Časoprostorová regulace signalizace sirovodíku v ledvinách

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

A B S T R A C T

Sirovodík (H2S) byl dlouho uznáván jako hnilobný, toxický plyn. V důsledku intenzivního biochemického výzkumu v posledních dvou desetiletích je však H2S nyní považován za třetí plynový přenašeč vedle oxidu dusnatého (NO) a oxidu uhelnatého (CO) v savčích systémech. Enzymy produkující H2S jsou exprimovány ve všech orgánech a hrají důležitou roli v jejich fyziologii. VledvinaH2S je kritickým regulátorem vaskulární a buněčné funkce, ačkoli mechanismy, které ovlivňují (sub)celulární hladiny HS, nejsou přesně známy. H2S moduluje systémový a renální průtok krve, rychlost glomerulární filtrace a osu renin-angiotensin prostřednictvím přímé inhibice syntézy oxidu dusnatého. Dále H2S ovlivňuje buněčnou funkci modulací aktivity proteinu prostřednictvím posttranslační modifikace proteinu: proces nazývaný persulfidace. Persulfidace moduluje proteinovou aktivitu, lokalizaci proteinu a interakce protein-protein. Dodatečně,akutní poškození ledvin(AKD v důsledku mitochondriální dysfunkce, ke které dochází během hypoxie nebo ischemicko-reperfuze (IR), je tlumena H2S. H2S zvyšuje produkci ATP, zabraňuje poškození způsobenému volnými radikály a reguluje stres endoplazmatického retikula během IR. V tomto přehledu diskutujeme současné poznatky o (sub)celulární regulaci anabolismu, retence a katabolismu H2S s významem pro časoprostorovou regulaci hladin H2S v ledvinách. Společně je H2S všestranným gasotransmiterem s pleiotropními účinky nafunkce ledvina nabízí ochranu proti AKI. Odhalení mechanismů, které modulují (sub)celulární signalizaci H2S nejen rozšiřuje základní pohled na regulaci funkčních účinků zprostředkovaných H2S, ale může také poskytnout nové terapeutické cíle k prevenci poškození ledvin v důsledku hypoxického nebo ischemického poškození.

Klíčová slova: Sirovodík Gasotransmiter Persulfidace ledvin Ischemicko-reperfuzní poškození Hypoxie

Kliknutím získáte další informace

1. Úvod

Representing the simplest sulfur-containing molecule, hydrogen sulfide(HS)-also known as sulfane(according to recent nomenclature)[1]-is a flammable colorless gas that has been mainly recognized as a toxic compound. Toxicity occurs already at low concentrations, upon prolonged exposure to concentrations above 2-5 parts per million or acute exposure to 100 parts per million or higher. The major toxicity of H2S occurs through inhibition of mitochondrial cytochrome c oxidase, leading to metabolic acidosis associated with cardiovascular and respiratory collapse and sudden loss of consciousness [2]. Endogenous H2S synthesis in mammalian cells, however, produces much lower, non-toxic concentrations and is recognized to have important physiological functions. H2S is enzymatically synthesized by cystathionine-β-synthase (CBS)[3], cystathionine Y-lyase(CSE), 3-mercaptopyruvate sulfur-transferase (3-MST), and indirectly by p-amino acid oxidase (DAO)[3-5]. Following nitric oxide (NO) and carbon monoxide(CO), H2S was recently recognized as the third gasotransmitter: signaling molecules that can freely diffuse through membranes to transmit information [5-8]. Given the pleiotropic effect of H>Na různých kritických fyziologických drahách je časoprostorová regulace HS prvořadá, aby byla umožněna buněčná cílová specificita [9].

H2S hraje důležitou roli ve fyziologii ledvin modulací renálního průtoku krve, endokrinní funkce a metabolismu. Za prvé, na koncentraci mají hlavní vliv vazoaktivní vlastnosti HSledvinovéprůtok krve [10,11]. Kromě toho H2S ovlivňuje renální endokrinní funkci prostřednictvím regulace hladin receptorů reninu a angiotenzinu I a indukcí uvolňování norepinefrinu a aldosteronu, jak bylo prokázáno na myším modelu srdečního selhání [12]. Dále může H2S zmírnit ischemické/reperfuzní poškození snížením oxidačního stresu, což je ilustrováno pozorováním, že myši postrádající buď CBS, CSE nebo 3-MST mají výrazně sníženou odolnost vůči ischemickému/reperfuznímu poškození v několika orgánech [ 13-15]. Zdá se tedy, že přísná regulace endogenního H2S je kritická pro udržení renální homeostázy prostřednictvím různých mechanismů, které ovlivňují jak filtrační, endokrinní, tak metabolické funkceledvina. Této specifické časoprostorové regulace renální H2S signalizace je dosaženo regulací dostupnosti substrátu a kofaktoru a také modulací hladin, enzymatické aktivity a lokalizace enzymů produkujících H2S. V ledvinách je H2S primárně syntetizován CBS a CSE. Zatímco CBS i CSE jsou exprimovány převážně v proximálních tubulech [16,17], CSE je také exprimován v glomerulu [18,19]. Ve srovnání s CBS a CSE jsou hladiny 3-MST a DAO v ledvinách mnohem nižší a jejich přesná role ve fyziologii ledvin zůstává nejasná [20,21].

V tomto přehledu popisujeme (sub)celulární a časovou regulaci H2S v ledvinách a jak H2S uplatňuje své účinky v různých organelách, jako je jádro, ER a mitochondrie. Kromě toho uvádíme, jak subcelulární HS anabolismus a katabolismus ovlivnily renální (pato)fyziologii. Kromě toho je velkým příslibem posttranslační modifikace proteinových cysteinových zbytků persulfidací pro vysvětlení prospěšných vlastností H2S s potenciálním významem pro léčbu onemocnění souvisejících s ledvinami, jako je hypertenze, ischemie/reperfuze a dalšíakutní poškození ledvin. Proto modulace hladin, enzymatická aktivita nebo lokalizace enzymů produkujících H2S by mohly být farmakologicky využitelnými cíli k modulaci endogenních hladin H2S.

2. Regulace výroby H2S

2.1. Lokalizace subcelulárního enzymu ovlivňuje prostorovou specificitu hladin H2S

One mode of regulation of H2S signaling specificity consists of the multiple H2S-producing enzymes that have both unique as well as redundant functions. Regulation of H2S production on the organelle level is achieved by (trans)localization of the H2S-producing enzymes in the cell. Natively, CBS and CSE reside mostly in the cytosol, while 3-MST mostly resides in the mitochondrion. The translocation of these enzymes into different organelles allows for subcellular control of H2S levels, as each enzyme has specific cellular localization signals and cues. CBS has a C-terminal mitochondrial targeting sequence which is recognized by Hsp70 under hypoxic conditions, while CSE requires the mitochondrial outer membrane transporter protein Tom20 to translocate to the mitochondrial lumen upon treatment with the ionophore calcimycin [22,23]. Specificity is also achieved by differences in the optimal pH of the H2S synthesizing enzymes. The optimal pH for H2S production by CBS and CSE is pH8.5-9.0 [24,25], which is closer to the slightly alkaline pH of 8.0 within the lumen of the mitochondria as compared to the pH of 7.0-7.4 of the cytosol [26]. The optimal pH for H2S production by3-MST is 7.4 [27], close to the pH of the cytosol. The optimal pH for H>Produkce prekurzoru S pomocí DAO je 8,4 pro L-cystein jako substrát, ale 7,4 pro D-cystein jako substrát. CBS a CSE jsou lokalizovány primárně v cytosolu, ale také ve vezikulách, jadérkách [28] a mitochondriích.3-MST je

Lokalizováno v mitochondriích [29] a v cytosolu [30]. A konečně, DAO – přispívá k produkci H2S prostřednictvím 3-MST – je lokalizován v mitochondriích a peroxisomech [21,31]. Společně nejen dostupnost substrátu, produkce enzymu a translokace, ale také lokální pH a substrátově specifické pHoptima ovlivňují enzymatickou aktivitu a následně hladiny H2S.

2.2. Produkce H2S je regulována dostupností substrátu a kofaktoru

Spatiotemporal regulation of H2S is also achieved by modulating substrate availability for H.S production, of which the most important are L-cysteine, L-homocysteine, and 3-mercaptopyruvate, and to a lesser extent i-cystine and D-cysteine [32]. The canonical pathways of H>S syntéza je znázorněna na obr. 1 s L-cysteinem a L-homocysteinem jako hlavními substráty pro CBS a CSE. Intracelulární koncentrace L-cysteinu je řízena řadou nezávislých procesů: vychytáváním z plazmy v endoteliálních buňkách, proteolýzou (zvýšení dostupnosti L-cysteinu), transsulfurační cestou (L-cystein jako substrát pro syntézu H2S) a rychlostí inkorporace do glutathionu (snížení nebo pozastavení dostupnosti L-cysteinu)[33]. L-cystin je vychytáván prostřednictvím glutamát/cystinového antiporteru, který je pod pozitivní kontrolou H2S, což tvoří pozitivní zpětnovazební smyčku pro produkci H2S [34]. Kyselina dihydrolipoová (DHLA) je silný antioxidant odvozený z dietní kyseliny lipoové (LA), u které bylo prokázáno, že snížením L-cystinu uvolňuje volný L-cystein [35], který se používá k produkci H2S. Intracelulární koncentrace L-homocysteinu dosud nebyla stanovena, pravděpodobně proto, že se jedná o toxický meziprodukt, který CBS efektivně spotřebovává, nebo proto, že koncentrace je pod detekčními limity současných analytických metod. p-cystein potřebný pro DAO pochází především z metabolismu živin v gastrointestinálním traktu [21]. CBS a CSE vyžadují kofaktor pyridoxal-5-fosfát (PLP), také známý jako vitamin B6, k produkci H2S.H2S pomocí 3-MST v závislosti na thioredoxinu (Trx) a kyselině dihydrolipoové: dvě důležité redoxní rovnováhy -udržovací molekuly[36]. Exprese Trx je zase regulována transkripčními faktory zapojenými do antioxidační odpovědi, jako je Nrf2 [37]. Systémy, které regulují dostupnost substrátu a kofaktoru, jsou složité, s pozitivními a negativními zpětnovazebními smyčkami a jsou spojeny s udržováním redoxní rovnováhy. Substrát, dostupnost kofaktoru a množství enzymu produkujícího H2S tedy řídí anabolismus HS.

2.3. Clearance H2S je dosažena enzymaticky i neenzymaticky

While substrate availability, enzyme levels, and subcellular localization contribute to spatiotemporal regulation of local H>Hladiny S prostřednictvím ovlivnění jeho syntézy, katabolismu, výdechu a vylučování regulují snižování hladin H2S. Výdech účty za<1% of="" h="">Eliminace S v těle, protože vylučování je hlavní cestou zodpovědnou za clearance HS [38]. Než může být H2S vylučován, musí být nejprve metabolicky přeměněn. Katabolismus H2S probíhá enzymaticky i neenzymaticky, z toho enzymatický katabolismus představuje nejdůležitější katabolickou cestu [3]. V mitochondriích je HS katabolizována systémem sulfid-chinonoxidoreduktázy (SQR) za vzniku cysteinpersulfidů vázaných na SQR [39,40]. Cystein persulfid vázaný na SQR je pak katabolizován na thiosulfát, který je reverzibilní a nabízí endogenní donorový pool schopný zmírnit hypertenzní renální onemocnění a diabetes [41,42]. Kromě toho je cystein persulfid vázaný na SQR katabolizován na siřičitan a sulfát, které jsou vylučovány močí. H2S je katabolizován na sulfit prostřednictvím proteinu ethylmalonové encefalopatie 1 (ETHE1), který sídlí v mitochondriální matrix [43]. Postupná metylace H2S thiol-S-methyltransferázou (TMT) a thioether-S-methyltransferázou (TEMT) tvoří trimethylsulfoniový iont, který je rovněž vylučován močí [44]. Nakonec se H2S váže na methemoglobin za vzniku sulfhemoglobinu v erytrocytech, které působí jako jímka H2S po sekvestraci erytrocytů do sleziny[45].

2.4. Meziprodukty metabolismu H2S umožňují zpožděnou signalizaci H2S skladováním a uvolňováním

Metabolismus H2S není vždy jednosměrný, protože určité katabolické meziprodukty umožňují pozastavené uvolňování H2S. Dosud byly navrženy tři různé pooly H2S: sulfansírové druhy, kysele labilní H2S

a polysulfidy. Za prvé, H2S může být skladován ve formě sulfátových sloučenin síry: sloučeniny, které obsahují atom síry se šesti valenčními elektrony, které jsou vázány na další dva nebo více atomů síry (RS-Sn-SR), jako jsou: persulfidy (RSSH), polythionáty (-SO3-Sn-SO3), organické polysulfany (HSSnSH, RSSS, R, RSSnSH) a thiosíran (S2O3-/-s-SO3)[5]. H2S ze sloučenin sulfansíry se může uvolňovat za redukčních podmínek nebo aktivitou thioredoxin/thioredoxin reduktázy, která je klíčovým hráčem v katabolismu nebo sulfansíry, většinou inkorporované do proteinových persulfidů [46,47]. Jediným enzymem, o kterém se uvádí, že produkuje sloučeniny sulfansíry z HS, je 3-MST, ale mechanismus zůstává neznámý [48,49]. Stejně jako HS mají druhy sulfansíry také silné antioxidační kapacity [50], což přispívá k prodlouženému cytoprotektivnímu účinku produkce H2S a sulfansíry pomocí 3-MST. Za druhé, H2S může být skladován ve formě acidolabilní síry, která se může uvolňovat za kyselých podmínek (pH<5.4), usually="" in="" the="" iron-sulfur="" center="" of="" mitochondrial="" enzymes="" [51,52].="" third,="" h="">S může být také skladován ve formě polysulfidů, což umožňují enzymy 3-MST a cysteinaminotransferáza (CAT)[53]. Zpožděné signalizace H2S je dosaženo uvolněním ze zásob H2S za specifických redoxních podmínek. Společně je anabolismus H2S přísně kontrolován lokalizací enzymu, substrátovou specifitou a optimálními hladinami pH, zatímco enzymatický a neenzymatický metabolismus H2S vede k funkčním meziproduktům a nakonec k vylučování derivátů H2S.

2.5. H2S signalizace ve fyziologii ledvin

2.5.1. Vazoaktivní účinky H2S ovlivňují systémový krevní tlak a průtok krve ledvinami

Produkce HS v endoteliálních buňkách řídí hormetické (tj. dvoufázové) vazoaktivní účinky závislé na dávce tím, že ovlivňuje endoteliální a vazomotorickou funkci. Endogenní H2S v endoteliálních buňkách je produkován CSE[54], 3-MST[55] a CBS [56] a vede k endogenním koncentracím H2S v arteriální krvi v rozmezí 0.{{{{101} 8}}.0 μM【57,58]. V krátkodobých experimentech vyvolává exogenní podávání NaHS vazodilataci v izolovaných lidských mezenterických tepnách a hrudní aortě potkana [59,60]. U potkanů ​​bolusová injekce H2S přechodně snížila krevní tlak, což ukazuje na vazodilataci. U myší s knockoutem CSE byl pozorován zvýšený krevní tlak ve srovnání s myšmi divokého typu, což ukazuje na nedostatek vazodilatace zprostředkované H2S [54]. Naopak, výsledky nedávné studie ukázaly nepřítomnost hypertenze zprostředkované H2S u CSE-/myši, stejně jako zvýšenou hladinu endogenního NO ve srovnání se zvířaty divokého typu CSE. Toto pozorování zdůrazňuje přímou chemickou reakci mezi H2S a NOWHERE NO nereaguje s H2S a také jejich vzájemný příspěvek k regulaci vaskulárního tonu [61].

Podání NaHS, dárce H2S in vivo, vedlo ke zvýšení krevního tlaku při 10 μmolkg-'min-1, zatímco 25 μmol kg-Imin-1 NaHS vedlo ke snížení krevního tlaku [62]. To demonstruje hormetické účinky H2S, pravděpodobně prostřednictvím inhibice endoteliální NO syntázy [62].

Tubulární funkce je regulována H2S prostřednictvím modulace renálního průtoku krve (RBF) a následně rychlosti glomerulární filtrace (GFR). Zvýšení tubulárních hladin H2S stimuluje diurézu, natriurézu a kaliurézu inhibicí kotransportéru Na*/K'/2Cl (NKCC) u potkanů ​​chronicky zatížených solí [63,64]. Jak HS donor NaHS, tak H,S prekurzor L-cystein zvyšují GFR v závislosti na dávce u potkanů, což bylo zrušeno současnou inhibicí CBS a CSE. Inhibice samotného CBS i CSE (pomocí AOAA a PPG) má za následek snížení hladin HS a snížení tubulární funkce [63]. Je zajímavé, že u myší s akutní bilaterální ischemií ledvin přidání NaHS urychlilo regeneraci poškozených tubulárních buněk, zatímco podávání PPG zpomalilo jejich regeneraci [65]. Tvorba endogenního H2S v renálních endoteliálních buňkách tedy vede ke snížení krevního tlaku, zatímco zvyšuje rychlost glomerulární filtrace a tubulární funkci.

2.5.2. Modulace genové exprese pomocí H2S je relevantní pro regulaci krevního tlaku

Model spontánně hypertenzního potkana (SHR) byl vyvinut selektivním šlechtěním přirozeně hypertenzních potkanů ​​[66]. Nástup hypertenze je spojen se sníženou aktivitou CSE v tepnách, jak bylo prokázáno na hrudní aortě [67]. Plazmatické hladiny HS jsou dále sníženy před nástupem hypertenze, zatímco podávání NaHS (částečně) zabraňuje vzniku hypertenze [68]. Protože nízké hladiny endogenního H2S indukují vazodilataci a nedostatek CSE je spojen s hypertenzí u myší, je pravděpodobné, že snížené hladiny H2S hrají roli v patofyziologii hypertenze v modelu SHR. Kromě toho podávání NaHS v modelu SHR snižuje expresi důležitých složek systému RAS, včetně reninu (Ren), angiotenzinogenu (Agt), enzymu konvertujícího angiotenzin (ace) a receptoru angiotenzinu II, typu 1a (Agtrla). na hladiny nižší než hladiny pozorované u normotenzních kontrolních potkanů ​​[69]. Podobně podávání NaHS snižuje expresi Ren a snižuje hladiny reninu v plazmě u potkaního modelu hypertenze se dvěma ledvinami a jedním klipem (2K1C) [70]. V modelu 2K1Crat je hypertenze vyvolána dočasným omezením průtoku krve na jedenledvina, který aktivuje osu renin-angiotenzin a indukuje hypertenzi [71]. Na myším modelu hypertenze indukované léčbou angiotensinem II jsou snížené hladiny miR-129 (epigenetický regulátor) spojeny se zánětlivou odpovědí [72 ]. Léčba pomocí GYY4137 (molekula uvolňující H2S) obnovila expresi miR-129 na normální úroveň, a tím zmírnila zánět ledvin. Změny genové exprese jsou potenciálně řízeny epigenetickou regulací H2S. Matky potkanů ​​s hypertenzí léčené NaHS produkují potomky se zvýšenou metylací Agtrlb (receptor angiotensinu I, typ 1b) a sníženými hladinami receptoru angiotenzinu II AT1R [73]. H2S tedy ovlivňuje expresi genů (například Ren, Agt a Agtrla), které hrají zásadní roli v regulaci krevního tlaku, která je potenciálně zprostředkována epigenetickou regulací, stejně jako expresí miRNA.

2.5.3. H2S chrání před poškozením ledvin persulfidací proteinů

Persulfidace, také známá jako "S-sulfhydryl", představuje oxidační modifikaci cysteinové sulfhydrylové skupiny, kde je další thiolová skupina (pocházející z H2S, H2S donorů nebo jiného persulfidu) kovalentně připojena k odpovídající cysteinové sulfhydrylové skupině, která nakonec tvoří persulfid [ 5,74] (obr. 2). Persulfidace modifikuje funkci proteinu a mění interakce protein-protein. Za prvé, persulfidace může buď zvýšit nebo snížit funkci a aktivitu cílových proteinů. Persulfidace cysteinového zbytku C150 mitochondriální glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDHD, zvyšuje její enzymatickou aktivitu [74], zatímco persulfidace na C156 nebo C152 vede k hlubokému snížení aktivity [75]. Za druhé, persulfidace může také změnit protein-protein vazebná kinetika a tím i lokalizace proteinu, jako je tomu u transkripčního faktoru Nrf2.. Persulfidace C150 cytosolického Keapl iniciuje disociaci navázaného transkripčního faktoru Nrf2 a umožňuje translokaci Nrf2 do jádra a zesílení exprese genů kódujících proteinyantioxidantstresová reakce [76]. Nrf2 byl zapojen do ochranyporanění ledvinpo experimentálním IR v několika studiích [77,78]. Konečně persulfidace také chrání proteiny před škodlivými posttranslačními modifikacemi, jako je S-nitrosylace nebo oxidace během podmínek nitrosativního a/nebo oxidačního stresu [79]. K persulfidaci většinou dochází na proteinových cysteinových zbytcích, chránící tuto část před oxidací ROS, čímž chrání funkci proteinu. S-nitrosylace GAPDH na výše uvedeném C150 nuluje enzymatickou aktivitu, což vede k výraznému poklesu produkce ATP [80]. Persulfidací GAPDH, ale také ATP5a, může H2S zachránit produkci ATP. Je známo, že u AKI je udržení produkce ATP klíčové pro správnou obnovu funkce ledvin [81]. H2S společně zajišťuje funkci ledvin po poranění persulfidací proteinů (viz obr. 3).

2.5.4. H2S moduluje redoxní homeostázu, vylučování sodíku a krevní tlak prostřednictvím persulfidace proteinů

V ledvinách persulfidace proteinů reguluje krevní tlak a ledvinové zacházení se sodíkem. Persulfidace cysteinových zbytků receptoru endoteliálního růstového faktoru (EGFR) C797/C798 indukuje endocytózu Nat/K plus -ATPázy, což vede ke ztrátě funkce Na plus /K plus -ATPázy v renálních tubulárních epiteliálních buňkách [64]. Prostřednictvím těchto mechanismů H2S indukuje vylučování vody a sodíku u potkanů, čímž snižuje krevní tlak [64]. Dále persulfidace receptoru angiotenzinu II, AT1R, NaHS nebo L-cysteinem zmírňuje hypertenzi u hypertenzních myší indukovaných angiotensinem I [82]. Persulfidace proteinů indukovaná H2S tedy ovlivňuje aktivitu proteinu, ale může také modulovat genovou expresi ovlivněním interakcí protein-protein a exprese miRNA. Čistý účinek těchto vrstev signalizace je nejasný, ale je nezbytný pro udržení redoxní homeostázy a také pro regulaci renální manipulace se sodíkem a krevního tlaku.

2.5.5. HS udržuje buněčnou homeostázu po proteotoxickém stresu modulací autofagie

Chybně složené proteiny jsou potenciálně toxické v důsledku ER stresu a nadměrné buněčné smrti, jako je tomu v případě akutního poškození ledvin [83]. Poškozené organely a špatně složené proteiny jsou odstraněny (makro)autofagií, která je modulována H2S. Exogenní H2S (NaHS) inhibuje autofagii v kardiomyocytech neonatálních potkanů ​​v modelu hypoxie-reoxygenace (HR) in vitro prostřednictvím signalizace PI3K/GSK3 [84] a také v buňkách hepatocelulárního karcinomu (HCC), jak ukazuje downregulace genů v PI3K cesta /AKT/mTOR[85]. Naproti tomu v krysím modelu ischemie-reperfuze (IR) přídavek NaHS upreguluje geny v dráze AMPK/mTOR, čímž podporuje autofagii a chrání před poškozením IR [85,86]. Lze si představit, že za normálních okolností udržuje signalizace H2S rychlost autofagie ve fyziologických mezích, zatímco za okolností těžkého proteotoxického stresu může H2S vysoce zvýšit autofagický tok. Tím, že H2S signalizace chrání buňky před poškozením IR prostřednictvím modulace autofagie, zmírňuje poškození ledvin po IR.

2.5.6. H2S tlumí proteotoxický stres persulfidací proteinů

The endoplasmic reticulum (ER)is indispensable for synthesis, folding, post-translational modification, and transport of proteins, and is the first line of defense in protein folding defects [87]. In addition to regulating autophagy, H2S can both induce and inhibit proteasomal degradation of proteins to attenuateproteotoxic stress in response to a sustained unfolded protein response(UPR). The proteasome selectively degrades misfolded,ubiquitin-tagged proteins, with Nrf2 as a regulator of the UPR [88,89]. Treatment with Na2S partly rescues ischemia-induced heart failure in wild-type mice, but not in mice lacking Nrf2. Presumably, the effects of Naz are mediated by inducing translocation of Nrf2 after persulfidation of Keapl, as described above [76]. Thus, H>S enhances cardiac proteasome activity and thereby attenuates ER stress with cytoprotective effects [90]. On the other hand, in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), H2S prevents the proteasomal degradation of eNOS via persulfidation of eNOS [91]. Notably, proteotoxic stress upregulates CSE at low concentrations of doxorubicin and H2O, in H9c2 myoblasts, while the expression of CSE decreases upon exposure to higher concentrations of doxorubicin and H2O2. The addition of NaHS, but also N-acetylcysteine (NAC), rescues cell viability and diminishes ROS accumulation through rescuing CSE expression and H2S production [92]. In line with these results, the addition of NaHS reduced proteotoxic stress-induced by formaldehyde in PC12 cells, but also in nucleus pulposus(NP)cells challenged with IL-1β [93]. Thus, H>S je schopen zlepšit celý systém proteasomální degradace, ale zároveň zabraňuje tomu, aby byly specifické proteiny degradovány stejným systémem proteasomální degradace. Kromě modulační autofagie a proteazomové aktivity snižuje H2S proteotoxický stres upregulací ochranných signálních cest persulfidací specifických transkripčních faktorů.

2.5.7. H2S tlumí proteotoxický stres persulfidací epigenetických modifikátorů a transkripčních faktorů

Přidání NaHS snižuje proteotoxický stres a zachraňuje životaschopnost buněk pravděpodobně prostřednictvím upregulace regulátoru informací typu tichého páření 2 homolog 1 (SIRT-1)[94]. Ke zvýšené aktivitě SIRT-1 může dojít persulfidací [95]. Alternativním vysvětlením nárůstu aktivity SIRT-1 je modifikace transkripčního regulátoru SIRT-1. Jako taková vede persulfidace NF-k, upstream transkripčního regulátoru SIRT-1 [96] ke zvýšené transkripční aktivitě NF-k a tím i SIRT-1 [97]. Navíc H2S aktivuje dráhy PI3K/Akt, ERK1/2 a ATF4, například persulfidací proteinů v těchto drahách, což snižuje stres ER (obr. 2) [98,99]. Nedávné studie ukazují, že persulfidace SIRT1 a tím snížení jeho deacetylační aktivity hraje hlavní roli v regulaci jeho epigenetické funkce [95]. H2S tedy hraje důležitou roli v regulaci funkce ER modulací aktivity proteazomu a indukcí ochranných drah při proteotoxickém stresu persulfidací upstream transkripčních faktorů a epigenetických modifikátorů.

Zatím není přesně známo, zda H2S zmírňuje proteotoxický stres H2S v rámci ER nebo prostřednictvím jiných mediátorů. Výsledky získané v buňkách HeLa, myších játrech a zebřičkách pomocí sondy H2S zaměřené na ER však odhalují specifickou lokalizaci H2S na ER [100]. Zbývá prostudovat, zda jsou lokální hladiny H2S v ER regulovány dostupností specifického modulačního substrátu nebo translokací enzymů produkujících H2S do ER. Je zajímavé, že různé enzymy produkující H2S plní různé role při zmírňování proteotoxického stresu. Během stresu ER vyvolaného thapsigarginem v buňkách HEK293 inhibuje tvorba oxidu uhelnatého (CO) CBS vazbou na jeho hemovou skupinu, což snižuje produkci cystathioninů. Vzhledem k tomu, že cystathionin je inhibitorem funkce CSE, jeho deplece způsobuje, že CSE produkuje více H2S pro zmírnění proteotoxického stresu [101]. Souhrnně tyto důkazy naznačují, že H2S je účinný modulátor proteotoxického stresu prostřednictvím selektivní modulace proteazomu a odpovídajících proteinových cysteinových zbytků prostřednictvím persulfidace, což vede k upregulaci ochranných signálních cest.

2.5.8. H2S zmírňuje poškození ledvin udržováním mitochondriální funkce

Maintaining ATP production during IR or in AKI is crucial for renal function and recovery. Most ATP is produced by oxidative phosphorylation in mitochondria, with substrates derived from the citric acid cycle to fuel the electron transport chain. Alternatively, H2S can also serve as an electron donor in oxidative phosphorylation. Gobern et al. [102]revealed that HS is a substrate of oxidative phosphorylation at nano-molar concentrations. CBS, CSE, and 3-MST either reside in the mitochondrion or can translocate there under specific conditions, to contribute to ATP production directly [103]. As such, hypoxia triggers CBS translocation to mitochondria [22,104]. Mitochondrial CBS levels increase 6-fold within 1 h of hypoxia [22]. Another consequence of hypoxia is the suppression of oxygen-dependent mitochondrial catabolism (e.g. CoQ-dependent SQR activity) of H2S that leads to the accumulation of H S in cells. This observation was recently demonstrated by using mass spectrometry-based H>S-selektivní chemické sondy v ischemické tkáni zvířat a v modelovém systému pro uchování orgánů [105] a také pomocí fluorescenčního senzoru citlivého na H2S v anoxické buněčné kultuře [106].

In hypoxia, both CSE and CBS activity are associated with elevated ATP production [104,107]. Blockade of CBS or CSE by AOAA/shRNA or PPG, respectively, abrogates the effects of these enzymes on ATP production [107,108]. Stimulating 3-MST function by adding its substrate 3-mercaptopyruvate, increases intramitochondrial H2S levels and stimulates the production of ATP [29]. Apart from electron donation of H2S, persulfidation of ATP synthase and GAPDH increases their activity, thereby stimulating ATP production. Mice lacking CSE have profoundly lowered levels of ATP synthase and GADPH persulfides, associated with reduced ATP production [74,103]. Thus, H2S can stimulate ATP production by donating electrons and by the persulfidation of enzymes involved in mitochondrial ATP production. Furthermore, H2S reduces cytochrome c very efficiently to stimulate the electron flow through the respiratory chain [106]. The same study shows that both endogenous and exogenously applied H2S were able to induce cytochrome c dependent protein persulfidation that suppresses the apoptotic response by persulfidation of a catalytically active cysteine residue of caspase-9 and inhibiting its pro-apoptotic function. In contrast to low levels of endogenous H2S, administration of exogenous H2S profoundly reduce mitochondrial function by inhibiting cytochrome oxidase(complex IV)through binding to ferric iron (Fe3+), thereby halting aerobic ATP generation at alveolar concentrations of >100 ppm [2]. Prostřednictvím tohoto mechanismu může expozice koncentraci 80 ppm H2S (reverzibilně) potlačit rychlost metabolismu a tím i toxicitu u myší[109].

Společně, zatímco nízké hladiny (endogenního) H2S mohou stimulovat produkci ATP darováním elektronů do elektronového transportního řetězce a modulací enzymatické aktivity, vysoké hladiny (exogenního) H2S mohou vykazovat toxické účinky inhibicí cytochrom c oxidázy. H2S tedy udržuje produkci ATP, která je rozhodující pro funkci ledvin po poškození ledvin.

2.5.9. H2S stimuluje produkci antioxidantů, které tlumí zánět vyvolaný ROS

Při metabolickém stresu může H2S překonat škodlivé účinky mitochondriální dysfunkce stimulací produkce ATP a antioxidačními účinky vychytáváním volných radikálů, ochranou proteinových zbytků před oxidací persulfidací a upregulací antioxidačních mechanismů. Oxidační stres vyvolaný H2O2 v ledvinových epiteliálních buňkách Xenopus laevis byl odstraněn (před)léčením NaHS [110]. Zatímco H2S přímo vychytává volné radikály – například peroxynitrit – za vzniku sulfinylnitritu (HSNO2), H2S také upreguluje důležité antioxidační mechanismy včetně glutathionu, hlavního antioxidantu [111]. H2S redukuje extracelulární cystein na cystein, následovaný buněčným vychytáváním cystin/glutamátovým antiporterem [34]. H2S dále zvyšuje aktivitu r-glutamylcysteinsyntetázy (y-GCS), jednoho ze dvou enzymů potřebných k produkci glutathionu [112, 113]. Mechanismus, kterým H2S ovlivňuje jejich aktivitu GCS, není zcela jasný, nicméně exprese y-GCS a hladiny proteinů nejsou ovlivněny H2S a pravděpodobně posttranslační modifikace persulfidací odpovídá za vyšší aktivitu y-GCS po stimulaci H2S . Kromě vychytávání volných radikálů a upregulace hladiny glutathionu H2S uplatňuje své ochranné účinky prostřednictvím indukce antioxidační stresové reakce prostřednictvím Nrf2[14]. Kromě stimulace produkce ATP tedy H2S zmírňuje škodlivé účinky mitochondriální dysfunkce snížením oxidačního stresu.

Účinky H2S na mitochondriální funkci mohou vysvětlit jeho ochranné účinky proti poškození ledvin IR, čímž tlumí zánět a snižuje strukturální poškození indukované IR [115]. Myši bez CSE jsou náchylnější k akutnímu poškození ledvin vyvolanému IR, spojenému se sníženým přežitím [18]. Exprese zánětlivých genů a uvolňování cytokinů jsou sníženy prostřednictvím zvýšené per sulfidace transkripčních faktorů, jako je NF-k v renálním IR. Proto H2S působí jako antioxidant prostřednictvím zvýšení antioxidačních hladin glutathionu a upregulace antioxidační stresové reakce. Je zajímavé, že nedávná studie prokázala opačné, prozánětlivé účinky závislé na CSE na myším modelu akutního ischemického poškození ledvin. Zde bylo u CSE-7 myší pozorováno snížené poškození buněk a snížené hladiny prozánětlivých interleukinů a cytokinů [16]. Pozorované rozdíly v experimentálních výsledcích mezi podobnými studiemi lze částečně vysvětlit rozdílem v genetickém pozadí živočišných druhů a jejich odpovídajících fenotypů.

Konečně, oxidační stres neovlivňuje pouze buněčnou homeostázu a přežití buněk, ale také ovlivňuje renální manipulaci se sodíkem oxidující fosfatázou a homologem tenzinu (PTEN), čímž zvyšuje aktivitu epiteliálního sodíkového kanálu (ENaC), což usnadňuje absorpci Na plus [117] . Účinek oxidačního stresu na ENaC je odstraněn předúpravou NaHS [117], potenciálně ochranou PTEN proti oxidaci persulfidací proteinu, podobně jako persulfidace zprostředkovaná H2S může zabránit ztrátě enzymatické funkce PTEN vyvolané S-nitrosylací [118 ]. Společně, vyloučení mitochondriální dysfunkce (tj. stimulace tvorby ATP a snížení oxidačního stresu) vylučuje dysfunkci ledvin a poškození způsobené oxidačním stresem.

3. Závěr

Produkce H2S je přísně kontrolována, jak kvantitativně, tak i prostorově katabolickými a anabolickými procesy. Faktory jako dostupnost substrátu, množství proteinů, lokální pH a skladovací kapacita řídí anabolismus H2S, zatímco koncentrace kyslíku, enzymatické a neenzymatické mechanismy řídí katabolismus H2S. Metabolity H2S, jako je H2S vázaný jako sulfanová síra nebo v kyselém prostředí labilní zásoby H2S, mohou stále vykonávat signalizační funkce. H2S ovlivňuje průtok krve ledvinami tím, že ovlivňuje hladiny NO a tím vaskulární funkci, stejně jako regulaci exprese genů odpovědných za lokální a systémový krevní tlak a vylučování sodíku. Regulace produkce proteinů a proteotoxického stresu je dosaženo prostřednictvím modulace autofagického toku, aktivity proteazomu, clearance agregovaných proteinů a UPR prostřednictvím H2S signalizace, která je relevantní pro zeslabení AKI. H2S je důležitý antioxidant tím, že přímo vychytává volné radikály, ale navíc zvyšuje buněčnou antioxidační odpověď tím, že slouží jako substrát pro produkci glutathionu. Tvorbou proteinových persulfidů HS moduluje enzymatickou aktivitu, ale také aktivitu transkripčního faktoru ovlivněním interakcí protein-protein v cytosolu, což indukuje translokaci transkripčního faktoru do jádra. Za hypoxických podmínek udržuje H2S syntézu ATP tím, že působí jako alternativní donor elektronů. Vzhledem k ochranným účinkům H2Supon metabolického stresu v ledvinách lze farmakologické cíle H2S využít k léčbě hypertenze nebo k odvrácení poškození během akutního poškození ledvin, ke kterému dochází například během ischemie/reperfuze, transplantace ledvin nebo sepse.