Simulovaná mikrogravitace ovlivňuje biomarkery související s imunitou u rakoviny plic

Abstraktní: Mikrogravitace je nová strategie, která může sloužit jako doplňkový nástroj pro vývoj budoucích terapií rakoviny. U rakoviny plic je dobře řešen vliv mikrogravitace na buněčné procesy a migrační kapacitu buněk. Jeho účinek na mechanismy, které řídí progresi rakoviny plic, však zůstává v plenkách. V této studii bylo prokázáno, že 13 odlišně exprimovaných genů souvisí s prognózou rakoviny plic při simulované mikrogravitaci (SMG). Pomocí analýzy obohacení genové sady jsou tyto geny obohaceny o dráhy humorální imunity. Místo toho byly alveolární bazálně-epiteliální (A549) buňky vystaveny působení SMG prostřednictvím 2D klinostatového systému in vitro. Kromě změny morfologie a snížení rychlosti proliferace SMG vrátila fenotyp epiteliální-mezenchymální přechod (EMT) A549, klíčový mechanismus v progresi rakoviny. To bylo dokázáno zvýšenou epiteliální expresí E-cadherinu a sníženou expresí mezenchymálního N-cadherinu, čímž se projevil méně metastatický stav. Je zajímavé, že jsme pozorovali zvýšenou expresi FCGBP, BPIFB, F5, CST1 a CFB a jejich korelaci s EMT pod SMG, což z nich činí potenciální nádorové supresorové biomarkery. Tato zjištění společně odhalují nové příležitosti k vytvoření nových terapeutických strategií pro léčbu rakoviny plic.

Klíčová slova: simulovaná mikrogravitace; EMT; rakovina plic; metastáza; nádorový supresor; biomarker

Účinky byliny Cistanche-Protinádorové

1. Úvod

Vesmír je známý tím, že postrádá gravitační vektor, který ovlivňuje tělo na úrovni orgánů, tkání a buněk. Mikrogravitace, stav zdánlivého stavu beztíže, je významným prostorovým stresorem, o kterém je známo, že významně ovlivňuje lidské zdraví, jako je úbytek kostní hmoty, svalová atrofie a srdeční dekondice [1,2]. Vliv mikrogravitace na rakovinné buňky je také rostoucím středobodem zájmu ve vesmíru a výzkumu rakoviny. Bylo prokázáno, že mikrogravitace potlačuje aktivitu imunitních buněk a narušuje vícetělové systémy, což může zvýšit riziko vzniku rakoviny [2–4]. Kvůli těmto zjevným zdravotním problémům umožnilo prostředí mikrogravitace výzkumníkům studovat biofyzikální mechanismy ovlivněné mikrogravitací a pomohlo objevit terapeutika pro neurodegenerativní poruchy, imunoterapie a potenciálně lepší a cílenější protirakovinné terapie [4–6]. Četné studie dobře zdokumentovaly a zhodnotily velký dopad, který má mikrogravitace na buněčnou progresi, proliferaci a apoptózu u nesčetných nádorových buněčných linií, včetně rakoviny plic [7–12]. Ukázalo se však, že mnoho dalších studií zahrnujících mikrogravitaci indukuje změny v genové expresi, které se podílejí na proliferaci, metastázování a přežití rakovinných buněk, čímž se buňky posouvají směrem k méně agresivnímu fenotypu [13,14]. To může vrhnout světlo na nové chápání biologie a diagnostiky nádorů, a proto zdůrazňuje mikrogravitaci jako inovativní nástroj k objevování nových cílů v naději na vývoj nových výzkumných přístupů a zlepšení terapeutických strategií. Karcinom plic, jehož nejvýznamnějším typem je nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), je hlavní příčinou úmrtí, tvoří 12 % všech karcinomů a je nejčastěji diagnostikovaným karcinomem [15]. Ve studiích zahrnujících mikrogravitaci, které nás mohou vést k lepšímu pochopení karcinogenního procesu, bylo prokázáno, že buňky rakoviny plic po vystavení mikrogravitaci ztrácejí kmen, což ovlivňuje růst a funkci rakovinných buněk [11]. Studie Ahna et al. ukázaly, že vystavení buněk rakoviny plic (A549) mikrogravitaci vyvolalo rychlou migraci a proliferaci. To bylo vysvětleno zvýšenými hladinami matrixových metaloproteáz (MMP-2 a MMP-9) v mikrogravitaci, které tak hrají klíčovou roli v invazi a migraci rakoviny [10]. V jiné studii Chung et al. zjistili, že simulovaná mikrogravitace významně neovlivnila proliferaci buněk karcinomu plic, ale spíše zvýšila migraci ve srovnání s kontrolní skupinou při normální gravitaci [16]. Naopak Chang a spol. prokázali snížení migrace v buněčné linii rakoviny plic A549 po 24 hodinách vystavení podmínkám mikrogravitace [17]. Navzdory významným účinkům mikrogravitace na buněčné chování, které zahrnuje apoptózu, migraci a invazivitu, její účinek na rakovinu plic není dosud plně objasněn. Je dobře známo, že epiteliální buňky procházejí několika biochemickými změnami, aby se vytvořil mezenchymální fenotyp, který zvyšuje odolnost proti apoptóze, invazivitu a migrační schopnosti. Takový biologický proces je znám jako přechod z epitelu na mezenchym (EMT), což je charakteristický znak progrese rakoviny [18]. Vztah EMT k progresi rakoviny byl dobře diskutován. Je známo, že nádory aktivují EMT zvýšením regulace transkripčních faktorů, expresí proteinů buněčného povrchu a produkcí enzymů degradujících ECM. Jakmile je EMT aktivována, nádorové buňky ztrácejí svou buněčnou adhezi a získávají migrační a invazivní vlastnosti [19]. Pouze dvě studie ukázaly, že simulovaná mikrogravitace indukuje u keratinocytů přechodný přechod z epitelu na mezenchym (EMT) [9]. Kromě toho byly tyto jevy zvýrazněny u buněk MCF-7 a HUVEC [20]; žádné studie se však nezaměřily na vliv mikrogravitace na EMT u rakoviny plic. Navzdory mnoha zásadním objevům o schopnosti mikrogravitace modulovat tumorigenní a metastatické procesy rakoviny, přesné mechanismy řízené mikrogravitačním městem zůstávají relativně neznámé, a proto jsou otevřené otázky týkající se adaptivních změn, ke kterým dochází na molekulární úrovni. V této studii jsme identifikovali signaturu genů souvisejících s imunitou (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB a CST1), které významně vykazovaly zvýšenou expresi mRNA v buňkách A549 pod vlivem simulované mikrogravitace (SMG). Kromě toho jsme hodnotili příspěvek SMG k progresi rakoviny A549 prostřednictvím regulace EMT. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB a CST1 a jejich korelace s klíčovými markery EMT vykazovaly potenciálně méně metastatický fenotyp rakoviny plic pod SMG. Zjištění této studie poskytují základ pro budoucí výzkumy, které jsou nutné k identifikaci základních mechanismů, které rozvinou naše porozumění a pomohou při vývoji nových terapeutických strategií pro léčbu rakoviny plic.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

2. Výsledky

2.1. Nejběžnější diferenciálně vyjádřené geny identifikované v buňkách rakoviny plic při simulované mikrogravitaci (SMG) ve srovnání s přízemní gravitací (GG)

Abychom identifikovali geny podílející se na rakovině plic při simulované mikrogravitaci (SMG), zpočátku jsme zkoumali geny, které jsou odlišně exprimovány pod SMG ve srovnání s pozemní gravitací (GG) pro lidský karcinom plic pomocí veřejně dostupné databáze Gene Expression Omnibus (GEO). Byly vybrány dva soubory dat, GSE78210 a GSE36931, které zahrnují genovou expresi pro dvě různé buněčné linie lidské rakoviny plic, A549 a Colo699, kultivované v podmínkách 2D a 3D buněčné kultury. Rozdíly v profilech genetické exprese mezi vzorky SMG a GG byly prezentovány na sopečných grafech (obrázek 1). Identifikované odlišně exprimované geny (DEGs; obrázek 2) pro každý soubor dat byly rozděleny na ty, které jsou upregulovány u rakoviny plic (21 genů v A549 a 29 genů v Colo699 datového souboru GSE78210 a 47 genů v A549 datového souboru GSE36931) a ty které jsou downregulovanou rakovinou plic I (40 genů v A549 a 27 genů Colo699 z datového souboru GSE78210 a 87 genů v A549 z datového souboru GSE36931), jak je uvedeno v tabulce 1. Třináct stupňů bylo významně vysoce exprimováno v buňkách A549 v souboru dat GSE78210 a GSE3 SMG ve srovnání se stavem GG. Nejběžnější geny byly identifikovány pomocí webového nástroje InteractiVienn (obrázek 2A). Kandidátní geny zahrnují AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP a BPIFA1. Aby se zjistilo, zda jsou identifikované DEG zapojeny do společných cest, byly kandidátní geny nahrány do Metascape (http://metascape.org; přístupné 11. listopadu 2021). Je zajímavé, že tyto geny jsou obohaceny o dráhy zahrnující humorální imunitní odpověď a regulovanou exocytózu (obrázek 2B).

Obrázek 1. Graf sopky ukazující odlišně exprimované geny (DEG) pomocí GEO Omnibus. (A) Graf sopky ukazující DEG pod účinky SMG a GG v buňkách A549 s použitím datových souborů (A) GSE78210 a (B) GSE36931. (C) Graf sopky ukazující DEG pod účinky SMG a GG v buněčné linii Colo699 s použitím souboru dat GSE78210. Červená barva označuje upregulované geny, zatímco modrá barva označuje downregulované geny.

Tabulka 1. Celkové geny, které jsou odlišně exprimovány na SMG ve srovnání s GG v buněčných liniích rakoviny plic A549 a Colo699. Každý soubor dat měl násobné změny upravené tak, aby extrahovaly horních 5 % stupňů. Pro GSE36931 byla násobná změna (FC) upravena tak, aby zahrnovala pouze geny s FC větší nebo rovnou 4 nebo menší nebo rovnou -4. Pro GSE78210 byla FC upravena tak, aby zahrnovala pouze geny s FC větší nebo rovnou 3 nebo menší nebo rovnou -3.

Obrázek 2. Třináct běžně sdílených DEG mezi soubory dat GSE78210 a GSE36931 u rakoviny plic. (A) Vennův diagram ukazující 134° v GSE36931 (buněčná linie A549), 61° v GSE78210 (buněčná linie A549) a 56° v GSE78210 (buněčná linie Colo699) za podmínek SMG ve srovnání s GG. Z celkového počtu identifikovaných 251 genů bylo zjištěno, že 13 stupňů je společných mezi dvěma soubory dat, GSE78210 a GSE36931, v buněčné linii A549. Vennův diagram byl vytvořen pomocí InteractiVinn.

2.2. Diferenciálně exprimované geny korelovaly s klinickou prognózou pacientů s plicním adenokarcinomem

Diferenciálně vyjádřené geny korelované s klinickou prognózou pacientů s plicním adenokarcinomem K vyhodnocení klinické prognostické hodnoty kandidátních genů u pacientů s plicním adenokarcinomem, Kaplan-Meierův plotr (http://www.kmplot.com/; přístup 11. listopadu 2{ {44}}21) byl použit k porovnání celkového přežití (OS) pacientů s plicním adenokarcinomem (LUAD) s vysokou/střední expresí a nízkou expresí kandidátních genů (obrázek 3). Vysoké hladiny exprese mRNA NOX1 (poměr rizika (HR), 1,45; 95% interval spolehlivosti (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR , 1,74; 95% CI, 1,33–2,26; p=3,2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95% CI, 1,26–2,08; p=0,00014), a BPIFA1 (HR, 1,44; 95% CI, 1,12–1,84; p=0,0026) významně souvisí se špatnou prognózou (obrázek 3A–D). Na druhé straně vysoké hladiny exprese mRNA FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46–0,85; p=0,0026) byly spojeny s lepší prognózou a vyšším celkovým přežitím u pacientů s LUAD (obrázek 3E). Mezi mRNA nebyla žádná významná korelace

Obrázek 3. FCGBP, CST1, F5, CFB a BPIFB1 korelují s klinickou prognózou pacientů s adenokarcinomem plic. Kaplan-Meierovy křivky přežití úrovní exprese mRNA kandidátních genů: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; a (M) CST1 u pacientů s adenokarcinomem plic. HR: poměr rizika.

cistanche doplňkové výhody-protinádorové

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.3. Exprese FCGBP, BPIFB1, F5, CFB a CST1 v buňkách A549 po simulaci mikrogravitace

Pro ověření exprese in silico identifikovaných genů (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP a BPIFA1) byla provedena in vitro aplikace pomocí qRT-PCR. Je zajímavé, že při použití qRT-PCR naše data vykazovala významnou upregulaci exprese mRNA FCGBP, konkrétně po 48 a 72 hodinách v buňkách A549, po SMG ve srovnání s GG (obrázek 4A). Kromě toho byly exprese mRNA CFB, F5 a BPIFB1 významně upregulovány 72 hodin po SMG a ve srovnání s GG v buňkách A549 (obrázek 4B, C, E). Mírné zvýšení, i když ne významné, exprese mRNA bylo detekováno pro CTS1 za podmínek SMG ve srovnání s GG (obrázek 4D). Exprese AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 a TCN1 nebyly stanoveny pro SMG i GG (data nejsou uvedena).

Obrázek 4. Upregulace FCGBP, CST1, F5, CFB a BPIFB1 za podmínek SMG in vitro. Hladiny exprese mRNA (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 a (E) BPIFB1, kvantifikované pomocí qRT-PCR a normalizované na GAPDH v buňkách A549 vystavených podmínkám GG a SMG po dobu 24 , 48 a 72 hodin. Sloupcové grafy zobrazují výsledky 3 nezávislých experimentů (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 a **** p < 0,0001.

Celkově tato data naznačují, že rozdílně exprimované FCGBP, F5, CFB a BPIFB1 u rakoviny plic mohou hrát důležitou roli v progresi rakoviny plic.

2.4. Simulovaná mikrogravitace snižuje životaschopnost buněk a obrací přechod z epitelu na mezenchym v buněčné linii rakoviny plic A549

Aby se zjistilo, zda SMG ovlivňuje proliferační potenciál buněk A549, byl proveden test životaschopnosti buněk za použití vylučovacího testu trypanové modři. Naše data odhalila, že SMG významně indukoval časově závislý pokles buněčné proliferace (obrázek 5B). Pokles buněčné proliferace byl významný hlavně po 48 a 72 hodinách po SMG ve srovnání s GG, který vykazoval zvýšení buněčné proliferace buněk A549. Paralelně byla detekována změna v buněčné morfologii v buňkách A549 pod SMG. Pro posouzení těchto změn byly buňky vyjmuty z podmínek SMG, naočkovány na 24-jamkové destičky a pozorovány pod světelnou mikroskopií po 1 hodině aplikace SMG. Je zajímavé, že buňky vystavené SMG odhalily granulární, shlukovanou morfologii po SMG. (Obrázek 5A).

Obrázek 5. Simulovaná mikrogravitace snižuje životaschopnost buněk a indukuje morfologické změny v buňkách A549 způsobem závislým na čase. (A) Reprezentativní mikrofotografie rodičovských buněk A549 (GG) a buněk A549 vystavených SMG po dobu 24, 48 a 72 hodin před jejich naočkováním zpět na 1 hodinu pod GG. Snímky byly pořízeny při 10násobném zvětšení. (B) Buněčná životaschopnost buněk A549 byla hodnocena pomocí testu vylučování barviva trypanovou modří. Průměrná životaschopnost buněk ze 3 nezávislých experimentů je zobrazena jako procentuální kontrola. **** p < 0.0001. Obrázek 5. Simulovaná mikrogravitace snižuje životaschopnost buněk a indukuje morfologické změny v buňkách A549 způsobem závislým na čase. (A) Reprezentativní mikrofotografie rodičovských buněk A549 (GG) a buněk A549 vystavených SMG po dobu 24, 48 a 72 hodin před jejich naočkováním zpět na 1 hodinu pod GG. Snímky byly pořízeny při 10násobném zvětšení. (B) Buněčná životaschopnost buněk A549 byla hodnocena pomocí testu vylučování barviva trypanovou modří. Průměrná životaschopnost buněk ze 3 nezávislých experimentů je zobrazena jako procentuální kontrola. **** p < 0,0001.

Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová

Abychom porozuměli získaným údajům o snížené buněčné proliferaci u A549, vyhodnotili jsme příspěvek SMG k mechanismu epiteliálního-mezenchymálního přechodu (EMT). EMT je charakteristickým znakem a důležitým mechanismem, který řídí progresi rakoviny a metastázy, čímž zvyšuje její buněčnou motilitu a invazivní vlastnosti [19]. Klíčové markery EMT (E-cadherin, N-cadherin, ZO-1 a Snail) a hladiny exprese mRNA metaloproteináz MMP-2 a MMP-9 byly měřeny pomocí qRT-PCR v A549, pod jak GG, tak SMG (obrázek 6). Po aplikaci SMG bylo pozorováno významné zvýšení exprese mRNA E-cadherinu paralelně s významným poklesem exprese mRNA N-cadherinu 48 a 72 hodin po SMG (obrázek 6A, B). Po SMG bylo zjištěno nesignifikantní zvýšení ZO-1 a MMP-9 a snížení transkripčního faktoru Snail (obrázek 6C–E). MMP-2 byla významně snížena u A549 48 hodin po SMG (obrázek 6F), což ukazuje na méně invazivní formu. Souhrnně tato data podporují fenotyp mezenchymálně-epiteliálního přechodu (MET) indukovaný SMG v A549.

Obrázek 6

2.5. Dráha přechodu z epitelu na mezenchym koreluje s expresí FCGBP, BPIFB1, F5, CFB a CST1

Pro získání dalšího mechanického náhledu na potenciální roli identifikovaných genů v A549 a jejich možnou korelaci s EMT za podmínek SMG byla provedena analýza genové interakce pomocí GeneMANIA proti genovým markerům EMT. Obrázek 7 ukazuje genové interakce vynesené mezi EMT geny E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Snail), ZO-1, respektive -catenin. Metaloproteinázy MMP-2 a MMP{13}} byly do analýzy zahrnuty i s vědomím jejich významné role v invazi a migraci rakoviny. Uzly identifikují vzory společné exprese mezi geny různé síly na základě tloušťky uzlu. Kandidátní geny vykazují určitý stupeň vzájemné exprese; BPIFB1 je koexprimován s CFB a CST1; FCGBP je koexprimován s F5, CST1 a CFB; CST1 je koexprimován s CFB a F5 je koexprimován s CFB, CST1 a BPIFB1. Mezi geny EMT a kandidátními geny byly také identifikovány koexpresní uzly; CDH1 je koexprimován s FCGBP a F5; CDH2 je koexprimována s F5, CST1, BPIFB1 a FCGBP; CTNNB1 je koexprimován s CST1 a FCGBP; SNAI1 je koexprimován s CST1, F5 a BPIFB1; TPJ1 je koexprimován s CST1, FCGBP a F5; CTNNB1 je koexprimován s CST1 a FCGBP; MMP2 je koexprimován s BPIFB1 a CST1; a MMP9 je koexprimován s F5, CST1, FCGBP a CFB. Tato zjištění naznačují významnou korelaci mezi nově identifikovanými geny a markery EMT za podmínek SMG, pravděpodobně související s cestami EMT.

Obrázek 7. FCGBP, CST1, F5, CFB a BPIFB1 korelují s dráhou EMT. Síť interakce gen-gen vybraných kandidátních genů; FCGBP, CST1, F5, CFB a BPIFB1 s geny EMT; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 a SNAI1, stejně jako geny MMP2 a MMP9 související s buněčnou migrací generované GeneMANIA (http://genemania.org/; přístupné 11. listopadu 2021) k identifikaci interakcí mezi kandidátskými geny s EMT a markery buněčné migrace. Různé barvy okraje sítě označují použité bioinformatické metody: predikce webových stránek (oranžová), fyzické interakce (červená), koexprese (fialová), sdílené proteinové domény (hnědá), cesta (světle modrá), společná lokalizace (tmavá modrá) a genetické interakce (zelená)

3. Diskuse

Čaj Cistanche

Diskuse Rakovina plic, jedna z významných a celosvětově ohrožujících nemocí, si v poslední době získala velkou pozornost v rámci "Výzkumu vesmíru". Navzdory pokroku v této oblasti však progrese rakoviny plic a její reakce na léčbu zůstávají kontroverzní kvůli nedostatku definitivních strategií hodnocení, které by pomohly v prevenci nebo léčbě rakoviny [21]. Pokud je nám známo, toto je první zpráva, která identifikuje sadu genů jako podpis progrese rakoviny plic v mechanickém prostředí vyvolaném simulovanou mikrogravitací (SMG). Zdůrazňujeme zvýšenou expresi genů souvisejících s imunitní odpovědí FCGBP, BPIFB, F5, CST1 a CFB a jejich korelaci s přechodem z epitelu na mezenchym (EMT) pod SMG, což z nich činí potenciální biomarkery progrese rakoviny plic. Zde také zdůrazňujeme účinek indukované SMG na regulaci EMT, charakteristický znak progrese rakoviny [18,22], při podpoře fenotypu mezenchymálního přechodu k epitelu (MET). Celkově tato studie nabízí základ pro asociaci identifikovaných genů s EMT; k odhalení přesných mechanismů, které pomáhají při vývoji nové cílené terapie rakoviny plic, jsou však zapotřebí další výzkumy. V této studii jsme ukázali třináct genů (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP a BPIFA1), které jsou významně exprimovány u rakoviny plic při simulované mikrogravitaci (SMG) jako ve srovnání s pozemní gravitací in silico. Naše data ukázala, že tyto odlišně exprimované geny jsou obohaceny o dráhy související hlavně s humorální imunitou a regulovanou exocytózou. Zájem souběžně s našimi zjištěními, i když hlavní funkce FCGBP je stále nejasná [23]. To může být částečně způsobeno protichůdnými rolemi, které má u různých nádorů [25]. Například se ukazuje, že FCGBP významně souvisí s lepší celkovou prognózou a přežitím specifickým pro onemocnění u pacientů s rakovinou hlavy a krku, rakovinou tlustého střeva a osteosarkomem [25–27], zatímco u rakoviny vaječníků a prostaty je vysoká exprese FCGBP byl spojen s horším celkovým přežitím [28]. Je třeba poznamenat, že role FCGBP byla přisuzována imunitním obranným mechanismům, protizánětlivým odpovědím a také ochraně buněk [29,30], což z něj činí základní prognostický marker [31]. Pomocí in vitro aplikací jsme hodnotili expresi identifikovaných genů u rakoviny plic a za podmínek SMG prostřednictvím 2D klinostatu. Existuje široký výběr typů klinostatů a dalších mikrogravitačních platforem, které byly vyvinuty. Patří mezi ně 1/2/3 D klinostatové systémy, stroje na náhodné polohování vybavené baňkami (hlavně pro buňky rakoviny štítné žlázy) a rotační stěnové nádoby vyvinuté NASA. Každá je navržena tak, aby sloužila určitému výzkumnému cíli, přičemž některé jsou určeny ke kultivaci adherentních nebo suspenzních buněk a jiné se používají pro online měření kinetických reakcí. Je třeba poznamenat, že klinostat je jednou z nejjednodušších a nejvíce přizpůsobivých platforem používaných různými experimentálními aplikacemi. V principu je 2D klinostat charakterizován rotační osou, která se nepřetržitě otáčí nastavenou konstantní rychlostí a ve směru, který je kolmý ke směru vektoru zemské gravitace, čímž vytváří odstředivé síly, které napodobují skutečnou mikrogravitaci [14,32,33 ]. Je zajímavé, že ze třinácti genů se exprese FCGBP, BPIFB, F5, CST1 a CFB významně zvýšily v reakci na 2D klinostatem indukované SMG v buňkách A549. Nejvíce byly ovlivněny exprese FCGBP a BPIFB, které vykazovaly významný nárůst ve všech hodnocených časových bodech: 24, 48 a 72 hodin po SMG. Podobně jako FCGBP je známo, že BPIFB1 přispívá k odpovědím přirozené imunity [34]. Bylo prokázáno, že BPI fold obsahující protein člen 1 rodiny B (BPIFB1), který je primárně produkován epitelem dýchacích cest, se účastní mechanismů obrany hostitele spolu s baktericidními a protizánětlivými účinky [35]. U respiračních onemocnění se ukázalo, že BPIFB1 vykazuje protinádorové a antimetastatické účinky; přesné mechanismy však zůstávají nejasné, což vyžaduje další zkoumání [34,36]. Jedna studie Wei et al. zjistili, že BPIFB1 inhibuje migraci a invazi nazofaryngeálního karcinomu [37]. Vzhledem k tomu bylo zjištěno, že mutace vyskytující se v BPIFB1 podporují riziko rakoviny plic a její downregulace vede ke špatné prognóze u pacientů s rakovinou plic [38,39]. Kromě role FCGBP a BPIFB se ukázalo, že faktor komplementu B (CFB) a chimérický tumor supresor 1 (CST1) mají protektivní roli při rakovině. Například bylo hlášeno, že vysoká exprese CFB byla spojena se zvýšeným celkovým přežitím pacientů a přežitím bez onemocnění u pacientů s rakovinou plic [40]. Kromě toho komplementový systém slouží jako první obranná linie proti patogenům a slouží jako hlavní složka jak vrozeného, ​​tak získaného imunitního systému [41]. Pokud jde o CST1, různé studie zdůraznily jeho zajímavé vlastnosti, jako je jeho schopnost potlačovat buněčný růst, indukovat apoptózu a jeho odolnost vůči inaktivaci onkogenními formami p53, což z něj činí atraktivní, ale alternativní terapeutický cíl divokého typu p{ {74}}rezistentní lidské nádory [42]. Kromě zvýšené exprese FCGBP, BPIFB1, F5, CFB a CST1 naše data zajímavě ukázala dva buněčně související fenotypy buněk A549 pod SMG – morfologická změna na agregáty a buňky ve tvaru shluku a významný pokles proliferace. sazba po SMG. To je paralelní s některými dalšími studiemi, kde buňky, které byly vystaveny SMG, vykazovaly malé shluky nebo vícevrstvé buněčné agregáty [43,44]. Tyto morfologické rozdíly se odrážejí v průvodních dramatických funkčních změnách v buněčných procesech, jejichž součástí je EMT. EMT je charakteristickým znakem metastatického procesu spojeného s únikem imunitního dozoru a invazí do vaskulatury, což umožňuje buňkám diseminovat do sekundárních orgánů [19,22]. V zásadě podléhají maligní epiteliální buňky mechanismu EMT v primárních fázích vývoje nádoru, kde tyto buňky mají tendenci vyjadřovat mezenchymální vlastnosti, vykazující zvýšenou pohyblivost, která usnadňuje jejich únik z primární niky, zatímco metastatické buňky vytvořené na sekundární straně méně dediferencované vlastnosti ve srovnání s jejich odpovídajícími primárními nádory. Zde je součástí takové progrese tvorby metastatického nádoru proces MET (mezenchymální až epiteliální). To však nezanedbává účast EMT v různých fázích progrese rakoviny, protože rakovinné buňky na sekundárních místech budou buď pokračovat v růstu a proliferaci, nebo budou dormance [45,46]. Taková koordinace více genů a výskyt specifických migračních markerů, které regulují metastatickou progresi rakovinných buněk, mohou mít za následek různé výsledky při expozici SMG [47]. Například v podmínkách mikrogravitace vykazovaly různé buňky rakoviny prsu různé morfologie, buněčnou adhezi a migrační vlastnosti po vystavení mikrogravitaci [5]. Je třeba poznamenat, že hlavní charakteristikou EMT je ztráta molekuly buněčné adheze, E-cadherinu, což ovlivňuje klidovou integritu buněk. Na druhé straně zvýšení neurálního kadherinu, N-kadherinu, vede ke změnám buněčné adheze. To je indukováno především transformujícím růstovým faktorem (TGF- ), který aktivuje pleiotropicky exprimované transkripční faktory, jako jsou proteiny Snail, Twist a Zeb a další signální dráhy implementované v metastatických drahách [18,48,49]. Zde popisujeme zvýšení epiteliálního markeru E-cadherin (CDH1) a snížení hladiny mezenchymálního N-cadherinu (CDH2) mRNA, klíčových markerů EMT [49]. To znamená, že v kombinaci s našimi údaji o snížené rychlosti proliferace A549 buňky vykazují méně metastatický stav. Je zajímavé, že změněná exprese klíčových markerů EMT byla také doprovázena významnou downregulací matrixové metaloproteinázy MMP{105}}, která je hlavní složkou bazální membrány, která normálně odděluje epiteliální vrstvu od okolního mezenchymu, což vede k ztráta bazální membrány [50]. To je paralelní se studií Chang et al., kde uvedli své poznatky o snížení metastatického potenciálu buněk lidského adenokarcinomu plic prostřednictvím změny exprese MMP2 [17]. Obecně platí, že úloha MMP se dobře podílí na progresi malignit, včetně metastáz, kde snížená exprese MMP (MMP-2 a MMP-9) a enzymatická aktivita jsou charakteristické pro méně metastatický fenotyp [ 50–52]. Vzhledem k významné roli EMT v metastázách naše data zdůrazňují významnou korelaci FCGBP, BPIFB, F5, CST1 a CFB s genovými markery EMT a také s geny MMP2 a MMP9 souvisejícími s buněčnou migrací. Zajímavé je, že Xiong a kol. prokázali, že FCGBP je hlavním regulátorem EMT ve žlučníku [53]. To znamená, že identifikované geny mohou sloužit jako potenciální biomarkery pro budoucí studie, které mohou předvídat a dále porozumět progresi rakoviny plic. Naše zjištění souhrnně klasifikují identifikované geny jako klíčové regulátory EMT, které podporují potenciální posílení méně metastatického fenotypu prostřednictvím mezenchymálního přechodu na epitel (MET) buněk rakoviny plic.

4. Materiály a metody

4.1. Soubory dat k identifikaci společných diferencovaně vyjádřených genů (DEG) v buněčných liniích rakoviny plic vystavených simulované mikrogravitaci

Pro počáteční analýzu byly extrahovány relevantní datové sady z veřejně dostupné databáze Gene Expression Omnibus (GEO). Tato databáze se používá jako veřejně dostupná funkční genomická analýza vysoce výkonných dat genové exprese a mikročipů. Vybrané datové soubory splňovaly následující kritéria: datové sady využívající pouze lidské buněčné linie rakoviny plic, studie, které zahrnují shodu kontrolních podmínek zemské gravitace (GG), datové sady s definovanou klasifikací buněčných linií rakoviny plic a datové sady s expresí genu lidských buněk rakoviny plic pomocí microarray. Tomuto kritériu vyhovují dva datové soubory, GSE78210 a GSE36931. Celkem bylo do studií zahrnuto 25 vzorků a 14 vzorků buněčných linií rakoviny plic v simulované mikrogravitaci (SMG) bylo porovnáno s 11 kontrolami GG, jak je uvedeno v tabulce 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/; přístup 11. listopadu 2021).

Tabulka 2. Podrobnosti o souborech dat extrahovaných z omnibusu genové exprese (GEO) použitých pro počáteční identifikaci DEG mezi buňkami rakoviny plic se simulovanou mikrogravitací (SMG) a přízemní gravitací (GG).

4.2. GEO2R Gene Set Analysis pro generování stupňů v každém datovém souboru

GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; přístup 11. listopadu 2021), interaktivní online nástroj používaný k porovnání řad GEO, byl použit v každé datové sadě k seskupení a identifikovat upregulované a downregulované geny v podmínkách SMG ve srovnání s podmínkami GG. Geny s p-hodnotami menšími než 0,05 a násobnou změnou větší než 2 byly vybrány jako rozdílně exprimované geny DEG v podmínkách SMG. Následně se DEG každého souboru dat vzájemně protínaly a byly identifikovány společné geny

4.3. Kvantifikace klinickopatologického zapojení identifikovaných genů

Následně byly výsledné geny z užšího seznamu validovány pomocí Kaplan–Meierova plotru (http://www.kmplot.com/; přístup k datu 11. listopadu 2021), online veřejné databáze hodnotící účinek vybraných genů na klinické výsledky pacientů. Celkové přežití (OS) bylo definováno jako doba od stanovení diagnózy (v měsících) do smrti. Údaje o genové expresi a informace o přežití jsou odvozeny z Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) a European Genome-phenome Atlas (EGA). Pacienti byli rozděleni do dvou skupin: (1) vysoká exprese (s hodnotami TPM nad horním kvartilem) a (2) nízká/střední exprese (s hodnotami TPM pod horním kvartilem). Kaplan-Meierovy grafy byly použity k porovnání OS pacientů s plicním adenokarcinomem (LUAD) s vysokou/střední expresí a nízkou expresí kandidátních genů.

4.4. Obohacené ontologické shlukování pro identifikované geny

Abychom prozkoumali, zda identifikované geny sdílejí společné cesty, byla provedena analýza obohacení dráhy genové ontologie (GO) pro identifikované geny pomocí webového nástroje Metascape (https://metascape.org/; přístupný 11. listopadu 2021) pro komplexní anotaci seznamu genů. a analytický zdroj vedle GEO2R

4.5. Buněčná linie a buněčná kultura

Buněčná linie alveolárního bazálního epitelu (A549) lidského adenokarcinomu, široce používaná jako model pro plicní adenokarcinom, byla pěstována v médiu Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)-1640 doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS; Sigma, St. Louis, MO, USA) a 100 jednotek/ml penicilin/streptomycin (P/S; Sigma, St. Louis, MO, USA). Buněčná linie byla kultivována ve zvlhčeném inkubátoru při 37 ◦C v atmosféře 5% CO2. Když buňky dosáhly konfluence, byly sklizeny s použitím 0,5% trypsinu, centrifugovány při 100 x g po dobu 5 minut a použity v případě potřeby.

4.6. Mikrogravitace

Buňky rakoviny plic (A549) byly kultivovány v 2D klinostatovém systému napodobujícím prostředí blízké nulové gravitaci (mikrogravitaci). Tento Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Houston, TX, USA) je bioreaktor vybavený nádobou na buněčnou kulturu obsahující mikroporézní perfuzní jádro a in-line okysličovací systém, který poskytuje živiny a externí plynování média, tím je zajištěna správná výměna plynů a prostředí buněčné kultury s nízkým střihem. Komora byla naplněna kultivačním médiem obsahujícím buňky. Tato komora se horizontálně otáčela kolem jedné osy kolmé na gravitační sílu rychlostí 10 ot./min. 2D klinostat byl umístěn do 37 ◦C zvlhčeného inkubátoru v atmosféře 5% CO2. Buňky A549 byly sklizeny po simulaci mikrogravitace (SMG) ve 24, 48 a 72 hodinách. Pro vytvoření srovnatelného prostředí pro rakovinu plic byly buňky A549 kultivovány na kultivačních miskách v GG v nerotovaném nebo statickém stavu a byly udržovány v blízkosti zařízení uvnitř zvlhčeného inkubátoru (37 ◦C). Tyto buňky jsou označovány jako kontrolní skupina a byly také sklizeny po 24, 48 a 72 hodinách.

4.7. Test buněčné životaschopnosti

Pro podmínky GG byly buňky A549 nasazeny do 24-jamkových destiček pro kultivaci buněk v hustotě 3.0 × 104 buňky na 500 ul. Buňky byly sklizeny trypsinizací 24, 48 a 72 hodin po naočkování a poté centrifugovány při 200 x g po dobu 5 minut. Získané buněčné pelety byly rekonstituovány v kultivačním médiu. Pro podmínky SMG byly buňky A549 nasazeny do 2D rotačního systému klinostatu v hustotě 6,0 x 104 buněk na 1 ml. Buňky byly sklizeny 24, 48 a 72 hodin po expozici SMG, poté centrifugovány při 200 x g po dobu 5 minut. Získané buněčné pelety byly rekonstituovány v kultivačním médiu. Byl proveden test vyloučení barviva trypanovou modří (Sigma, USA). Počet buněk byl stanoven pomocí CellDrop™ Automated Cell Counter.

4.8. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR)

Hladiny genové exprese (hladiny mRNA) in silico identifikovaných genů (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP a BPIFA1) spolu s genovými markery EMT (tabulka 3) byly také stanoveny v buňkách A549 pomocí qRT-PCR. Stručně, extrakce celkové RNA z buněk byla provedena pomocí RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Německo) ve 24, 48 a 72 h při GG a po expozici SMG podle protokolů výrobce. Jeden ug celkové RNA byl reverzně transkribován do jednořetězcové komplementární DNA (cDNA) v reakčním objemu 20 ul s použitím soupravy pro syntézu cDNA iScript™ (Thermo, Waltham, MA, USA). qRT-PCR byla provedena pomocí PowerUp™ Sybr™ Green master mixu (Thermo, USA) na stroji Quant Studio 5 pcr (Thermo, USA). Kroky PCR amplifikace byly následující: počáteční denaturační krok při 95 °C po dobu 3 minut, teplota nasedání cílového genu po dobu 30 s a poté 72 °C po dobu 30 s. Pro každý gen byla získána hodnota prahu fluorescence. ∆∆Metoda Cq byla použita k výpočtu relativní násobné změny v genové expresi po normalizaci na provozní gen, glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázu (GAPDH).

Table 3. List of human primers. NOX1, NADPH Oxidase 1; GDA, Guanine Deaminase; TCN1, Transcobalamin 1; FCGBP, Fc Gamma Binding Protein; BPIFA1, BPI Fold Containing Family A Member 1; AZGP1, Alpha-2-Glycoprotein 1; CFB, Complement Factor B; VTCN1, V-Set Domain Containing T Cell Activation Inhibitor 1; AGR3, Anterior Gradient 3; CTS1, chimeric tumor suppressor 1; F5, Coagulation Factor V; CEACAM6, CEA Cell Adhesion Molecule 6; BPIFB1, BPI Fold Containing Family B Member 1; ZO-1, Zonula occludens protein 1; MMP-9, Matrix metalloproteinase 9; MMP-2, Matrix metalloproteinase 2; and GAPDH, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

4.9. Analýza interakce genu - genu

Data z in vitro qRT-PCR byla implementována do analýzy interakce gen-gen pomocí webového nástroje in silico GeneMANIA (http://genemania.org/; přístupný 11. listopadu 2021), síťového algoritmu pro predikci genových funkcí pomocí velkého souboru funkční asociační data. To bylo provedeno za účelem dalšího hodnocení interakcí mezi/mezi vybranými kandidátními geny; FCGBP, CST1, F5, CFB a BPIFB1 s geny EMT; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 a SNAI1, stejně jako geny související s migrací buněk, MMP2 a MMP9.

4.10. Statistická analýza

K provedení statistické analýzy byl použit software GraphPad Prism. Výsledky jsou vyjádřeny jako jednotlivá data nebo jako průměr ± standardní odchylka (SD). K porovnání různých skupin byl použit Studentův t-test. Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny pomocí jednocestné ANOVA rozptylu (ANOVA). byly určeny p-hodnoty a byly stanoveny hodnoty p < 0.05, p < 0,01, p < 0,001 (*, ** a ***, v tomto pořadí) považovány za významné. Všechny experimenty byly provedeny trojmo (n=3).

Reference

1. Bílá, RJ; Averner, MJN Lidé ve vesmíru. Příroda 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]

2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modelování dopadu mikrogravitace na buněčné úrovni: Důsledky pro lidská onemocnění. Přední. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]

3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Integrativní analýza regulačního modulu odhaluje asociace mikrogravitace s dysfunkcemi vícetělových systémů a tumorigenezí. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]

4. karas, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; a kol. Dysregulace imunitního systému během kosmického letu: Potenciální protiopatření pro mise na průzkum hlubokého vesmíru. Přední. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]

5. Nassef, MZ; Mělník, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Buňky rakoviny prsu v mikrogravitaci: Nové aspekty výzkumu rakoviny. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]

6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Ochrana proti neurodegenerativním onemocněním na Zemi a ve vesmíru. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]

7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Mělník, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Skutečná mikrogravitace ovlivňuje cytoskelet a fokální adheze v lidských buňkách rakoviny prsu. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]

8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Indukce apoptózy a změna buněčné adherence v lidských buňkách rakoviny plic při simulované mikrogravitaci. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]

9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Mikrogravitace indukuje přechodnou EMT v lidských keratinocytech časnou down-regulací E-cadherinu a remodelací buněčné adheze. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]

10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Syn, KH; Lee, JW Simulovaná mikrogravitace s plovoucím prostředím podporuje migraci nemalobuněčného karcinomu plic. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]

11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Kmenové buňky rakoviny plic ztrácejí po vystavení mikrogravitaci výchozí stav kmene. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]

12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; a kol. Simulovaný stav beztíže mění cytoskelet a proteiny extracelulární matrix v buňkách papilárního karcinomu štítné žlázy. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, J.; Mikrogravitace, L. Nádorové buňky v mikrogravitaci. In Into Space: A Journey of How Humans Adapt and Live in Microgravity; IntechOpen: Londýn, Spojené království, 2018; Svazek 139, s. 259–268.

14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Boj proti rakovině pomocí mikrogravitace: Mnohobuněčný sféroid jako model metastázy. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]

15. Schabath, MB; Cote, pokrok a priority rakoviny ML: Rakovina plic. Cancer Epidemiol. Biomark. Předchozí 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]

16. Chung, JH; Ahn, CB; Syn, KH; Yi, E.; Syn, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Simulované účinky mikrogravitace na proliferaci a migraci buněk nemalobuněčného karcinomu plic. Aerosp. Med. Hučení. Provést. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]

17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Li, T.; a kol. Simulovaná mikrogravitace mění metastatický potenciál buněčné linie lidského adenokarcinomu plic. Vitr. Buňka. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]

18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Charakteristické znaky rakoviny: Příští generace. Cell 2011, 144, 646–674. [CrossRef]

19. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Epiteliálně-mezenchymální přechod u rakoviny: historický přehled. Přel. Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]

20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT transkripční faktory se podílejí na změněné buněčné adhezi při simulovaném mikrogravitačním efektu nebo přetížení regulací E-cadherinu. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]

21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrogravitace, kmenové buňky a rakovina: Nová naděje pro léčbu rakoviny. Stem Cells Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]

22. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Epiteliálně-mezenchymální přechod: Charakteristický znak při tvorbě metastáz spojujících cirkulující nádorové buňky a rakovinné kmenové buňky. Patobiologie 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]

23. Yan, T.; Tian, ​​D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Ano, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP je prognostický biomarker a je spojen s imunitní infiltrací u gliomu. Přední. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]