ke snížení mortality nádorových buněk K562 a degranulace NK buněk. Tyto výsledky byly v souladu s našimi očekáváními. Rapamycin je dobře známý lék, který snižuje rychlost metabolismu, aby zabránil stárnutí[37], který se v této studii používá jako pozitivní kontrola. Má za následek imunosupresi a zvyšuje potenciální riziko nádoru a nádorové zátěže. Tato zátěž byla potvrzena na myších modelech karcinomu prsu [38]. Zda kalcitriol vykazuje podobné účinky jako rapamycin, zůstává neznámé. Mělo by být provedeno více studií na zvířatech a klinických studií, aby se ověřily jejich účinky na lidský organismus.

Nakonec jsme studovali účinky kalcitriolu na antioxidační stárnutí. Resveratrol, dobře známý lék proti stárnutí, může downregulovat dráhu NF-κB aktivací osy SIRT1/PERK. Tato downregulace se také ukázala být prospěšná u neurodegenerativních poruch a kardiovaskulárních onemocnění [39]. Deacetylace SIRT1 je spojena s metabolickou kontrolou a mitochondriální biogenezí. Při tomto typu regulace mohou zvýšené hladiny SIRT1 podporovat akumulaci peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru gama koaktivátoru-1alfa (PGC-1) v jádře, což vede k transkripci genů, které jsou nezbytné pro mitochondriální funkce [40]. Kromě toho SIRT1 potlačuje savčí cíl signální dráhy rapamycinu (mTOR), který může chránit nervy a odolávat stárnutí mozku u myší [41]. V této studii jsme identifikovali podobnou regulační dráhu pro kalcitriol. Kalcitriol aktivoval SIRT1 přes VDR a zvedl osu SIRT1/pERK.

Kromě toho jsme zjistili, že kalcitriol upreguloval expresi SIRT1-∆Exon8. Stresy jsou známé jako up-regulační faktor SIRT1-∆Exon8. Ačkoli SIRT1-∆Exon8 sám o sobě vykazuje sníženou deacetylační aktivitu p53, vykazuje aditivní deacetylační účinek na p53, když je exprimován společně s SIRT1 plné délky [42]. Tento účinek indikoval antiapoptotické působení kalcitriolu na NK buňky. Úlohu SIRT1-∆Exonu8 v drahách souvisejících s věkem je však třeba lépe pochopit. Vzhledem k tomu, že pokles SIRT1 může být způsoben oxidačním poškozením [43], vytvořili jsme in vitro model akutně stárnoucích NK buněk pomocí H2O2. Oxidační stárnutí vyvolané H2O2 zvýšilo expresi TIM3 a také aktivitu -galaktosidázy v NK buňkách. Zjistili jsme, že kalcitriol odolává oxidativnímu poškození a udržuje mitochondriální aktivitu a buněčnou životaschopnost NK buněk a zároveň brání buněčné apoptóze. Kalcitriol však dosud nebyl identifikován jako lék proti stárnutí v klinické medicíně, protože je zapotřebí více důkazů o účincích tohoto léku proti stárnutí in vivo. V souhrnu jsme poskytli předběžné důkazy, které implikují účinky kalcitriolu proti stárnutí na NK buňky in vitro. Domníváme se, že účinky tohoto léku by měly být dále prozkoumány v budoucích studiích na zvířatech a klinických studiích.

5. Závěr

V této studii jsme prokázaliúčinky proti stárnutíkalcitriolu na NK buňkách. Kalcitriol zvrátil výrazbiomarkery stárnutína NK buňkách. Zpomalilo amplifikaci NK a udrželo je v G1 fázi. Kromě toho kalcitriol inhiboval uvolňování zánětlivých cytokinů a down-reguloval degranulaci NK buněk. Aktivace osy SIRT1-∆Exon8 a VDR/SIRT1/pERK kalcitriolem může být hlavním mechanismem anti-aging efektu kalcitriolu na základě výše uvedeného. Nakonec kalcitriol odolal oxidativnímu stárnutí NK buněk in vitro. Další studie by se měly zaměřit na výzkum na zvířatech a klinický výzkum.

Zvýraznění

(1) Kalcitriol snížil expresi biomarkerů souvisejících se stárnutím včetně CD16, TIM3, PD-1, KIR a zvýšil expresi NKG2A NK buněk. (2) Kalcitriol byl schopen inhibovat proliferaci NK buněk a zastavit je ve fázi G1. (3) Kalcitriol snižoval uvolňování hlavních zánětlivých faktorů, jako je IL-5, IL{10}}, IFN- a TNF- NK buněk.(4) Účinek kalcitriolu proti stárnutí na NK buňky může lze dosáhnout prostřednictvím signální cesty Sirt1- pERK.

Poděkování Rádi bychom poděkovali všem zaměstnancům naší skupiny za jejich podporu a výboru Shenzhen Science and Technology Innovation Committee za finanční podporu této studie.

Financování Tato práce byla finančně podpořena Výborem pro inovaci vědy a technologie v Shenzhenu (JCYJ20170412155231633), Fondem výstavby klíčových lékařských disciplín v Shenzhenu (č. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech a Sanming Project of Medicine v Shenzhenu (č. SZSM1020); Shenzhen Science and Technology Innovation Committee [JCYJ20170412155231633]; Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [č. SZXK062]; Sanming Project of Medicine v Shenzhenu [č. SZSM202011010].

Etické schválení Všechny postupy byly schváleny etickou komisí Shenzhen Luohu People's Hospital (ZLNK 12/2019, Shenzhen, Čína). Byl získán informovaný souhlas pro experimentování s lidskými vzorky.

Prohlášení o zveřejnění Všichni autoři schválili předložení tohoto rukopisu. Autoři prohlašují, že nemají žádné známé konkurenční finanční zájmy nebo osobní vztahy, které by mohly ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.

Reference

[1] Ovadya Y, Landsberger T, Leins H a kol. Narušený imunitní dohled urychluje hromadění senescentních buněk a stárnutí. Nat Commun. 2018;9 (1):5435.

[2] López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, et al. Charakteristické znaky stárnutí. Buňka. 2013;153:1194–1217.

[3] Hodgins JJ, Khan ST, Park MM a kol. Killers 2.0: Terapie NK buňkami v popředí kontroly rakoviny. J Clin Invest. 2019;129(9):3499–3510.

[4] Zhu H, Blum RH, Bjordahl R, et al. Pluripotentní NK buňky odvozené z kmenových buněk s vysoce afinitním neštěpitelným CD16a zprostředkovávají zlepšenou protinádorovou aktivitu. Krev. 2020;135(6):399–410.

[5] Mandal A, Viswanathan C. Přirozené zabíječské buňky: ve zdraví a nemoci. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2015;8(2):47–55.

[6] Le Garff-Tavernier M, et al. Lidské NK buňky vykazují hlavní fenotypové a funkční změny v průběhu života. Stárnoucí buňka. 2010;9(4):527–535.

[7] Le Garff-Tavernier M, Béziat V, Decocq J, et al. Vzorce exprese NKG2A, KIR a CD57 definují proces diferenciace CD56dim NK-buněk oddělený od vzdělávání NK-buněk. Krev. 2010;116 (19):3853–3864.

[8] Manser AR, Uhrberg M. Změny související s věkem v repertoáru přirozených zabíječských buněk: dopad na funkci NK buněk a imunitní dohled. Cancer Immunol Immunother. 2016;65(4):417–426. [9] Bi J, Tian Z. NK Cell Exhaustion. Front Immunol. 2017;8:760.

[10] Furman D, Campisi J, Verdin E, et al. Chronický zánět v etiologii onemocnění v průběhu života. Nat Med. 2019;25(12):1822–1832.

[11] Liu Y, a kol. Protilátka specifická pro peptid cytomegaloviru mění homeostázu přirozených zabíječských buněk a je sdílena u několika autoimunitních onemocnění. Buněčný hostitelský mikrob. 2016;19(3):400–408.

[12] Campus X, Pera A, Solana R, et al. NK buňky u zdravého stárnutí a nemocí souvisejících s věkem. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:195956.

[13] Liu Y, Mu R, Gao YP a kol. Vliv stárnutí na populaci nk buněk a jejich proliferaci v podmínkách ex vivo kultivace. Pathol análních buněk (Amst). 2018;2018:7871814.

[14] Sintov AC, Yarmolinsky L, Dahan A, et al. Farmakologické účinky vitaminu D a jeho analogů: nejnovější vývoj. Drug Discov Dnes. 2014;19 (11):1769–1774. [15] Halicka HD, Zhao H, Li J, et al. Útlum signalizace konstitutivního poškození DNA tím

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950