Část 1 Mutace ERCC1 brání opravě poškození DNA a způsobují u pacientů dysfunkci jater a ledvin

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt a kol

Click to Cistanche extrakt prospívá funkci ledvin

Úvod

Šest miliard párů bází lidského genomu je neustále vystavováno činidlům poškozujícím DNA, což způsobuje širokou škálu lézí genomové DNA, včetně fotoproduktů indukovaných UV světlem, intra- a meziřetězcové křížové vazby (ICL) a dvojité DNA. strand breaks (DSB). Aby byla zajištěna integrita genomu, je třeba tyto léze DNA opravit specifickým a účinným způsobem. Vyvinuly se různé mechanismy opravy DNA, z nichž každý působí na specifickou podskupinu lézí DNA. Zatímco mnoho DNA opravných proteinů je zapojeno do jediné dráhy, heterodimerní endonukleázyERCC1-XPF je sdílen mezi několika mechanicky odlišnými cestami opravy DNA (Manandhar et al., 2015).

XPF je nestabilní a rychle degraduje, čemuž brání jeho heterodimerizace sERCC1(Biggerstaff a kol., 1993). Interakce mezi těmito dvěma proteiny je zprostředkována motivem dvoušroubovice-hairpin helix (HhH)2 umístěným na jejich příslušných C-koncích a také prostřednictvím centrální doményERCC1a nukleázová doména XPF (de Laat a kol., 1998b; Jones a kol., 2020; Tripsianes a kol., 2005; Tsodikov a kol., 2005). Vazbu na dvouvláknovou DNA usnadňuje ERCC1, zatímco XPF zprostředkovává asociaci s jednovláknovou DNA (ssDNA) prostřednictvím své domény (HhH)2 (Tsodikov et al., 2005). Jakmile je XPF umístěn, využívá svou katalytickou aktivitu prostřednictvím svého vysoce konzervovaného nukleázového motivu ke štěpení různých substrátů DNA na 59 spojích bublin a jednořetězcových 39 převisech vybíhajících z dvojité šroubovice DNA (de Laat et al., 1998a; Enzlin a Sch¨). are, 2002; Matsunaga a kol., 1996). Klíčová role ERCC1- XPF byla poprvé prokázána při opravě nukleotidové excize (NER), kde štěpí poškozenou DNA 59 na lézi (Sijbers et al., 1996a).

NER rozpoznává širokou škálu strukturálně nesouvisejících lézí DNA, včetně UV-indukovaných fotoproduktů, prostřednictvím svých dvou dílčích drah: globální opravy genomu (GGR) a opravy spojené s transkripcí (TCR). Většina aktivity NER závisí na GGR, kde protein XPC rozpoznává fotoprodukty v celém genomu a přijímá komplex transkripčního faktoru IIH (TFIIH) (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). DNA léze, které způsobují zastavení RNA polymerázy II (RNAPII) během transkripce, spouštějí nábor proteinů specifických pro TCR, jako jsou CSB, CSA a UVSSA, které zase rekrutují komplex TFIIH (Nakazawa et al., 2020; van der Weegen a kol., 2020). Po náboru TFIIH do léze DNA se GGR a TCR vlévají do společného molekulárního mechanismu zahrnujícího asociaci XPA a XPG (Marteijn et al., 2014), které stimulují helikázovou aktivitu TFIIH a tvoří stabilní přesný komplex spolu s RPA ( Kokic a kol., 2019; Riedl a kol., 2003; Wakasugi a Sancar, 1998). TheERCC1Heterodimer -XPF je rekrutován do komplexu NER pomocí XPA prostřednictvím domény vázající XPAERCC1(Tsodikov a kol., 2007; Volker a kol., 2001). Duální řez koordinovanou aktivitou endonukleáz XPF (59 z léze) a XPG (39 z léze) uvolní úsek ssDNA obsahující léze DNA (Li et al., 1995; Matsunaga et al., 1995; O 'Donovan et al., 1994; Staresincic et al., 2009), poté je vytvořená mezera vyplněna a podvázána, aby se dokončila oprava.

Kromě NER se ukázalo, žeERCC1-XPF také hraje zásadní roli při opravě ICL (Klein Douwel et al., 2014). Tato opravná dráha je zahájena zastavenou replikací a zahrnuje rozpoznání replikační vidlice zastavené ICL komplexem multiproteinového jádra Fanconiho anémie (FA), který slouží jako komplex E3 ubikvitin ligázy pro FANCD2. Mono-všudypřítomnost FANCD2 spouští nábor SLX4, který se zase zaměřuje naERCC1-XPF na ICL (Abdullah a kol., 2017; Klein Douwel a kol., 2014; Walden a Deans, 2014; Wood, 2010). Jakmile je ERCC1-XPF přijat, zprostředkuje uvolnění ICL naříznutím vlákna rodičovské DNA na obou stranách léze, aby se umožnilo následné bypass a oprava léze (Kuraoka et al., 2000). A konečně, ERCC1-XPF se také podílí na opravě DSB homologní rekombinací (Ahmad et al., 2008), během níž může účinně štěpit různé meziprodukty rekombinace (Wyatt et al., 2017). Alternativně buňky používají na RAD52-závislou jednořetězcovou nasedací dráhu náchylnou k chybám, která zahrnuje nasedání oblastí s mikrohomologií a následné odstranění nehomologních 39 konců ssDNAERCC1-XPF (Adair a kol., 2000; Li a kol., 2013, 2019). Přesná role ERCC1-XPF v těchto opravách DSB však není zcela pochopena.

Význam oprav DNA je podtržen klinickým fenotypem jedinců s dědičnými poruchami reparace DNA. Inaktivace GGR má za následek Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 a 278780; DiGiovanna a Kraemer, 2012), která je charakterizována {9} a 2násobným rizikem fotosenzitivity rakoviny kůže. Neurodegenerace, zpomalení růstu a multisystémové onemocnění bez rakoviny kůže jsou pozorovány u Cockaynova syndromu (CS; MIM 216400 a 133540). Pacienti s CS mají selektivní genetický defekt v TCR, který brání zpracování RNAPII zastaveného poškozením DNA (Karikkineth et al., 2017; Nakazawa et al., 2020; Nakazawa et al., 2012; Ribeiro et al., 2018; Tufegdˇzi´ c Vidakovi´c et al., 2020). Mutations in essential ICL repair genes cause FA (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390, and 613951), which is characterized by anemia, skeletal abnormalities , orgánové malformace a genomová nestabilita (Auerbach, 2009). RoleERCC1-XPF při opravě ICL je podtržen existencí mutací v XPF, které vedou ke vzniku fenotypu FA (Bogliolo et al., 2013; Ceccaldi et al., 2016; Kashiyama et al., 2013). Dědičné defekty při opravě DSB způsobují širokou škálu poruch spojených s radiosenzitivitou, predispozicí k rakovině, imunodeficiencí a neurodegenerací (Helfricht et al., 2020; McKinnon a Caldecott, 2007).

Poruchy z nedostatku opravy DNA jsou vzácné a vyskytují se s odhadovanou frekvencí ~ 1 na 200000 živě narozených po celém světě pro XP, CS a FA. Dosud však byly popsány pouze dvě zprávy o jedincích s bialelickými mutacemi ERCC1 (MIM 126380) (Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Oba jedinci vykazovali rysy odpovídající CS a zemřeli ve 14 měsících a 2,5 letech. První a nejvážněji postižený jedinec (165TOR) nesl na jedné alele předčasný stop kodon (Q158X) a na druhé F231L missense variantu (Jaspers et al., 2007). Druhý jedinec (CS20LO) byl homozygotní pro F231L missense variantu (Kashiyama et al., 2013). Buňky od obou jedinců vykazovaly citlivost na poškození DNA indukované UV zářením a zvláště 165TOR byl také mírně citlivý na činidla indukující ICL. Oba jedinci zemřeli v raném dětství (1–2 roky; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Třetí jedinec (XP202DC) s bialelickými mutacemi ERCC1, který zemřel ve věku 37 let, je citován v abstraktu setkání (Imoto, K., et al. 2007. Pacienti s defekty v interagujících nukleotidových excizních opravných proteinechERCC1nebo XPF vykazují xeroderma pigmentosum s pozdní závažnou neurologickou degenerací. [Abstrakt] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Tento jedinec byl heterozygotní pro nesmyslnou mutaci (K226X) a sestřihovou mutaciERCC1. Podrobný popis fenotypu není k dispozici a dopad těchto mutací ERCC1 není znám.

Fenotyp dvou výše uvedených jedinců je závažnější, než se očekává od samotného deficitu NER, což je v souladu se zapojením ERCC1-XPF do více drah opravy DNA. V souladu s tím myši ERCC1 nebo XPF-KO vykazovaly vysokou embryonální letalitu a zkrácenou délku života a zemřely v důsledku těžkého selhání jater (McWhir et al., 1993; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997), což není pozorováno u NER deficientních XPA-KO myší (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

V současné studii popisujeme dva sourozence s bialelickými mutacemi ERCC1, kteří mají jedinečný fenotyp malého vzrůstu, fotosenzitivity, progresivního cholestatického onemocnění jater a renální tubulopatie. U obou jedinců došlo k progresivnímu poškození jater a vyžadovali transplantaci jater před dosažením věku 10 let. Funkční studie ukazují, že hladina proteinu v ustáleném stavu ERCC1 a XPF byla dramaticky snížena v buňkách hospitalizovaných pacientů a knock-in epiteliálních buňkách nesoucích missense variantu nalezenou u pacientů. Kromě toho mutantní protein ERCC1 interagoval pouze slabě s jinými opravnými proteiny NER a ICL. Uvádíme nový případ nedostatku ERCC1, který silně ovlivňuje NER a má značný dopad na opravu ICL, což společně vede k jedinečnému fenotypu kombinujícímu malý vzrůst, fotosenzitivitu a progresivní játra adysfunkce ledvin.

Výsledek

Dva sourozenci s fotosenzitivitou, nízkým vzrůstem a progresivní dysfunkcí jater a ledvin

Sourozenci 1 (PV50LD; obr. 1 A) je 13 let a je nejstarším ze tří sourozenců zdravých, nepříbuzných rodičů smíšeného etnika včetně původního australského, maltského a anglo-keltského původu. Během těhotenství měla její matka přechodnou dilatační kardiomyopatii, která se po porodu vyřešila. Narodila se ve 39. týdnu těhotenství a její porodní váha byla 1,9 kg (Z=−3,8), délka 44 cm (Z=−2,44) a obvod hlavy 29,5 cm (Z {{ 17}} -3,8). V dětství měla slabý růst a ve věku 18 měsíců u ní byla zjištěna dysfunkce jater s převážně cholestatickým vzorem. Ultrazvuk jater a magnetická rezonanční cholangiopankreatografie byly normální. Jaterní funkce progresivně klesala, jak je zřejmé z progresivního zvýšení hladiny -glutamyltransferázy (GGT), alanintransaminázy (ALT) a bilirubinu (obr. S1, A–C). Při biopsii jater (ve věku 3,5 roku) lobulární parenchym vykazoval variace v morfologii jádra hepatocytů, s některými mnohem většími jádry a buňkami s dvojitými jádry (obr. S1 D) do oblastí, kde mají buňky malá, nevýrazná jádra. Tam byla mírná portální fibróza a mírná fibrózní portální expanze a mírný fokální zánět rozhraní bez duktopenie nebo periduktální fibrózy (obr. S1 E).

Prodělala velké množství recidivujících infekcí včetně tonzilitidy, planých neštovic, onemocnění rukou, slintavky a kulhavky, zápalu plic, bronchitidy a opakujících se epizod horeček, bolestí břicha a světlé stolice bez zjištěné příčiny. Imunologická vyšetření neprokázala žádnou imunodeficienci. Objevily se u ní epizody oční a kožní fotosenzitivity. Ve věku 6 let byla zjištěna renální dysfunkce s rysy naznačujícími dysfunkci proximálních tubulů charakterizovanou albuminurií (subnefrotický rozsah) a hyperkalciurií. Její funkce ledvin kolísala s přerušovanými epizodamiakutní poškození ledvin, progresivnípoškození ledvinse zvyšujícími se hladinami kreatininu (obr. S1 F) a minimální odpovědí na inhibici acetylcholinesterázy. Ultrazvuk ledvin ukázal malouledvinyse zvýšenou echogenitou a sníženou kortikomedulární diferenciací. Funkční testy plic ukázaly mírné až středně těžké restriktivní plicní onemocnění.

Vývojové mezníky byly normální, ale ve školním věku byly patrné určité potíže s učením bez známek regrese. Zrak a sluch byly normální. Růst zůstal i přes doplňkové krmení velmi pomalý. Byla relativně stabilní až do věku 9,5 roku, kdy vykazovala známky jaterní dekompenzace s progresivně stoupající hladinou bilirubinu (obr. S1 C) a mezinárodním normalizovaným poměrem. Ve věku 9 let a 10 měsíců podstoupila ortotopickou transplantaci jater. Po transplantaci jater se její tubulopatie stabilizovala, i když její sérový kreatinin nadále roste pomaleji (obr. S1 F). Je klinicky stabilní. Ve věku 12 let byla diagnostikována ovariální insuficience. Magnetická rezonance mozku (MRI) ve věku 12 let prokázala mírnou cerebrální atrofii se střední cerebelární atrofií a mírnou atrofií mozkového kmene. Při posledním hodnocení (ve věku 13,5 let) byl růst pomalý (váha 22,4 kg [Z=−6,08] a výška 134,7 cm [Z=−3,72]). Měla velmi štíhlou postavu se slabým objemem svalů a nedostatkem podkožního tuku. Na místech vystavených slunci se u ní objevily pihy (obr. 1 A). Měla mírně hluboko posazené oči a vlasy na temeni byly tenké. Nebyly zjištěny žádné abnormality radiálního paprsku. Neurologické vyšetření ukázalo mírnou slabost, minimální ataxii a utlumené reflexy.

Sourozenci 2 (PV46LD; obr. 1 A) je 11 let, mladší sestra sourozenci 1. Těhotenství bylo komplikováno placentou previa a přechodnou mateřskou kardiomyopatií a sourozenec 2 se narodil ve 35. týdnu gestace s porodní hmotností 1,79 kg (třetí centil), délka 45 cm (50. centil) a přední obvod 29 cm (méně než třetí centil). Měla nedostatek podkožního tuku a podobné rysy obličeje jako její starší sourozenec. Vykazovala neprospívání v prvním roce života a poškození jater od věku 2 let s významně zvýšenými hladinami GGT, ALT a bilirubinu (obr. S1, A–C). Biopsie jater ve věku 6 let prokázala poškození intrahepatálních žlučovodů, což vedlo k periduktální fibróze. Stejně jako u jaterní biopsie od její sestry byl pozorován střední počet dvoujaderných hepatocytů, některé s velkými jádry a velkými jadérky.

Měla epizody oční a kožní fotosenzitivity. Měla nálezy renální tubulopatie s mírným poškozením ledvin s progresivně se zvyšujícími hladinami kreatininu (obr. S1 F). Ultrazvuk ledvin ukázal malouledvinys nefrokalcinózou. Vývojové mezníky byly normální, ale ve školním věku bylo diagnostikováno lehké mentální postižení (IQ 66). Došlo k pomalému pokroku s neurovývojovými milníky a bez jednoznačné regrese. Zrak a sluch byly normální. Poškození jater bylo progresivní a ve věku 8 let podstoupila transplantaci jater. MRI mozku ve věku 5 let bylo normální, ale opakované MRI v 10 letech ukázalo středně těžkou cerebelární atrofii a mírnou cerebrální atrofii. Ve věku 11 let ukázalo měření estrogenu, folikuly stimulujícího hormonu a luteinizačního hormonu vzor naznačující ovariální nedostatečnost. Při posledním hodnocení ve věku 11 let byl růst pomalý (váha 20 kg [Z=−3,89] a výška 120,7 cm [Z=−3,17]). Měla velmi hubenou postavu s minimem podkožního tuku a slabým objemem svalů, familiárními rysy obličeje, mírně hluboko posazenýma očima a pihami na místech vystavených slunci (obr. 1 A). Neměla žádné abnormality radiálních paprsků. Neurologické vyšetření prokázalo mírnou slabost s mírnou ataxií a chybějícími reflexy.

Molekulární analýza identifikuje nové bialelické mutace ERCC1

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>T missense varianta byla potvrzena Sangerovým sekvenováním u obou postižených sourozenců (obr. 1 B). Celogenomové sekvenování odhalilo deleci v exonu 4 na mateřské alele (hg19: chr19:45,922,224- 45,924,375; obr. S2 B), která byla potvrzena srovnávací kvantitativní PCR (qPCR) exonu 4 a exonu 5 ERCC1 u obou sourozenců a matky (obr. 1, C a D). Delece, o které se předpokládá, že je nulová alela, nebyla detekována ani u otce, ani ve čtyřech negativních kontrolních vzorcích (obr. 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) se nachází v doméně (HhH)2 (obr. 1 E), missense varianta (p.R156W) se nachází v centrální doméně ERCC1 a je v těsné blízkosti vazebné kapsy XPA (110–154 aa) ERCC1 (obr. 1E). Strukturální analýza centrální domény ERCC1 odhalila úzkou hydrofobní kapsu ve tvaru V, která váže krátký motiv (67–80 aa) přítomný v XPA (obr. 1 F; Tsodikov et al., 2007). Aminokyseliny, které vystýlají kapsu vázající XPA v ERCC1 (obr. 1 F), jsou důležité pro NER, ale nepostradatelné pro jiné ERCC1-závislé opravné dráhy (Orelli et al., 2010). Zbytek R156, který je u pacientů substituován, se nachází těsně pod kapsou vázající XPA a tvoří solný můstek s protilehlou aminokyselinou D129 (obr. 1 F). Náhrada R156W proto pravděpodobně ovlivňuje stabilitu kapsy na vazbu XPA. Je možné, že tato substituce také oslabuje interakci mezi centrální doménou ERCC1 a nukleázovou doménou XPF (Jones et al., 2020), a předpovídali bychom, že by to mohlo vést k mírné až střední destabilizaci heterodimerního rozhraní, což má za následek sníženou stabilitu proteinu.

Fibroblasty PV46LD a PV50LD vykazují závažný defekt NER Charakteristickým znakem deficitu NER je silná citlivost na UV-C záření. Abychom řešili dopad deficitu ERCC1 na funkci NER, získali jsme primární fibroblasty z kožních biopsií obou postižených sourozenců. Aby bylo možné klonogenní testy přežití, jsme imortalizovali buňky PV50LD zavedením hTERT (obr. S3 A). Jako kontrola jsme pomocí CRISPR-Cas9 vytvořili plné ERCC1-KO buňky v RPE1-hTERT buňkách (obr. 2 A). Klonogenní test přežití UV-C ukázal, že buňky PV50LD-hTERT jsou hypersenzitivní na ozáření UV-C, i když ne ve stejném rozsahu jako buňky plné ERCC1-KO (obr. 2 B), což naznačuje závažný defekt v NER.

UV-indukované léze DNA, se kterými se setkáme během transkripce, jsou opraveny pomocí TCR, což lze měřit pomocí testu obnovy syntézy RNA (RRS) (Nakazawa et al., 2010). Měřili jsme RRS ve 48BR fibroblastech (WT), fibroblastech pacientů a jako kontrolu jsme zahrnuli primární fibroblasty s deficitem XPA (XP1PD). Značení nascentních transkriptů inkorporací 5-ethynyl-uridinu ukázalo silný UV-indukovaný pokles nascentních transkriptů ve všech buněčných liniích 3 hodiny po UV-C. Zatímco 48BR plně obnovil transkripci během 18 hodin po ozáření UV-C, oba pacientské fibroblasty se obnovily ještě méně než NER-deficientní XP-A pacientské buňky (obr. 2, C a D), což naznačuje, že TCR za těchto podmínek prakticky chybí.

Ke zkoumání aktivity GGR jsme měřili neplánovanou syntézu DNA (UDS) v nedělících se buňkách (Nakazawa et al., 2010). Za tímto účelem byly primární fibroblasty lokálně ozářeny UV-C světlem s následným pulzním značením thymidinovým analogem 5-ethynyl-deoxyuridinem (EdU) pro měření opravy. Jasná inkorporace EdU byla detekována v buňkách 48BR v místech lokálního poškození DNA vyvolaného UV zářením. Ve fibroblastech pacienta však byly detekovatelné pouze velmi nízké hladiny inkorporace EdU na podobných úrovních jako ve fibroblastech s deficitem XPA (XP1PD; obr. 2, E a F). Hladiny UDS v buňkách PV46LD a PV50LD byly srovnatelné nebo dokonce nižší než hladiny naměřené v dříve popsaných ERCC1-deficientních 165TOR (Jaspers et al., 2007) a CS20LO (Kashiyama et al., 2013). buňky, které jsme zařadili paralelně (obr. 2 G a obr. S3 B). Důležité je, že reexprese ERCC1 označeného menu v obou fibroblastech plně zachránila začlenění EdU (obr. 2, E a F; a obr. S3 C), což potvrzuje, že silný defekt UDS je způsoben nedostatkem ERCC1. Také jsme získali primární fibroblasty od rodičů, které vykazovaly normální UDS v místech lokálního poškození UV zářením (obr. 2 H), což naznačuje, že příslušný heterozygotní defekt ERCC1 u rodičů je plně kompenzován alelou WT.

Fibroblasty PV46LD a PV50LD mají velmi nízké hladiny proteinů ERCC1 a XPF

NER zahrnuje vysoce koordinované a sekvenční sestavení komplexů opravy DNA, během kterého dochází k náboru XPA po směru TFIIH, ale před ERCC1-XPF (Volker et al., 2001). Abychom se zabývali tím, do jaké míry pacientské fibroblasty stále podporují sestavení komplexu NER, lokálně jsme fibroblasty ozářili UV-C a monitorovali nábor několika základních proteinů NER imunofluorescenčním značením (obr. 3 A, kvantifikace a obr. S3 D). Jasný nábor TFIIH, XPA a ERCC1 v místech lokálního poškození DNA indukovaného UV zářením byl detekován u buněk 48BR, zatímco buňky XP1PD s deficitem XPA nedokázaly získat ERCC1, jak bylo popsáno dříve (obr. 3 A a obr. S3 D; Volker et al., 2001). Obě buňky PV46LD a PV50LD vykazovaly normální nábor TFIIH a XPA, zatímco nábor ERCC1 do míst lokálního poškození DNA vyvolaného UV zářením byl nezjistitelný (obr. 3 A a obr. S3 D).

Ztráta lokalizace ERCC1 by mohla být způsobena selháním náboru ERCC1, obecným snížením hladin proteinu ERCC1 nebo kombinací obou. Analýza Western blot skutečně odhalila, že hladiny ERCC1 a XPF v ustáleném stavu byly dramaticky sníženy v buňkách PV46LD a PV50LD (obr. 3 B). Reziduální exprese ERCC1 však byla stále detekována ve srovnání s úplnými buňkami ERCC1-KO (obr. 3 B). Snížení hladin proteinu ERCC1 a XPF v buňkách PV46LD bylo velmi podobné sníženým hladinám detekovaným buď v buňkách CS20LO nebo 165TOR (obr. 3 C a obr. S3, E a F), což naznačuje, že závažnější fenotyp u jedince z ze kterého byly tyto buňky odvozeny, není způsobeno silnějším dopadem na stabilitu proteinu. V souladu s našimi výsledky UDS jsme detekovali normální expresi ERCC1 a XPF v buňkách od rodičů, což ukazuje na kompenzaci alelou WT (obr. 3 D). Imunofluorescenční značení potvrdilo, že hladiny proteinů ERCC1 a XPF byly vážně sníženy, zatímco buňky od rodičů byly nerozeznatelné od buněk WT (obr. 3 E). Kvantifikace dat Western blot ukazuje, že hladiny proteinu ERCC1 byly sníženy na ~20 procent fibroblastů hospitalizovaných pacientů, což také vedlo k podobně sníženým hladinám hladin XPF (~20 procent; obr. 3F).

Knock-in varianty R156W missense vede k nestabilitě proteinu ERCC1-XPF a vážnému defektu NER

Je lákavé spekulovat, že nízké hladiny proteinu v ustáleném stavu ERCC1-XPF a silný defekt NER ve fibroblastech pacienta jsou způsobeny substitucí aminokyseliny R156W v ERCC1. Vzhledem k tomu, že postižení jedinci jsou sourozenci, nemůžeme vyloučit, že k tomuto fenotypu mohou přispívat i jiné genetické rysy sdílené mezi nimi.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), což bylo potvrzeno Sangerovým sekvenováním u dvou jednotlivých klonů (obr. 4 A). Missense mutace způsobila závažné snížení hladin proteinu ERCC1 a XPF v obou klonech KI (klony 2–17 a 2–51; obr. 4 B a obr. S4, A a B). Kvantifikace dat Western blot ukázala, že hladiny proteinu ERCC1 a XPF byly téměř tak nízké jako v buňkách ERCC1-KO (obr. 4 C). Tato zjištění ukazují, že substituce aminokyselin R156W má silný dopad na stabilitu ERCC1.

Abychom dále zjistili, že defekt NER ve fibroblastech pacienta je způsoben substitucí aminokyseliny R156W v ERCC1, měřili jsme aktivitu TCR monitorováním restartu transkripce po UV ozáření. Zatímco rodičovské buňky RPE1-hTERT vykazovaly normální restart 18 hodin po UV, oba klony R156W-KI vykazovaly silný defekt TCR srovnatelný s úplnými buňkami ERCC1-KO (obr. 4, D a E). Podobně experimenty UDS odhalily normální aktivitu GGR v rodičovských buňkách RPE1-hTERT, která byla výrazně snížena pod 10 procent jak u klonů R156W-KI, tak u buněk ERCC1-KO (obr. 4, F a G) . Nakonec jsme změřili UV senzitivitu jednoho klonu R156W-KI (2–51) ve srovnání s fibroblastem PV50LD pacienta imortalizovaným hTERT. Buňky R156W-KI vykazovaly silný fenotyp citlivý na UV záření, i když ne tak citlivý jako buňky plné ERCC1-KO (obr. 4 H). Je zajímavé, že fenotyp R156W-KI citlivý na UV záření byl velmi podobný fenotypu fibroblastů pacientů s PV50LD-hTERT. Tato zjištění ukazují, že nízké hladiny proteinu ERCC1-XPF a silný defekt NER jsou přímým důsledkem substituce aminokyseliny R156W v ERCC1.

Substituce ERCC1R156W způsobuje částečnou cytoplazmatickou lokalizaci

Pacientské fibroblasty a KI buňky vykazují dramaticky snížené hladiny proteinů a silně sníženou aktivitu NER. Dále jsme chtěli prozkoumat, zda je defekt NER způsoben pouze sníženými hladinami proteinu ERCC{0}}XPF, nebo zda mutantní protein ERCC1R156W má sníženou aktivitu jako endonukleáza nebo v NER.

Abychom to vyřešili, vygenerovali jsme buňky ERCC1-KO pomocí CRISPR Cas9 v buňkách U2OS vybavených systémem Flp-In/T-Rex. Pomocí místně řízené rekombinace založené na Flp jsme zacílili cDNA kódující GFP-značený ERCC1WT nebo ERCC1R156W do genomového místa rozpoznání Flp (FRT), abychom umožnili indukovatelnou expresi ze silného virového promotoru. Analýza Western blot ukázala, že ERCC1WT a ERCC1R156W byly exprimovány na podobných úrovních a že exprese kteréhokoli proteinu zachránila snížené hladiny proteinu XPF pozorované v buňkách ERCC1-KO (obr. 5 A). Tyto buňky jsou proto vynikajícím modelovým systémem pro odlišení specifického dopadu substituce ERCC1R156W, když je exprimována na hladinách WT, od dopadu nižší exprese ERCC1 ve fibroblastech pacienta a epiteliálních buňkách KI.

Předchozí studie ukázaly, že missense mutace v XPF mohou způsobit chybnou lokalizaci ERCC1-XPF v cytoplazmě (Ahmad et al., 2010). V souladu s tím jsme také detekovali, že ~40 procent proteinového poolu ERCC1R156W bylo chybně lokalizováno do cytoplazmy, což bylo pouze ~15 procent v buňkách exprimujících ERCC1WT (obr. 5, B a C). Tato chybná lokalizace ERCC1 také zvýšila frakci cytoplazmatického XPF (obr. 5, B a C), což ukazuje, že ERCC1R156W může být částečně špatně sbalený.

Abychom tuto možnost otestovali, provedli jsme imunoprecipitační experimenty na ERCC1WT-GFP a ERCC1R156W-GFP následované kvantitativní hmotnostní spektrometrií bez značení (MS), abychom zmapovali diferenciální interaktory dvou proteinů ERCC1. Důležité je, že kvantitativní MS potvrdila, že byla stažena stejná množství proteinu ERCC1WT-GFP a ERCC1R156W-GFP (obr. 5 D). Je překvapivé, že interaktom ERCC1R156W byl obohacen o proteiny tepelného šoku (HSP), zejména z rodiny HSPA, zatímco interakce s XPF byla kvantitativně snížena ve srovnání s ERCC1WT (obr. 5 D). Proteiny HSPA jsou chaperony skládající se z proteinů, které zabraňují agregaci chybně složených proteinů (Stetler et al., 2010). Koimunoprecipitační (Co-IP) experimenty skutečně potvrdily, že ERCC1R156W-GFP silně interagoval s HSPA4 ve srovnání s ERCC1WT (obr. 5 E), což naznačuje částečné chybné složení ERCC1R156W.

Abychom se zabývali tím, do jaké míry je ERCC1R156W-XPF stále aktivní jako endonukleáza, vyčistili jsme rekombinantní komplex z hmyzích buněk Sf9 (obr. S4 C). Náš dříve zavedený postup zahrnuje krok gelové filtrace, který nám umožňuje posoudit, zda je ERCC1-XPF v dimerním nebo agregovaném stavu (obr. 5 F, frakce 2 a 1). Výtěžek rekombinantního komplexu ERCC1R156W XPF byl nižší a vykazoval vyšší hladinu agregovaného proteinu. Kromě toho jsme také zaznamenali snížení frakce heterodimerního proteinu ve srovnání s ERCC1WT-XPF (obr. 5 F). Nicméně heterodimerní rekombinantní ERCC1R156W-XPF ve frakci 2 byl plně aktivní, když byl inkubován s modelem DNA substrátu s kmenovou smyčkou, zatímco katalyticky neaktivní ERCC1-XPFD687A, zahrnutý jako negativní kontrola, postrádal aktivitu řezu (obr. 5 G). Tato zjištění naznačují, že ERCC1R156W-XPF je částečně chybně sbalený a chybně lokalizovaný, ale proteinová frakce, která se správně sbalí, je stále aktivní jako endonukleáza.

Mutantní protein ERCC1R156W nedokáže účinně interagovat s hlavními faktory NER

Dále jsme se zabývali tím, jak substituce ERCC1R156W ovlivnila NER pomocí rekonstituovaných buněk ERCC1-KO. Protože substituce R156W je umístěna těsně pod kapsou vázající XPA v ERCC1 (obr. 1 F), zeptali jsme se, zda ERCC1R156W může stále interagovat s proteiny NER v reakci na UV záření. Abychom to otestovali, imunoprecipitovali jsme ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP nebo GFP fúzovaný s jaderným lokalizačním signálem (GFP-NLS) jako kontrolu z buněk ozářených UV zářením a následně provedli MS bez označení. Porovnáním ERCC1-GFP s GPF-NLS jsme identifikovali konstitutivní i UV-indukované interaktory ERCC1. Naše analýza odhalila, že jak ERCC1WT, tak ERCC1R156W interagovaly s XPF a ICL reparačními specifickými skafoldovými proteiny SLX4 a SLX4IP, i když kvantitativně sníženy v buňkách exprimujících ERCC1R156W (obr. 6, A a B). Je překvapivé, že interakce indukovaná UV zářením s TFIIH podjednotkou XPB v buňkách ERCC1WT byla zcela ztracena v buňkách ERCC1R156W (obr. 6, A a B). Co-IP experimenty potvrdily, že ERCC1R156W se nepodařilo spojit s TFIIH nebo XPA v reakci na UV záření, zatímco robustní interakce byly detekovány po stažení ERCC1WT (obr. 6 C a obr. S4, D a E).

Nábor ERCC1-XPF do komplexů NER je plně závislý na XPA (Volker et al., 2001), což vyvolává otázku, zda je ERCC1R156W stále rekrutován do míst poškození DNA vyvolaného UV zářením. Abychom to vyřešili, monitorovali jsme nábor ERCC1-GFP do lézí DNA indukovaných UV zářením pomocí zobrazování živých buněk. Za tímto účelem byly buňky ozářeny UV-C (266-nm) laserem, který spustil rychlý nábor ERCC1WT-GFP během prvních 60 s po ozáření a dosáhl plató kolem 120 s (obr. 6, D a E). Na rozdíl od toho, pouze velmi slabý nábor ERCC1R156W-GFP mohl být detekován po UV-C záření za stejných podmínek (obr. 6, D a E). Tato zjištění naznačují, že neschopnost ERCC1R156W interagovat s XPA vážně omezuje jeho spojení s komplexem NER.

Naše zjištění v rekonstituovaných buňkách ERCC{0}}KO naznačují, že ERCC1R156W stále podporuje zbytkovou (~40 procent) opravnou aktivitu, když je exprimován na podobných úrovních jako ERCC1WT. Abychom se pokusili změřit zbytkovou opravu v primárních fibroblastech PV46LD a PV50LD, které vykazovaly výrazně sníženou expresi mutantního proteinu ERCC1R156W, provedli jsme experimenty UDS, ve kterých jsme dovolili buňkám začlenit EdU po delší dobu (4 hodiny), abychom zachytili zbytkovou opravu. . Zatímco UDS byl stále pod ~ 10 procent v XPA-deficientních XP1PD buňkách, v PV46LD a PV50LD buňkách UDS za těchto podmínek vzrostl z ~ 10 procent na ~ 20 procent UDS (obr. 6 J a obr. S5 A). Tato zjištění ukazují, že mutantní protein ERCC1R156W, exprimovaný v nízkých hladinách v buňkách pacienta, podporuje zbytkovou aktivitu NER, což pravděpodobně vysvětluje mírné klinické rysy podobné XP pozorované u obou sourozenců. Za těchto podmínek jsme také detekovali reziduální UDS v dříve popsaných ERCC1- deficitních 165TOR (Jaspers et al., 2007) a CS20LO (Kashiyama et al., 2013) buňkách v ještě vyšších hladinách, než jaké byly zjištěny v PV46LD a PV50LD buňkách (obr. 6 J a obr. S5 A).

Vliv ERCC1R156W na opravu ICL

Během opravy ICL protein skeletu SLX4 rekrutuje ERCC1-XPF, aby provedl odháčkovací řezy, které umožňují následnou opravu. Naše analýza MS odhalila, že ERCC1R156W stále interagoval s SLX4, i když na nižších úrovních ve srovnání s ERCC1WT (obr. 6, A a B). Co-IP experimenty skutečně potvrdily silnou interakci ERCC1WT s SLX4, která nebyla ovlivněna UV zářením, zatímco interakce s ERCC1R156W byla silně snížena (obr. 7 A). Abychom se zabývali tím, zda tato snížená interakce ovlivnila nábor ERCC1 do ICL, lokálně jsme ozářili buňky UV-A laserem (365 nm) v přítomnosti trioxsalenu, což je derivát psoralenu, který tvoří ICL po ozáření UV (Velimezi et al. , 2018). Lokální ozařování UV-A laserem spustilo nábor endogenního FANCD2 pouze v buňkách senzibilizovaných trioxsalenem, což dokazuje, že ICL byly za našich podmínek indukovány (obr. S5 B). Mohli jsme detekovat silný nábor GFP-ERCC1WT-GFP do místních ICL, zatímco nábor ERCC1R156W byl mnohem slabší (obr. 7, B a C), což naznačuje, že snížená interakce s SLX4 také snižuje efektivitu, s jakou je ERCC1R156W rekrutován do ICL. Nicméně testy klonogenního přežití po expozici agens indukujícímu ICL mitomycin C (MMC) ukázaly, že ERCC1R156W zachránil hypersenzitivitu buněk ERCC1-KO na MMC, i když o něco méně než ERCC1WT (obr. 7 D). Tyto experimenty ukazují, že mutantní protein ERCC1R156W podporuje opravu ICL blízko hladinám WT, když je mutantní protein exprimován téměř normálním hladinám.

Abychom zjistili, zda fibroblasty pacientů s PV46LD a PV50LD, které vykazovaly podstatně sníženou expresi ERCC1R156W, stále podporovaly účinnou opravu ICL, provedli jsme test poškození chromozomů indukovaný MMC. Tato metoda měří zlomy chromozomů indukované MMC v buňkách metafáze způsobené nedostatkem opravy ICL. Zatímco buňky 48BR (WT) akumulovaly velmi málo zlomů po MMC, naměřili jsme významné zlomy chromozomů vyvolané MMC v buňkách WK8103 pocházejících z Fanconiho pacienta (Poll et al., 1984; obr. 7 E). Jak PV46LD, tak PV50LD vykazovaly intermediární fenotyp se zvýšenou tvorbou zlomů v reakci na MMC, i když ne v takovém rozsahu jako Fanconiho buňky (obr. 7 E). V souladu s tím byly buňky PV50LD-hTERT a buňky RPE1-hTERT R156W-KI citlivé na MMC v testech klonogenního přežití, zatímco buňky VU121F-hTERT s deficitem FANCF (Joenje et al., 1997) a zejména ERCC{ {24}} KO buňky byly hypersenzitivní na MMC (obr. 7 F). Závěrem lze říci, že nižší exprese ERCC1R156W a snížená interakce s SLX4 mají značný dopad na opravu ICL, ačkoliv buňky pacientů nejsou zdaleka tak citlivé jako Fanconiho nebo plné ERCC1-KO buňky. To pravděpodobně vysvětluje, proč u těchto dvou sourozenců nejsou patrné žádné rysy podobné FA.

Vliv ERCC1R156W na opravu DSB

Vzhledem k úloze ERCC1-XPF při opravách DSB jsme také řešili, do jaké míry ERCC1R156W stále podporuje tento proces opravy. Za tímto účelem jsme provedli zobrazování živých buněk po ozáření UV-A laserem v buňkách senzibilizovaných BrdU za účelem vytvoření lokálních DSB (Lukas et al., 2003). Nábor endogenního XRCC4 mohl být detekován v místech lokálního ozařování UV-A laserem až po BrdU senzibilizaci (obr. S5 C), což ukazuje, že DSB byly v našich podmínkách indukovány. Nábor ERCC1WT-GFP na místa DSB byl jasně detekován, zatímco u ERCC1R156W to bylo mnohem slabší (obr. 8, A a B). Testy klonogenního přežití po ionizujícím záření (IR) však neukázaly žádný rozdíl mezi buňkami ERCC1-KO rekonstituovanými buď ERCC1WT nebo ERCC1R156W (obr. 8 C), což naznačuje, že mutantní protein ERCC1 podporuje opravu DSB.

Abychom to také řešili v buňkách pacienta, provedli jsme testy klonogenního přežití ve fibroblastech imortalizovaných hTERT po expozici zvyšujícím se dávkám IR. Fibroblasty s deficitem XRCC4 (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) byly jasně citlivé na IR již při nejnižší dávce (2 Gy). Buňky PV50LD-hTERT však nebyly příliš citlivé při 2 Gy a pouze vykazovaly zvýšenou citlivost při vyšších dávkách (obr. 8 D). Ve skutečnosti plné buňky ERCC1-KO a buňky R156W-KI vykazovaly pouze okrajovou citlivost na IR (obr. S5 D), což naznačuje malý příspěvek ERCC1-XPF k ochraně buněk před IR. Další metodou pro hodnocení opravné kapacity DSB je sledování rozlišení IR-indukovaných ložisek H2AX v čase. Jak 48BR, tak pacientské fibroblasty vykazovaly normální clearance ložisek H2AX do 24 hodin po ozáření fyziologickou dávkou 2 Gy (obr. 8, E a F; a obr. S5 E). Avšak ošetření buněk 48BR inhibitorem DNA-dependentní proteinkinázy (DNA-PK) plně potlačilo rozlišení ložisek H2AX ve všech analyzovaných časových bodech (obr. 8, E a F). Tato zjištění naznačují, že buňky PV46LD a PV50LD jsou plně schopné opravovat DSB při nízké zátěži poškození.