UW roztok doplněný thiosíranem sodným chrání renální štěpy před prodlouženým chladným ischemicko-reperfuzním poraněním u myšího modelu syngenní transplantace ledviny

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang a kol

Cistanche tubulosa zabraňujeledvinanemoc, klikněte zde pro získáníprodukty a Cistanche Nz

ABSTRAKTNÍ

Úvod:Studené ischemicko-reperfuzní poškození (IRI) je nevyhnutelnou událostí, která zvyšuje potransplantační komplikace. Již dříve jsme prokázali, že suplementace roztoku University of Wisconsin (UW) donorovými molekulami sirovodíku (H2S) neschválenými FDA minimalizuje studenou IRI a zlepšuje funkci ledvinového štěpu po transplantaci. Tato studie zkoumá, zda donorová molekula H2S schválená FDA, thiosíran sodný (STS), bude mít stejný nebo lepší účinek na klinicky relevantním potkaním modelu syngenní ortotopie.ledvinatransplantace.

Metoda:Třicet krys Lewis podstoupilo bilaterální nefrektomii s následnou syngenní ortotopickou transplantací levéledvinapo 24-hodinové konzervaci v roztoku UW nebo UW plus STS při 4 ◦C. Potkani byli monitorováni do 14. dne po transplantaci a usmrceni, aby se vyhodnotila funkce ledvin (výdej moči, sérový kreatinin a dusík močoviny v krvi).ledvinyřezy byly obarveny H&E, TUNEL, CD68 a myeloperoxidázou (MPO) pro detekci akutní tubulární nekrózy (ATN), apoptózy, infiltrace makrofágy a infiltrace neutrofilů.

Výsledek:UW plus STS štěpy vykazovaly významně zlepšenou funkci štěpu bezprostředně po transplantaci, se zlepšeným přežitím příjemce ve srovnání s UW štěpy (p < {{0}},05).="" histopatologické="" vyšetření="" odhalilo="" signifikantně="" sníženou="" infiltraci="" atn,="" apoptózu,="" makrofágy="" a="" neutrofily="" a="" downregulaci="" prozánětlivých="" a="" proapoptotických="" genů="" u="" štěpů="" uw="" plus="" sts="" ve="" srovnání="" s="" štěpy="" uw="" (p=""><>

Závěr:Poprvé jsme ukázali, že konzervace renálních štěpů v roztoku UW doplněném STS chrání před prodlouženým studeným IRI potlačením apoptotických a zánětlivých drah, a tím zlepšením funkce štěpu a prodloužením přežití příjemce. To by mohlo představovat novou klinicky použitelnou terapeutickou strategii k minimalizaci škodlivého klinického výsledku prodloužené studené IRI inledvinatransplantace.

klíčová slova:Thiosíran sodný (STS) Ischemicko-reperfuzní poškození (IRI) Statické chladírenské skladování (SCS)ledvinytransplantace Přežití štěpu a příjemce

1. Úvod

ledvinytransplantace je optimální léčbou v konečné fáziledvinaledvinovéonemocnění (ESRD). Ve srovnání s dialýzouledvinatransplantace je lepší, protože poskytuje lepší kvalitu života a poskytuje významnou výhodu v přežití spolu s její nákladovou efektivitou [1–3]. Odběr ledvin dárce je však neodmyslitelně spojen s ischemicko-reperfuzním poškozením (IRI), což je nevyhnutelný důsledek zastavení a následného obnovení průtoku krve během transplantace [4]. Současnou strategií ke zmírnění IRI vyvolané transplantací je statické chladné skladování (SCS) renálních štěpů ve standardních konzervačních roztocích, jako je roztok University of Wisconsin (UW) na ledu při teplotě 4 ◦C během období před transplantací [5]. Ukázalo se však, že prodloužená SCS je spojena se zvýšenou buněčnou smrtí, zánětem a dalšími poškozujícími buněčnými a molekulárními událostmi, které nakonec vedou ke zvýšenému výskytu opožděné funkce štěpu (DGF), akutní tubulární nekrózy (ATN) a snížení počtu štěpů. přežití [6–10]. Aby navíc udržela krok s celosvětově rostoucí incidencí ESRD a stále se zvyšujícím počtem pacientů na čekacích listinách na transplantaci, řada transplantačních center přijímá ledvinové štěpy s prodlouženými studenými ischemickými periodami, což dále přispívá k celkovému poškození tkáně. Po SCS následuje reperfuze, kdy je teplá okysličená krev obnovena do studeného ischemického štěpu. Reperfuze, která je efektorovou fází ischemického poškození, je charakterizována zvýšeným poškozením tkáně [11–13].

Potenciální terapeutická strategie k omezení studené IRI běhemledvinatransplantace zahrnuje doplnění standardního konzervačního roztoku sirovodíkem (H2S), endogenně produkovaným plynovým přenašečem, u něhož bylo prokázáno, že hraje důležitou fyziologickou roli při vazodilataci a buněčné signalizaci [14–16]. Již dříve jsme ukázali, že prodloužená SCS v roztoku UW s přídavkem H2S snižuje transplantací indukovanou chladovou IRI a zlepšuje přežití štěpu u myších modelů syngenní a alogenní transplantace ledvin [17–19,41, 42]. Avšak donorové molekuly H2S použité v těchto studiích nejsou klinicky životaschopné. To vedlo k úvaze o použití thiosíranu sodného (STS), donorového léku H2S, který je schválen Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) k léčbě kalcifylaxe u pacientů s ESRD, toxicity vyvolané cisplatinou při léčbě rakoviny a jako protijed proti otrava kyanidem [20–23]. Nedávné studie ukázaly, že STS vykazuje ochranné účinky na zvířecích modelech IRI [24–26]. Jeho účinek na chladné IRI ledvin vyvolané transplantací však není znám. Proto tato studie zkoumá renoprotektivní účinky STS na in vitro modelu renální IRI a potkaním modelu syngenní ortotopické transplantace ledvin.

2. Materiály a metody

2.1. Experimentální protokol in vitro

In vitro model studené hypoxie a tepelného reoxygenačního poškození, který napodobuje buněčné podmínky během in vivo studené IRI, byl použit k posouzení ochranných účinků STS během renální IRI. V experimentech in vitro byly použity epiteliální buňky potkaních ledvin (NRK{0}}buněčná linie E; ATCC, USA), protože tyto buňky jsou citlivé na ischemické poškození [27] a jejich použití je v souladu s potkany model transplantace použitý pro druhý cíl této studie. Buňky byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) obsahujícím 10 procento fetálního bovinního séra (FBS) inaktivovaného teplem při 60 °C po dobu 20 minut a 1 procento penicilin/streptomycin (P/S). Buňky byly inkubovány za normálních růstových podmínek 37◦C, 21 procent O2 a 5 procent CO2. Kontrolní buňky byly za podmínek identických jako u preexperimentálních buněk. Experimentální buňky byly ošetřeny buď médiem bez séra (SF), SF plus 200 nM AP39, nebo SF s různými koncentracemi (50 uM, 150 uM, 500 uM, 1 mM) pentahydrátu thiosíranu sodného (STS), které byly získány od 250 mg/ml injekčního roztoku STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Byla použita koncentrace 200 nM AP39, protože jsme dříve ukázali, že AP39 v této koncentraci je cytoprotektivní proti stejné buněčné linii v podobném modelu studené IRI [20]. Buňky byly poté inkubovány při 10 °C po dobu 24 hodin za hypoxických podmínek (5 procent CO2, 0,5 procent O2, 95 procent N2) v hypoxické komoře HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, USA), aby se vyvolalo studené ischemické poškození. Byla použita podchlazená teplota 10 ◦C, protože to byla nejnižší teplota, které bylo možné technologicky dosáhnout při zachování úrovně hypoxie 0,5 procenta O2. Po hypoxii bylo médium obsahující experimentální buňky nahrazeno kontrolním médiem a buňky reoxygenovány inkubací za normálních růstových podmínek (37 °C, 21 procent O2 a 5 procent CO2) po dobu 24 hodin, aby se simulovala reperfuze a s ní spojené poškození. Po 24 hodinách reoxygenace byla buněčná životaschopnost hodnocena barvením buněk s FITC-konjugovaným annexinem-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) a 7-aminoaktinomycinem D (7-AAD; BioLegend, USA ), který měří buněčnou apoptózu a nekrózu. Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií za použití CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). FlowJo verze 11 (FlowJo LLC, USA) byla použita pro vhodné hradlování dat pro statistickou analýzu.

2.2. Pokusná zvířata

Třicet samců krys Lewis o hmotnosti 275–300 g zakoupených od Charles River (St. Constant, QC, Kanada) bylo umístěno v zařízení Animal Care and Veterinary Services na Western University (Londýn, ON) za standardních podmínek. Studie na zvířatech byly schváleny Radou Western University Council on Animal Care and Animal Use s protokolem ID 2018–155.

2.3. Model transplantace ledvin

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20% ztráta hmotnosti) nebo smrt. Humánní koncové body byly kontrolovány dvakrát denně a všechny krysy byly usmrceny expozicí CO2 v komoře při průtoku 40 procent. V době eutanazie se nevyskytly žádné chirurgické komplikace, které by mohly mít za následek odchylky ve výsledcích.

2.4. Analýza funkce ledvin

Po transplantaci ledviny byly krysy sledovány v metabolických klecích po dobu 14 dnů a poté utraceny. Vzorky krve a moči byly odebrány v POD 3, 5, 7, 10 a 14 pro stanovení parametrů funkce ledvin (sérový kreatinin, dusík močoviny v krvi [BUN], osmolalita moči a výdej moči). BUN a sérový kreatinin pocházely od příjemců transplantátu ledviny a krysy s falešnou operací byly měřeny pomocí přístroje IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON). Hladiny osmolality moči byly stanoveny osmometrií bodu tuhnutí za použití přístroje 3320 Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA) a porovnány se standardy poskytnutými společností.

2.5. Histopatologická a morfometrická analýza

Tkáně ledvin zalité v parafínu byly nařezány na řezy o tloušťce 4 um a upevněny na mikroskopická sklíčka pro histologii. Řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E), terminální deoxynukleotidyltransferázou dUTP značení konce (TUNEL) pro stanovení stupně ATN a apoptózy, v daném pořadí. Úsekům H&E bylo přiděleno skóre pro ATN zaslepeným renálním patologem podle následujícího schématu: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 procent štěpu ATN. Řezy ledvin byly také obarveny následujícími primárními protilátkami: marker poškození ledvin (KIM-1), makrofágový povrchový marker CD68 a neutrofil-specifický enzym myeloperoxidáza (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) a vizualizovány sekundárními protilátkami a Substrátový chromogen DAB za použití systému Dako Envision System (Dako, Glostrup, Dánsko) podle protokolu výrobce a následně analyzován pod digitálním světelným mikroskopem Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) při 10x zvětšení a kvantifikován softwarem ImageJ v. 1.8 (National Ústav zdraví, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitativní PCR analýza

Celková RNA byla izolována z tkání ledvinového štěpu získaných v POD 3 pomocí RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) a reverzně transkribována do cDNA pomocí OneScript® Plus cDNA Syntéza Kit (ABM, Kanada) ve spojení s oligo(dT)12– 18 primerů podle protokolu výrobce. Izolovaná RNA a cDNA byly před použitím analyzovány pomocí nanokapky (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Kanada), s hodnocením A260/280 konzistentně > 1,95, respektive > 1,8. Reakční směs každého vzorku qPCR měla objem 20 ul a byla vyrobena podle protokolu Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) a analyzována pomocí přístroje CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Kanada) . Sekvence primerů byly navrženy pomocí softwaru Primer-BLAST (NCBI) proti beta-aktinu, poly (ADP-ribóza) polymeráze (PARP), interferonu-gama (IFN-), tumor nekrotizujícímu faktoru alfa (TNF-), interleukinu 6 (IL -6), lymfom B-buněk 2 (Bcl-2), protein X asociovaný s Bcl{26}} (BAX), kaspáza 3, agonista smrti interagující domény BH3 (BID), c-Jun N-terminální kináza 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivátor 1 alfa (PGC-1 ), mitochondriální komplex I (NDUFB8), mitochondriální komplex II (SDHB), mitogenem aktivovaná proteinkináza 1/2 (ERK1 /2), neutrofilní gelatinázu lipokalin (NGAL) a geny pro poškození ledvin-1 (KIM{45}}). Všechny sledované geny byly normalizovány vůči beta-aktinu. Násobné změny genové exprese byly porovnány s falešně operovanými krysami a byly vypočteny s použitím metody ACt.

2.7. Statistická analýza

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí statistického softwarového balíku GraphPad (La Jolla, CA) Prism, verze 9.0. Data přežití byla analyzována pomocí Kaplan-Meierovy analýzy přežití a log rank testu, zatímco data qPCR genové exprese byla analyzována pomocí nepárového jednocestného t-testu. Všechna ostatní data byla analyzována pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) následované Tukeyho post-hoc testem pro stanovení statistických rozdílů mezi skupinami. Statistická významnost byla přijata na str<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Výsledky

3.1. Médium bez séra doplněné STS zlepšuje přežití renálních tubulárních epiteliálních buněk během studené hypoxie/reoxygenace

Analýza průtokovou cytometrií po barvení na apoptózu a nekrózu ukázala, že buňky NRK{0}}E ošetřené SF během in vitro studené IRI vykazovaly významně sníženou životaschopnost buněk ve srovnání s kontrolními (normoxickými) buňkami (obr. 1A; p < 0.05).="" zatímco="" všechny="" experimentální="" vzorky="" vykazovaly="" významně="" nižší="" životaschopnost="" renálních="" tubulárních="" epiteliálních="" buněk="" než="" buňky="" pěstované="" za="" normoxických="" podmínek="" (p="">< 0,05),="" buňky="" ošetřené="" sf="" doplněným="" 150="" um="" a="" 500="" um="" sts="" vykazovaly="" významně="" vyšší="" životaschopnost="" než="" buňky="" ošetřené="" se="" samotným="" sf="" médiem="" (obr.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" což="" odpovídalo="" výrazně="" snížené="" apoptóze="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" samotným="" sf="" médiem="" (obr.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" kromě="" toho="" se="" zdá,="" že="" zvýšení="" životaschopnosti="" buněk="" a="" snížení="" apoptózy="" dosahují="" optimální="" úrovně="" se="" 150="" um="" a="" 500="" um="" sts,="" protože="" vyšší="" dávka="" tyto="" trendy="" zvrátila="" (obr.="" 1a="" a="">

3.2. Doplnění roztoku UW pomocí STS zlepšuje časné přežití a funkci renálního štěpu

Uchování renálních štěpů v roztoku UW s přídavkem STS významně zlepšilo přežití příjemce s 83% přežitím do POD 14 (den usmrcení) ve srovnání s kontrolní skupinou bez suplementace STS, která vykazovala 12,5% přežití, zejména v prvních 3 dnech (obr. 2A; p < 0.05).="" navíc="" suplementace="" sts="" výrazně="" zlepšila="" funkci="" štěpu="" během="" časného="" potransplantačního="" období="" ve="" srovnání="" se="" samotnou="" uw="" léčbou.="" hladiny="" sérového="" kreatininu="" a="" bun="" byly="" významně="" zvýšeny="" ve="" skupinách="" uw="" i="" uw="" plus="" sts="" v="" pod="" 3,="" což="" korelovalo="" se="" sníženou="" osmolalitou="" moči="" ve="" srovnání="" s="" sham="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" hladiny="" sérového="" kreatininu="" a="" bun="" ve="" skupině="" uw="" plus="" sts="" však="" významně="" poklesly="" v="" pod="" 3="" s="" odpovídajícím="" zvýšením="" osmolality="" moči="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" uw="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a;="" p="">< 0,05).="" je="" zajímavé,="" že="" hladiny="" sérového="" kreatininu="" a="" bun="" ve="" skupině="" uw="" plus="" sts="" stabilně="" klesaly="" od="" pod="" 3="" do="" pod="" 14="" se="" zvýšenou="" osmolalitou="" moči="" a="" byly="" srovnatelné="" s="" hladinami="" u="" shama="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a).="" také="" výdej="" moči="" ve="" skupině="" uw="" plus="" sts="" byl="" významně="" vyšší="" během="" prvních="" čtyř="" pooperačních="" dnů="" ve="" srovnání="" se="" skupinami="" uw="" a="" sham="" (obr.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" stále="" se="" však="" snižoval="" směrem="" k="" výchozí="" hodnotě="" (sham)="" a="" byl="" srovnatelný="" s="" hodnotou="" sham="" v="" pod="" 14,="" zatímco="" produkce="" moči="" u="" přeživších="" potkanů="" ​​ve="" skupině="" uw="" zůstala="" vyšší="" než="" výchozí="" hodnota="" v="" pod="" 14="" (obr.="">

3.3. Přidání STS do roztoku UW zmírňuje transplantací indukovanou buněčnou smrt po transplantaci ledviny

Řezy ledvin získané v POD 3 a 14 byly obarveny pomocí TUNEL jako míra apoptotické buněčné smrti a hodnoceny zaslepeným renálním patologem (obr. 4A). Renální štěpy ze skupiny UW vykazovaly významně vyšší apoptotickou buněčnou smrt v POD 3, jak naznačuje vyšší skóre TUNNEL ve srovnání s ledvinami ze skupin UW plus STS a Sham (obr. 5A a b; p < 0.{{11}="" }5).="" štěpy="" ze="" skupiny="" uw="" plus="" sts="" se="" významně="" nelišily="" ve="" srovnání="" s="" štěpy="" sham="" ve="" stejném="" časovém="" bodě="" a="" v="" pod="" 14="" (obr.="" 4b).="" navíc,="" zatímco="" štěpy="" ze="" skupin="" uw="" i="" uw="" plus="" sts="" vykazovaly="" významně="" zvýšené="" skóre="" atn="" v="" pod="" 3="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" sham="" (obr.="" 5;="" p="">< 0.05),="" štěpy="" uw="" plus="" sts="" vykazovali="" snížené="" skóre="" atn="" v="" pod="" 3="" ve="" srovnání="" s="" uw="" (obr.="" 5;="" p="">< 0,05).="" také,="" zatímco="" příjemci="" uw="" štěpů="" nepřežili="" do="" pod="" 14,="" a="" tudíž="" jejich="" skóre="" atn="" nebylo="" možné="" určit="" v="" pod="" 14,="" příjemci="" štěpů="" uw="" plus="" sts="" přežili="" do="" pod="" 14,="" ale="" vykazovali="" významně="" zvýšené="" skóre="" atn="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" sham="" (obr.="" p=""><>

3.4. Renální štěpy konzervované v roztoku UW doplněném STS vykazovaly snížené markery poranění a zánětlivý infiltrát po transplantaci ledviny

Řezy ledvin získané v POD 3 a 14 byly obarveny KIM-1 k detekci poškození proximálních tubulů, stejně jako CD68 (marker makrofágů) a MPO (marker neutrofilů) a skórovány zaslepeným renálním patologem (obr. 6A, 7A, a C). Exprese KIM-1, CD68 a MPO v renální tkáni byla významně vyšší ve skupině UW v POD 3 ve srovnání s expresí ve skupinách UW plus STS a Sham (obr. 6B, 7B a D; p < {{11}="" }.05),="" zatímco="" exprese="" těchto="" markerů="" v="" uw="" plus="" sts="" štěpech="" nebyla="" významně="" odlišná="" ve="" srovnání="" s="" sham="" v="" pod="" 14="" (obr.="" 6b,="" 7b="" a="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-suplementace do roztoku UW potlačila renální expresi prozánětlivých, proapoptotických a mitochondriálních genů

Genová exprese prozánětlivých, proapoptotických, na mitochondrie cílených markerů a markerů poškození ledvin byla stanovena pomocí qRT-PCR v transplantovaných ledvinách získaných v POD 3. Exprese prozánětlivých genů IFN-, TNF- a IL{{8 }} byly výrazně zvýšeny v UW štěpech ve srovnání s UW plus STS štěpy v POD 3 (obr. 8A; p < 0.05)="" a="" následovaly="" stejný="" vzorec="" s="" proapoptickými="" geny="" parp,="" bax="" ,="" kaspázy-3,="" bid,="" jnk1="" a="" jnk2="" (obr.="" 8a;="" p="">< 0.05),="" zatímco="" exprese="" antiapoptotického="" bcl-2="" byla="" v="" uw="" mírně="" zvýšena="" plus="" skupina="" sts="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" uw,="" ačkoli="" toto="" zvýšení="" nedosáhlo="" statistické="" významnosti="" (obr.="" 8a).="" navíc="" exprese="" mitochondriálních="" genů="" pgc-1,="" ndufb8="" (komplex="" i)="" a="" sdhb="" (komplex="" ii)="" v="" uw="" štěpech="" byla="" významně="" snížena="" ve="" srovnání="" s="" uw="" plus="" sts="" štěpy="" (obr.="" 8b;="" p="">< 0="" .05),="" zatímco="" u="" expresí="" erk1="" a="" erk2="" byl="" pozorován="" opak="" (obr.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" kromě="" toho="" byla="" exprese="" genu="" kim-1="" v="" uw="" štěpech="" významně="" zvýšena="" ve="" srovnání="" s="" uw="" plus="" sts="" štěpy="" (obr.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" zatímco="" snížená="" exprese="" ngal="" v="" uw="" plus="" sts="" štěpech="" nedosáhla="" statistické="" významnosti="" ve="" srovnání="" s="" uw="" štěpy="" (obr.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Diskuze

Tato studie zavádí suplementaci standardního konzervačního roztoku STS, klinicky životaschopného dárce H2S schváleného FDA, ke zmírnění transplantací indukované studené ledvinové IRI, zlepšení kvality štěpu a prodloužení přežití příjemce. Pomocí in vitro modelu renální IRI a potkaního modelu syngenní ortotopické transplantace ledviny poprvé demonstrujeme, že suplementace UW roztoku STS během prodloužené SCS je pro- a orgánová ochrana.

Primárním zjištěním v našem in vitro modelu je, že suplementace STS do bezsérového média chrání renální epiteliální buňky před studenou hypoxií a teplou reoxygenací indukovanou apoptózou a zvyšuje životaschopnost, což je v souladu s naší předchozí studií, kde jsme ukázali ochranné účinky mitochondrií. - cílený donorový lék H2S, AP39, v in vitro modelu studené ledvinové IRI [20]. Je zajímavé, že vyšší koncentrace STS 1 mM zvrátila příznivé účinky, z čehož vyplývá, že STS vykazuje dvoufázový jev reakce na dávku označovaný jako hormeze, ve kterém nižší koncentrace je cytoprotektivní, zatímco vyšší koncentrace je cytotoxická. Mitochondriální poškození je hlavním důsledkem IRI ledvin, protože mitochondriální permeabilita může inhibovat produkci adenosintrifosfátu (ATP) a zvýšit tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS), destruktivního mediátoru poškození tkáně [13]. Nedávno bylo navrženo, že mitochondrie jsou primárním místem aktivity STS. Nejen, že je známo, že STS generuje H2S v mitochondriích redukcí závislou na glutathionu a naopak cestou oxidace sulfidů, ale také zachovává mitochondriální syntézu ATP, snižuje produkci ROS a zlepšuje komplexní enzymové aktivity v elektronovém transportním řetězci (ETC) [24 ,28–30]. Nedávné studie navíc ukázaly, že STS významně zvyšuje expresi PGC-1, pozitivního regulátoru mitochondriální biogeneze a produkce ATP [26], což je v souladu s naším pozorováním in vivo. Tyto molekulární mechanismy by mohly odpovídat za významně zvýšenou expresi mitochondriálních ETC komplexů I a II (NDUFB8 a SDHB v tomto pořadí) v našem modelu transplantace ledvin se zvýšeným přežitím a funkcí, jak bylo pozorováno u renálních štěpů konzervovaných v roztoku UW s přídavkem STS.

Na základě našich výsledků in vitro jsme se rozhodli prozkoumat, zda je ochranný účinek STS aplikovatelný in vivo pomocí transplantačního modelu, kde chladná IRI je hlavním přispěvatelem k dysfunkci štěpu a zvýšeným potransplantačním komplikacím. Naše zjištění ukazují, že prodloužená (24 hodin) SCS renálních štěpů v roztoku UW s přídavkem STS významně zlepšuje kvalitu a funkci štěpu charakterizovanou sníženými hladinami sérového kreatininu a BUN, vyšším výdejem moči a prodlouženým přežitím příjemce ve srovnání se štěpy konzervovanými v samotném UW roztoku . Je důležité poznamenat, že bezprostřednost výstupu moči i po klinické transplantaci ledviny je kritickým výsledkem, který určuje, zda je k řešení opožděné funkce štěpu (DGF) nutná dialýza. Naše pozorování, že STS zvyšuje produkci moči bezprostředně po transplantaci a je srovnatelné se skupinou Sham v POD 14, je proto slibným zjištěním. Pozorované zlepšení funkce ledvin po transplantaci štěpů konzervovaných v roztoku UW doplněném STS také poskytlo významnou výhodu v přežití. Suplementace STS kvantitativně prodloužila životnost štěpu tak, že 83 procent (5/6) krys, které dostaly UW plus STS štěpy, přežilo do POD 14 (den usmrcení) ve srovnání s pouze 12,5 procenty (1/8) příjemců krys štěpy konzervované v UW roztoku bez suplementace STS. Toto zjištění z této studie je také v souladu s naší předchozí studií, ve které pouze 14 procent (1 ze 7) příjemců krys štěpů bylo uchováno v roztoku UW po dobu 24 hodin bez suplementace H2S (GYY4137), přežilo do POD 14 [20]. .

Kromě zlepšení parametrů funkce ledvin suplementace STS také inhibovala apoptózu a zánět ledvinového štěpu snížením tkáňové exprese proapoptotických a prozánětlivých genů a současně upregulací antiapoptotických genů a snížením CD68-pozitivních makrofágů a MPO-pozitivní neutrofily, což vedlo ke snížení exprese KIM-1 a ATN a nakonec k zachování morfologie ledvin. O těchto zánětlivých cytokinech je známo, že jsou mediátory buněčné smrti během studené IRI [31] a jejich snížení v UW plus STS štěpech je pravděpodobně způsobeno dobře známými vlastnostmi STS, které snižují endoteliální permeabilitu ve vaskulární endoteliální monovrstvě, zeslabují produkci cytokinů a vyvolat produkci protizánětlivých cytokinů [32]. Také naše zjištění, že suplementace STS do roztoku UW snižuje expresi prozánětlivých genů, odpovídá předchozí studii o protizánětlivé aktivitě STS snížením hladin TNF- a IL-6 u neurologických onemocnění [33 ,34]. Mechanicky STS inaktivuje kaspázu-3 tím, že se naváže na její aktivní místo prostřednictvím silných vodíkových vazeb, a tím zabrání přístupu přirozeného substrátu k aktivnímu místu, čímž nakonec zastaví apoptózu [35]. STS také blokuje aktivaci JNK, proteinu, který hraje kritickou roli v apoptotické signalizaci [35], což podporuje naše zjištění o downregulačním účinku STS na kaspázu3 a JNK. Nejsme však schopni určit, zda jsou takové mechanismy v této studii funkční, protože jsme neprováděli další experimenty, abychom tyto molekulární mechanismy prozkoumali.

Hlavním omezením našeho experimentu in vitro je naše technická výzva při použití současné standardní konzervační teploty 4 ◦C [36], protože námi použitých 10 ◦C byla nejnižší teplota, které bylo možné technologicky dosáhnout bez ohrožení hypoxického prostředí. To je skutečný rozdíl, pokud jde o buněčné fyziologické procesy a také v konzervačních technikách. Potenciálním řešením je použití chemicky indukované hypoxie v plastovém sáčku a jeho umístění do 4 ◦C lednice, aby odpovídalo klinickému nastavení SCS. Tyto vaky pro vytváření anaerobní atmosféry však byly navrženy pro použití při vysokých teplotách (21–37 ◦C), protože za těchto podmínek fungují chemické sloučeniny, které vyvolávají hypoxické prostředí. Budoucí studie by se měly zaměřit na optimalizaci teploty v hypoxické komoře tak, aby napodobovala klinické nastavení SCS. Dosažení konzistentní teploty 4 ◦C bez ohrožení hypoxického prostředí nám umožní určit, zda pozorované fenotypy v experimentálním in vitro studeném IRI modelu jsou konzistentně exprimovány. Kromě experimentu in vitro není náš model transplantace potkanů ​​bez nevýhod. Provedli jsme syngenní transplantaci ledvin (geneticky identičtí dárci a příjemci s imunologickou kompatibilitou), která je použitelná pouze u jednovaječných dvojčat při klinické transplantaci ledviny, zatímco většina klinických transplantací ledvin je alogenní (geneticky odlišní dárci a příjemci). Alogenní transplantace nutí příjemce transplantátu, aby před transplantací podstoupil imunologické testy k identifikaci dárcovských lidských leukocytárních antigenů (HLA; molekuly, které indukují a regulují imunitní odpověď), určí imunologickou kompatibilitu mezi dárci a příjemci a zabrání rejekci orgánu [37,38]. Budoucí studie využívající STS by měly zvážit alogenní transplantaci. Dalším limitujícím modelem transplantace ledvin je skutečnost, že jsme se zaměřili na žijící dárce, suboptimální štěpy od dárců po srdeční smrti (DCD) jsou stále běžnější jako zdroj dárcovských ledvin v mnoha transplantačních centrech po celém světě [39]. DCD vystavuje dárcovské orgány různým obdobím teplé ischemie kromě chladných ischemických časů během SCS a je spojena se zvýšenou mírou DGF a sníženým přežitím štěpu ve srovnání s žijícími dárci [40]. Budoucí studie by proto měly zvážit model transplantace ledvin DCD, aby bylo možné posoudit účinek STS proti IRI v tomto modelu.

Závěrem lze říci, že naše studie prokazuje, že suplementace standardního konzervačního roztoku klinicky životaschopným donorovým lékem H2S během prodloužené SCS renálních štěpů chrání před transplantací indukovanou studenou ledvinovou IRI, zlepšuje celkovou kvalitu štěpu a funkci štěpu a prodlužuje přežití příjemce transplantátu. Vzhledem k tomu, že riziko DGF se zvyšuje s prodlouženou studenou ischemickou dobou při klinické transplantaci ledviny, což vyvolává hlavní klinický problém, pozorování, že STS chrání ledvinové štěpy během prodloužené SCS a zabraňuje DGF po transplantaci, poskytuje velký klinický příslib, který by mohl snížit nebo zabránit výskyt DGF při klinické transplantaci ledviny v blízké budoucnosti. Budoucí přínos přidání STS do řešení pro uchování tedy může představovat potenciální řešení tohoto přetrvávajícího problému. Celkově tato studie přispívá k rostoucímu množství literatury, která podporuje cytoprotektivní účinky STS a dalších dárců H2S proti orgánové IRI, zejména zlepšení výsledků štěpu u chladné renální IRI indukované transplantací. Tyto strategie by mohly usnadnit použití většího počtu štěpů vystavených prodloužené studené ischemické době, což by mohlo zvýšit zásobu transplantovatelných orgánů.

prohlášení o autorském příspěvku CRediT

Všichni autoři souhlasili se zasláním tohoto rukopisu. Neexistuje žádný střet zájmů.

Reference

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford a kol., Srovnání mortality u všech dialyzovaných pacientů, dialyzovaných pacientů čekajících na transplantaci a příjemců první kadaverózní transplantace, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll a kol., Systematický přehled: transplantace ledvin ve srovnání s dialýzou v klinicky relevantních výsledcích, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte a kol., Nákladová efektivita transplantace ledvin z DCD v Itálii, Transplantace. Proč. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemicko-reperfuzní poškození, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Organ preservation: aktuální koncepty a nové strategie pro příští desetiletí, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Studená ischemie a snížené dlouhodobé přežití kadaverózních renálních aloštěpů, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo a kol., Hlavní účinky opožděné funkce štěpu a doby studené ischemie na přežití renálního aloštěpu, Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Vliv doby studené ischemie na přežití štěpu u příjemců transplantátu ECD: analýza párů ledvin, Am. J. Transplant. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, ČR Parikh, Rizikové faktory pro příjemce spojené s opožděnou funkcí štěpu: analýza párové ledviny, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay a kol., Každá další hodina studené ischemie významně zvyšuje riziko selhání štěpu a mortalitu po transplantaci ledviny, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Antioxidanty cílené na mitochondrie: budoucí perspektivy při ischemicko-reperfuzním poškození ledvin, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oxidační stres způsobený mitochondriálním přetížením vápníkem, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Úloha mitochondrií při ischemickém/reperfuzním poškození, Transplantace 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Objevující se role gasotransmiterů při transplantaci ledvin, Am. J. Transplant. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Sirovodík a buněčná signalizace: týmový hráč nebo rozhodčí? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, The vasorelaxant effect of H(2)S as a new endogenous gaseous K(ATP) channel opener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter a kol., Léčba sirovodíkem zmírňuje ischemicko-reperfuzní poškození renálního aloštěpu během skladování v chladu a zlepšuje funkci časné transplantované ledviny a přežití po alogenní transplantaci ledviny, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Doplňkový sirovodík chrání funkci transplantované ledviny a prodlužuje přežití příjemce po dlouhodobém studeném ischemicko-reperfuzním poškození zmírněním apoptózy renálního štěpu. a zánět, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian a kol., Hydrogen Sulfide chrání ledvinové štěpy před prodlouženým studeným ischemicko-reperfuzním poškozením prostřednictvím specifických mitochondriálních účinků, Am. J. Transplant. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, thiosíran sodný pro akutní otravu kyanidem: studie na krysím modelu, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri a kol., Thiosíran sodný chrání před poškozením ledvin po hypertermické intraperitoneální chemoterapii (HIPEC) s cisplatinou, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.