Malé, ale mocné – Exosomy, noví mezibuněční poslové v neurodegeneraci, část 1

Jednoduché shrnutí:

Exosomy jsou biologické nanočástice, které byly nedávno rozpoznány jako mezibuněční poslové. Obsahují náklad lipidů, proteinů a RNA. Mohou přenášet svůj obsah nejen do buněk v okolí, ale i do buněk na dálku.

Exozomy jsou nově objeveným nástrojem mezibuněčné komunikace, který dokáže uvolňovat malé a jemné váčky do okolních buněk a doručovat do okolních buněk některé proteiny, signální látky a další látky. Tyto látky mohou pomoci buňkám změnit jejich stav a dokonce ovlivnit růst, vývoj, metabolismus a další aspekty jiných buněk. V posledních letech studie prokázaly, že exozomy hrají důležitou roli ve funkci lidského mozku, zejména při udržování a zlepšování paměti.

Za prvé, exosomy mohou podporovat přenos signálu mezi neurony. Přenos informací mezi neurony je jednou z nezbytných podmínek pro normální fungování nervového systému a exosomy hrají roli poslů, kteří mohou zrychlit přenos informací mezi neurony, a tím zlepšit kognici a paměť mozku.

Za druhé, exosomy mohou také regulovat metabolismus neuronů. V procesu neuronů produkujících a uvolňujících exozomy se účastní velké množství metabolických procesů, což podporuje rovnováhu a regulaci buněčného metabolismu. Tyto procesy mohou nejen zvýšit schopnost neuronů, ale také pomoci odstraňovat metabolický odpad a škodlivé molekuly a udržovat mozkové buňky zdravé.

A konečně, exosomy mohou také pomoci neuronům opravit poškození. Mnoho proteinů a nukleových kyselin nesených exozomy je prospěšných pro buněčný růst, opravu a regeneraci a může podporovat opravu a regeneraci neuronů, čímž zlepšuje schopnost přežití mozkových buněk a posiluje paměťová centra a kognitivní schopnosti.

Stručně řečeno, existuje úzký vztah mezi exosomy a pamětí. Paměť dětí můžeme změnit tím, že začneme dietou. Aktivní vedení dětské stravy a konzumace více potravin bohatých na prospěšné složky, jako jsou mastné kyseliny, bílkoviny a vitamíny, může podpořit produkci a uvolňování exozomů, a tím pomoci dětem zlepšit jejich schopnosti učení a paměti. Dětem mohou být také poskytnuty některé hry a cvičení na procvičování mozku, které zpochybní a procvičí jejich myšlení, stimulují potenciál exosomů a hrají lepší roli. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche vychází z různých aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku mnoha způsoby.

Kliknutím na možnost Know zlepšíte krátkodobou paměť

Tato jedinečná schopnost jim umožňuje modulovat fyziologii recipientních buněk. V mozku hrají exozomy roli při neurodegenerativních onemocněních, jako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a amyotrofická laterální skleróza.

Abstraktní:

Exozomy endozomálního původu jsou jednou třídou extracelulárních vezikul, které jsou důležité v mezibuněčné komunikaci. Exozomy jsou uvolňovány všemi buňkami v našem těle a jejich náklad sestávající z lipidů, proteinů a nukleových kyselin má stopu odrážející jejich rodičovský původ.

Exosomální náklad má sílu modulovat fyziologii recipientních buněk v blízkosti uvolňujících buněk nebo buněk na dálku. Využití potenciálu exosomů závisí na čistotě přípravy exozomů.

Proto bylo vyvinuto mnoho metod pro izolaci a my poskytujeme stručné shrnutí několika metod. Navzdory izolaci vyvolané hematoencefalickou bariérou nejsou buňky v CNS imunní vůči exosomálním intruzivním vlivům. Neurony i gliare uvolňují exosomy, často způsobem závislým na aktivitě.

Je uveden stručný popis exosomů uvolňovaných různými buňkami v mozku a jejich role při udržování homeostázy CNS. Charakteristickým znakem několika neurodegenerativních onemocnění je akumulace proteinových agregátů. Nedávné studie implikují roli mezibuněčného komunikátoru exozomů v šíření špatně složených proteinů, což znamená šíření patologie.

V tomto přehledu diskutujeme o potenciálním přínosu exozomů v progresi Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a amyotrofické laterální sklerózy.

Pochopení přínosu exozomů v patogenezi neurodegenerace otevírá pole pro použití exozomů jako terapeutických činidel pro dodávání léčiv do mozku, protože exosomy procházejí hematoencefalickou bariérou.

Klíčová slova: exosomy; neurony; gliové buňky; centrální nervový systém (CNS); neurodegenerativní onemocnění;Alzheimerova choroba; Parkinsonova nemoc; amyotrofická laterální skleróza.

1. Úvod a historický pohled

Mezibuněčná komunikace je velmi zajímavá pro embryonální vývoj, regeneraci/náhradu epitelu, gametogenezi a udržování homeostázy.

Pomocí ultrastrukturálních a biochemických studií bylo identifikováno několik mechanismů komunikace mezi buňkami, jako je endocytóza/exocytóza a pohlcování vyčnívajících cytoplazmatických váčků [1–3]. Byl identifikován další hráč, extracelulární vezikuly, ale jejich role v mezibuněčné komunikaci nebyla okamžitě oceněna [4].

Extracelulární vezikuly byly objeveny náhodně během výzkumu uvolňování enzymů asociovaných s plazmatickou membránou, ekto-ATPázy a ekto-50-nukleotidázy do buněčného kultivačního média. V roce 1981 kultivovali spolupracovníci Tramsand normální a neoplastické buněčné linie myšího a lidského původu v médiu bez séra, protože bylo známo, že sérum má katalytickou aktivitu ATPázy a 50-nukleotidázy.

Po odstranění plovoucích buněk a úlomků bylo upravené médium centrifugováno při rychlosti 310,000×g po dobu 90 minut v rotoru Spinco Ti-70 a pelety byly zkoumány pod elektronovým mikroskopem. Byly objeveny dvě populace vezikul obalených extracelulární membránou, jedna s průměrným průměrem mezi 500 a 1000 nm a druhá, menší populace s průměrem ~40 nm.

Tyto vezikuly, původně popsané autory jako „exfoliované vezikuly“, obsahovaly enzymatickou aktivitu 50-50-nukleotidázy i ATPázy. Kromě toho exfoliované vezikuly obsahovaly RNA a fosfolipidy, které byly odlišné od rodičovských buněk a rodičovské plazmatické membrány.

Inkubace exfoliovaných vezikul z C6 gliomových buněk s 32P-předznačenými neuroblastomacelly stimulovala defosforylaci neuroblastomových proteinů se současným uvolňováním volného radioaktivně značeného fosforu (32P).

Tato data prokázala, že exfoliované vezikuly nebyly pouze nosiči buněčného odpadu (enzymů), ale měly fyziologickou funkci. Tram a kolegové vytvořili termín exosomy k popisu „exfoliovaných váčků“ [5] (viz přehledový článek [6] pro extracelulární historii vezikul před rokem 1981). O několik let později dvě výzkumné skupiny nezávisle studovaly osud transferinového receptoru v retikulocytech pomocí elektronové mikroskopie [7–9].

Zralé retikulocyty nevyžadují transferin, takže ylózují transferinové receptory. Obě skupiny pozorovaly, že kultivované retikulocyty uvolňovaly do extracelulárního prostoru malé vezikuly o průměru ~50 nm.

Tyto malé vezikuly obsahovaly nedegradované transferinové receptory. V roce 1987 Johnston a spolupracovníci použili termín exosomy k popisu malých vezikul obsahujících transferinové receptory [10]. Po těchto počátečních letech byl realizován potenciál exosomů jako nových mezibuněčných poslů, kteří mohou modulovat fyziologii cílových buněk.

Je zajímavé, že geneze exozomů je iniciována endocytózou (proces identifikovaný v roce 1883; přehled [3]) v buňkách a uvolňování exozomů do intracelulárního prostoru využívá proces exocytózy. Od jejich počátečního objevu nyní víme, že exosomy jsou podtypem extracelulárních vezikul endocytárního původu s rozsahem velikosti 40–160 nm v průměru [11].

Stopovací studie prokázaly, že makromolekuly jsou endocytovány ve štětinami potažených (tj. klatrinem potažených) invaginacích nebo jamkách na buněčném povrchu. Tyto invaginace se nakonec oddělí od plazmatické membrány a jsou detekovány v cytoplazmě.

Po ztrátě štětin (tj. klatrinu) se endocytované potažené vezikuly vyhladí a spojí se s ranými endozomy, aby se buď rychle recyklovaly zpět na buněčný povrch (recyklace endozomů na obrázku 1) [12], nebo podstoupily zrání za vzniku pozdních endozomů.

Časné a pozdní endozomy fungují jako "třídicí uzly" pro vhodné směrování jejich obsahu: (i) pro retrográdní transport do trans-Golgiho sítě (tj. vyhledávání z endozomu do TGN) [13,14]; (ii) na lysozomy pro degradaci makromolekul nebo jednoduchých produktů pro opětovné použití v buňce [15,16]; a/nebo (iii) pro recyklaci na buněčný povrch prostřednictvím multivezikulárních tělísek [17].

Během dozrávání raných endozomů intonujících endozomy dochází k invaginaci vnitřní endozomové membrány, což vede k tvorbě intraluminálních váčků (nyní označovaných jako exozomy). Specifické makromolekuly, jako jsou cytosolové proteiny, nukleové kyseliny a lipidy, jsou tříděny do vyvíjejících se exozomů.

Pozdní endozomy plné exozomů jsou identifikovány jako multivezikulární tělíska, která migrují směrem k plazmatické membráně. Po fúzi s plazmatickou membránou multivezikulární tělíska uvolňují exozomy do extracelulárního prostoru prostřednictvím procesu exocytózy (obrázek 1) [18,19]. Velká podskupina proteinů, které jsou postupně rekrutovány, hraje rozhodující roli v procesu endocytózy k časným endozomům, dozrávání endozomů k lateendozomům a jejich následnému intracelulárnímu osudu (přehled [17,18,20]).

Význam těchto proteinů podtrhuje jejich ztráta a/nebo mutace, které způsobují různá onemocnění. Například Strumpellin a proteiny SWIP jsou součástí WASH komplexu, který se účastní polymerace aktinu, stejně jako štěpení a třídění endozomů. Mutace v genu Strumpellin způsobují dědičnou spastickou paraplegii, charakterizovanou degenerací motorických neuronů [21].

Jednobodová mutace (Pro1019Arg) v proteinu SWIP destabilizuje WASH komplex. Destabilizovaný WASH komplex inhibuje endolysozomální přenos, což způsobuje shlukování endozomů. Defektní endozomální doprava ovlivňuje kognitivní funkce a funkci motorických neuronů se symptomy popisovanými jako nesyndromová mentální retardace [22,23].

V cytoplazmě exozomy pocházejí z endozomů pomocí endosomálních třídicích komplexů nezbytných pro transport (ESCRT), které jsou také známé jako mechanismus biogeneze exozomů závislý na ESCRT (přehled [18,20]).

Dvě skupiny nezávisle uvedly biogenezi exozomů zprostředkovanou lipidy, mechanismus nezávislý na ESCRT. Dva lipidy identifikované v těchto studiích byly bis(monoacylglycero)fosfát/lysobisfosfatidová kyselina (BMP/LBPA) a ceramid [29,30].

Rab31 je další mechanismus nezávislý na ESCRT pro exosomovou biogenezi v cytoplazmě. Aktivace Rab31 stimuluje tvorbu intraluminálních vezikul [31]. Existuje ještě jeden mechanismus, který je v současnosti nedostatečně diskutován a prozkoumán.

Tento mechanismus je založen na ultrastrukturálních pozorováních provedených na konci 50. až 70. let 20. století, která ukázala, že buněčná jádra mohou být místem původu multivezikulárních tělísek plných malých váčků. Malé vezikuly popsané v těchto studiích byly možná exozomy, ale termín exosom nebyl v té době vytvořen. Kilarski a Jasinski pozorovali proces nazývaný nukleární bubliny nebo jaderné extruze v buňkách plaveckého měchýře okouna perca fluviatilis L. (obrázek 2a) [24] s obsahem podobným nukleolarkaryoplazmě [32].

Tito autoři poznamenali, že nukleární bubliny lze stimulovat odstraněním plynu z plaveckého měchýře okouna okouna [24]. Zdá se, že proces jaderného blebbingu má význam jako místo původu exozomů obohacených nukleovými kyselinami a/nebo ribonukleoproteinem.

Jaderné váčky byly naplněny malými vezikuly, které vznikly jednoduchým skládáním vnitřní membrány jaderných váčků (obrázek 2b), což je proces podobný tvorbě intraluminálních váčků v endozomech. Jaderné váčky naplněné „malými váčky“ se nakonec oddělily od jader a staly se součástí cytoplazmy (obrázek 2c).

Kilarski a Jasinski ve svém rukopisu odkazovali na jaderné váčky jako na multivesikulární těla kvůli nedostatku lepší terminologie. Neúmyslně mohli mít tito autoři pravdu, protože následné studie uváděly přítomnost multivezikulárních tělísek v jádrech buněk [33]. Jaderné váčky vyplněné malými vezikuly mají morfologii podobnou multivezikulárním tělískům pocházejícím z endozomů v cytoplazmě (obrázky 1 a 2).

Vzhledem k podobnosti jaderných multivezikulárních tělísek s virovým nukleokapsidem zaměřili vědci svou pozornost na virologii a fenomén jaderného blebbingu a jeho buněčná funkce zůstaly nedostatečně prozkoumány [34].

Bez ohledu na způsob biogeneze jsou exozomy složeny z alipidové dvojvrstvy a obsahují makromolekulární obsah sestávající z lipidů, proteinů a nukleových kyselin.

Některé z makromolekul jsou společné exozomům pocházejícím ze všech buněk, a proto jsou klasifikovány jako exozomové markery a používají se jako potvrzující nástroj k odlišení exozomů od jiných extracelulárních vezikul. Jedinečné makromolekuly přítomné v exosomu odrážejí jejich rodičovský původ, a proto budou pravděpodobně označeny jako biomarkery.

Všechny buňky uvolňují exosomy do extracelulárního prostoru. Z extracelulárního prostoru se exosomy dostávají do různých biologických tekutin a dostávají se k buňkám lokálně i na dálku. Buňky kultivované in vitro uvolňují své exosomy do kultivačního média. Kontinuální uvolňování exozomů do extracelulárního prostoru dělá z kultivačního média a biologických tekutin bohatý zdroj pro izolaci exozomů.

Exozomy obsahují podstatné množství kódujících a nekódujících RNA, dvouřetězcové fragmenty genomové DNA a mitochondriální DNA. Tramvaje a kolegové byli první, kdo popsal přítomnost RNA v „exfoliovaných váčcích“, což je směs exosomů a mikrovezikul.

Zjistili, že „exfoliované vezikuly nebo exosomy“ obsahují 5 % RNA [5]. Valadi a kolegové byli první, kdo systematicky analyzoval inexozomy zabalené v RNA. Exosomální RNA zahrnovaly translatovatelné mRNA a mikroRNA (miR) [35].

MikroRNA jsou třídou nekódujících RNA (ncRNA). Jsou dlouhé ~22 nukleotidů a regulují genovou expresi na post-transkripční úrovni vazbou na 30-nepřekládané oblasti jejich cílových messengerových RNA [36]. Je zajímavé, že některé miRNA obohacené v exozomech nejsou detekovány v rodičovských buňkách, což naznačuje selektivní systém třídění/balení RNA během biogeneze exozomů [35,37].

Na rozdíl od buněk exozomy obsahují málo nebo žádnou ribozomální RNA, ale obsahují fragmenty tRNA [38]. Třídění RNA do exozomů závisí na (1) proteinu asociovaném s RNA-indukovaným umlčovacím komplexem (RISC), (2) RNA sekvenčních motivech a vodících proteinech, (3) přidání nukleotidů na 30. konci miRNA, (4) buněčné dostupnosti miRNA a (5) ceramid [39,40].

Věříme, že nukleární blebbing je další buněčný proces, který umožňuje diferenciální třídění RNA, komplexů RNA-protein a genomové DNA do exozomů. Existuje několik důvodů pro tento názor: (1) obsah „intraluminálních váčků“ byl podobný nukleolární karyoplazmě [32]. „Váčky“ v nukleárních multivezikulárních tělíscích (MVB II) byly obohaceny o RNA, kyselé a bazické proteiny, a proto autoři uvažovali „ intraluminální vezikuly' jako místo syntézy RNA kromě tonukleolu [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10kbin exosomy [43–47].

Mimochodem, genomová DNA byla detekována pouze v exozomech odvozených z rakovinných buněčných linií a nikoli v normálních buňkách [47]. Rakovinné buňky mají abnormální chromatin kvůli přeskupení/translokaci chromatinu a možná ploidii [48], která může způsobit fragmentaci genomické DNA v jádrech rakovinných buněk. Tyto fragmenty DNA lze snadno začlenit do MVB typu II (a exozomů) vyvíjejících se v jádrech. (3) Způsob biogeneze „malých váčků“ v jaderných váčcích popsaný Kilarskim a Jasinskim [24] je podobný tvorbě intraluminálních váčků v pozdních endozomech v cytoplazmě.

Pevně ​​věříme, že přítomnost genomové DNA v exozomech je patologická, a proto její přítomnost v exozomech může být použita jako diagnostický nástroj pro vývoj abnormálních (nebo rakovinných) buněk v těle. (4) Zvýšení počtu exozomů uvolněných buňkami v závislosti na aktivitě [49] je srovnatelné s plynovými buňkami, které vykazovaly zvýšené nukleární bubliny po odstranění plynu z plaveckého měchýře okounů [24].

V nedávné době byly mitochondriální proteiny a DNA detekovány v plazmatických exozomech některých pacientů s rakovinou a jejich přítomnost je spojena s agresivitou rakoviny [50,51].

Mitochondriální rozpad je často pozorován u degenerujících buněk [52,53]. Mitochondriální kristy uvolněné z degenerujících mitochondrií mohou být internalizovány multivezikulárními tělísky a nakonec jsou zabaleny do inexosomů.

Tuto představu podporují ultrastrukturální obrazy lidských lymfoblastoidních buněk a lumen acini prostaty paviána, která měla „mikrovezikuly“ (neboli exozomy) odvozené z rozpadu krista mitochondrií [54].

Na základě výše uvedené diskuse a podpůrných experimentálních důkazů navrhujeme, že heterogenní povaha exozomů pochází z biogeneze multivezikulárních těl a souvisejících exozomů v různých subcelulárních umístěních a ne zcela v cytoplazmě, jak jsme v současné době přesvědčeni. Náš návrh může vysvětlit heterogenitu exozomů stejně jako nesoulad mezi teoretickými výpočty a experimentálními údaji o počtu malých RNA nebo proteinových molekul obsažených v jednom exozomu purifikovaném ze séra [55].

Na základě teoretických výpočtů s použitím průměrné velikosti exozomu Li a kolegové předpověděli, že každý exozom pojme přibližně 70–25,000 malých molekul RNA nebo proteinu.

Jejich experimentální data však ukázala přítomnost jedné molekuly RNA na exozom purifikované ze séra [55]. Naše hypotéza vyžaduje další zkoumání jaderných bublin, nukleárních multivezikulárních tělísek a biogenezi exozomů obsahujících RNA/ribonukleoprotein innukleárních multivezikulárních tělísek. Lipidy jsou důležitou součástí exosomových membrán a jsou distribuovány asymetricky mezi dvěma cípy exozomové membrány. Složení lipidů se liší mezi membránou rodičovské buňky a membránou exosomu.

Obecně platí, že lipidy obohacené o exosomembrány jsou sfingomyelin, ceramid, cholesterol a lipidové raftové mikrodomény bohaté na cholesterol, gangliosid GM3, desaturované lipidy a fosfatidylserin [56–58]. Exosomální proteiny se skládají z proteinů společných většině exozomů a také jedinečných proteinů specifických do určité rodičovské buňky.

Obsah proteinů všech exozomů je obecně obohacen o cílené a fúzní proteiny, jako jsou tetraspaniny, integriny, chaperoneproteiny, např. proteiny tepelného šoku (Hsp60, Hsp70 a Hsp90), malé proteiny HSP provádějící membrány, proteiny Rab, ARF GTPázy, annexiny a proteiny podílející se na tvorbě multivezikulárních tělísek, jako jsou ALIX a TSG101 [59].

Novější studie naznačují přítomnost RNA-vazebných proteinů, které tvoří komplexy RNA-protein v exozomech [38]. Několik buněčných procesů, které zajišťují nahrávání proteinů do exozomů, je (1) mechanismy ESCRT pro proteiny s určitými posttranslačními modifikacemi, jako je ubikvitinace, Wnt-stimulovaná methylace argininu, oxidace, fosforylace, glykosylace a citrulinace; (2) autofagie zprostředkovaná chaperony (CMA), která se opírá o interakci mezi příbuzným 71 kDa proteinem tepelného šoku (HSC70) a proteiny s motivem KFERQ.

Po navázání HSC70 na proteiny s motivem KFERQ jsou proteiny zacíleny na multivezikulární tělíska. Autofagie zprostředkovaná chaperony normálně funguje při degradaci proteinů v lysozomech. Novější údaje naznačují, že CMA hraje roli v uvolňování exozomů a exozomy zprostředkované diseminaci proteinových agregátů u některých neurodegenerativních onemocnění [60–63].

Od 90. let 20. století došlo k exponenciálnímu nárůstu výzkumu exosomů a bylo vytvořeno mnoho údajů o exosomálním nákladu. Databáze byly vytvořeny, aby poskytovaly kompendium exosomálního nákladu, než bude příliš obtížné spravovat velké soubory dat.

Opakovatelnost publikovaných dat o exozomech je dalším důvodem, protože většina laboratoří používá variace různých metod vyvinutých k izolaci exozomů. Například vezilepedie je manuálně upravený kompendium molekulárního nákladu (lipid, RNA a protein) identifikovaný v různých třídách extracelulárních vezikul [64]. Vesiclepedia poskytuje cenný zdroj pro výzkumníky.

Databáze Vesiclepedia je veřejně dostupná a umožňuje uživatelům vyhledávat a stahovat data o exosomovém nákladu na základě uživatelsky zadaných vyhledávacích kritérií. EV pedia, Exocarta, ExoRbase a EV miRNA jsou další databáze, které katalogizují exosomální proteiny a RNA [64].

Databáze jsou řízeny komunitními anotacemi. Data kurátorovaná v těchto databázích se získávají izolací exozomů pomocí různých různých separačních technik, které nejsou zahrnuty v databázi.

Obsah exosomálního nákladu se tedy může lišit v závislosti na použité metodě izolace, což vede k určité nejednoznačnosti uváděných výsledků. Pro zlepšení experimentální reprodukovatelnosti a transparentnosti byla vyvinuta open source znalostní databáze EV-TRACK. EV-TRACK zahrnuje údaje o přípravě exozomů a charakterizaci exozomů [65].

Klíčovou vlastností EV-TRACK je EV-METRIC, která představuje hlášení experimentálních parametrů jako procento splněných komponent ze seznamu devíti [66]. O těchto složkách rozhodlo konsorcium EVTRACK a byly považovány za nezbytné pro jednoznačnou interpretaci dat a reprodukci experimentálních dat. Proto byl EV-METRIC navržen tak, aby pomáhal výzkumníkům a recenzentům při poskytování komplexního přehledu dat.

2. Současné metody izolace exosomů

Exosomy představují bohatý zdroj pro objevování biomarkerů a pro nové terapeutické strategie včetně regenerativní medicíny. Nejdůležitější pro úspěch těchto cílů je izolace čistých exozomů pomocí reprodukovatelné metody.

Izolace funkčně kompetentních exosomů je zvláště kritická pro potenciální terapeutické aplikace. Exozomy byly purifikovány z různých biologických tekutin, jako je krev, plazma, mozkomíšní mok, sliny, moč a mléko. Každá biologická tekutina má různé fyzikální a chemické vlastnosti, které je třeba vzít v úvahu před izolací exosomu.

V některých případech mohou být pro izolaci exosomů nezbytná specifická opatření. Další determinantou, která ovlivňuje způsob izolace exozomů, je konečná aplikace purifikovaných exozomů.

Doposud bylo vyvinuto několik metod izolace exosomů a některé z nich jsou založeny na charakteristikách exosomů, jako je jejich velikost, hustota, povrchový náboj a proteiny spojené s povrchem exozomu (obrázek 3) [67].

Některé v současnosti používané metody izolace exosomů jsou uvedeny v tabulce 1. Většina z nich nejsou samostatné metody a vyžadují předchozí kroky zpracování po vzorkování. Významné metody jsou stručně diskutovány níže.

Obrázek 3. Běžně používané metody pro izolaci exozomů a jejich následné aplikace. Několik dosud vyvinutých metod pro izolaci exosomů je založeno na jejich vztlakové hustotě, schéma 1, 13 a 1,19 g/ml, metoda ultracentrifugace (UC) byla dále zdokonalena na izolovat čisté preparáty exosomů na základě jejich vznášející se hustoty izopyknickou ultracentrifugací nadsacharózy nebo gradientu hustoty jodixanolu (DG).

K odstranění vysokého obsahu proteinu u proteinurií byla metoda ultracentrifugace kombinována s vylučovací chromatografií (SEC). Časová omezení spojená s metodou ultracentrifugace vedla k vývoji filtrační metody (UF).

Průchod zředěných vzorků, jako je kultivační médium a moč, přes nano- nebo mikromembránový koncentrátor umožnil purifikaci exosomů. Ucpávání membrán a špatná obnova exosomálních proteinů způsobily, že tato metoda není populární pro následné aplikace, jako je izolace RNA a aplikace s vysokou propustností.

Další metoda vyvinutá pro izolaci exozomů z velmi zředěných biologických fluidů je hydrostatická filtrační dialýza (HFD *) v kombinaci s centrifugací. Při metodě HFD je vzorek dialyzován přes dialyzační membránu s mezní hodnotou molekulové hmotnosti 1000 kDa za hydrostatického tlaku, což umožňuje odstranění nežádoucích makromolekul ze vzorku a exosomy jsou získány centrifugací.

Metoda srážení exosomů založená na rozpustnosti nebo disperzibilitě a agregaci byla vyvinuta pro zpracování několika vzorků současně. Na této strategii jsou založeny komerční sady pro purifikaci exosomů.

Při této metodě se močový orascites smíchají s polyethylenglykolem (PEG) 6000 nebo v kombinaci s protaminem (plus PEG35 000) a inkubují se buď přes noc, nebo 1 hodinu na ledu.

Výsledná zakalená směs se odstředí, aby se získaly exozomy, které se používají pro následné analýzy RNA a proteinů. Další činidla používaná pro precipitaci exozomů jsou (1) 0.1M octan sodný pH 4,75 (metoda vysolování) (NaAc), (2)4-násobný objem studeného acetonu (−20 ◦C) ( PRotein Organic Solvent Precipitation a zkráceně PROSPR), (3) a směs roztoku PEG a dextranu (až 1,5 %) (dvoufázová metoda, která umožňuje separaci proteinů z exozomů).

Identifikace exosomálních povrchových proteinů vedla k vývoji metod založených na imunoafinitním záchytu využívajících protilátky proti exozomovým povrchovým proteinům, jako je Tim4, annexin, EpCAM, běžný exosomový povrchový protein, CD63 a proteiny tepelného šoku (afinitní interakce). K vývoji metod izolace exosomů byla využita afinita k lektinu (který se váže na glykoproteiny na povrchu exozomů) a heparinu (který se váže na proteoglykany heparansulfátu na povrchu exozomů).

Několik platforem, jako jsou magnetické kuličky, vysoce porézní monolitické mikrohroty z oxidu křemičitého, povrch plastových destiček, celulózové filtry, membránové afinitní filtry, agarosesorbent a mikrofluidní zařízení, bylo použito pro afinitní metody čištění exosomů a mají různé výhody pro jejich použití v diagnostické, prognostické systémy, systémy podávání léků a detekce a analýzy forexosomálního nákladu.

Upraveno se svolením Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Izolace extracelulárních vezikul: Obecné metodologie a nejnovější trendy. Biomed Res Int. 30. ledna 2018; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Copyright © 2022 Maria Yu. Konošenko a spol.

Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo správně citováno [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com