Lidské amniotické mezenchymální kmenové buňky zmírňují AGVHD po Allo-HSCT regulací interakcí mezi střevní mikrobiotou a střevní imunitou

Abstraktní

Akutní reakce štěpu proti hostiteli (aGVHD) po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk představuje jednu z nejobtížnějších výzev. Dysbióza střevní mikroflóry může pokračovat s aGVHD a mezenchymální kmenové buňky (MSC) mají slibný terapeutický potenciál pro aGVHD. Zda však hAMSC ovlivňují střevní mikrobiotu během zmírňování aGVHD, zůstává neznámé. V souladu s tím jsme se snažili definovat účinky a základní mechanismy lidských MSC odvozených z amniotické membrány (hAMSC), které regulují střevní mikrobiotu a střevní imunitu u aGVHD. Zavedením humanizovaných myších modelů aGVHD a léčby hAMSC jsme zjistili, že hAMSC významně zlepšily symptomy aGVHD, zvrátily imunitní nerovnováhu podskupin T buněk a cytokinů a obnovily střevní bariéru. Kromě toho se po léčbě hAMSC zlepšila diverzita a složení střevní mikroflóry. Spearmanova korelační analýza ukázala, že existuje korelace mezi střevní mikroflórou a proteiny těsného spojení, imunitními buňkami a cytokiny. Náš výzkum naznačil, že hAMSC zmírnily aGVHD podporou normalizace střevní mikrobioty a regulací interakcí mezi střevní mikrobiotou a střevní bariérou, imunitou.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Klíčová slova

Akutní reakce štěpu proti hostiteli · Amniotické mezenchymální kmenové buňky · Střevní mikroflóra · Střevní bariéra · Střevní imunita

Úvod

Primární výhodou alogenní transplantace hematopoetických kmenových buněk (allo-HSCT) je silná protinádorová odpověď v důsledku účinku štěpu proti leukémii (GVL), který je spouštěn rozpoznáním peptidů vznikajících v důsledku rozdílů v genomových polymorfizmech mezi pacientem a pacientem. dárce. Akutní reakce štěpu proti hostiteli (aGVHD) se však točí kolem rozvoje poškození tkáně příjemce v důsledku ataku allo-reaktivních dárcovských T buněk a představuje život ohrožující hlavní komplikaci v alloHSCT [1, 2]. Bylo popsáno, že střevní mikrobiální porucha vyvolává zánětlivé reakce a koreluje s onemocněními spojenými se zánětem [3, 4]. Četné studie ukázaly, že poruchy ve střevní mikroflórě jsou základním faktorem spouštějícím aGVHD po allo-HSCT a stávají se novým cílem léčby [5, 6]. Specificky je dysbióza střevní mikroflóry u aGVHD obvykle charakterizována ztrátou diverzity střevních bakterií a růstem oportunních patogenů [6]. U gastrointestinální GVHD narušená slizniční bariéra iniciuje aktivaci hostitelských buněk prezentujících antigen a dárcovských T buněk, která kulminuje v diferenciaci T-buněk podle paradigmat patogenního typu-1 a typu{20}} na úkor tolerogenních regulačních T- vzory buněk [7]. Primárně na základě 16S ribozomální RNA (16S rRNA) sekvenování ukázalo, že s GVHD bylo spojeno několik druhů střevní mikroflóry, a například klostridie produkující butyrát jsou spojeny s udržením funkce epiteliální bariéry a útlumem akutní GVHD [8] ]. Mezenchymální kmenové buňky (MSC) si v posledním desetiletí získaly velkou pozornost díky jejich sebeobnovovacímu a víceliniovému diferenciačnímu potenciálu a také imunomodulačním vlastnostem [9]. Předpokládá se, že MSC umožňují poškozeným tkáním vyvážené zánětlivé a regenerační mikroprostředí v přítomnosti silného zánětu a jsou široce používány k léčbě imunitních poruch, u kterých se nejúspěšnější klinická aplikace podílí na léčbě GVHD [10]. Lidské amniotické mezenchymální kmenové buňky (hAMSC) jsou perinatální kmenové buňky, které mají schopnost diferenciace podobnou embryonálním kmenovým buňkám a imunomodulační vlastnosti podobné dospělým kmenovým buňkám. Sdílení fenotypů podobných typickým MSC, hAMSC se staly slibným zdrojem kmenových buněk díky snadnému, neinvazivnímu a bezpečnému získávání tkání, bohatému výtěžku buněk a velmi nízkým etickým a morálním sporům ve srovnání s kmenovými buňkami z jiných zdrojů. Lidské AMSC mají výhody nízké imunogenicity a žádné tumorigenicity, což z nich dělá ideální buněčný zdroj pro buněčnou terapii [11, 12]. Experimenty in vitro potvrdily, že hAMSC vykazovaly vyšší proliferační kapacitu a větší schopnost dlouhodobého růstu než MSC derivované z kostní dřeně [13, 14]. Četné studie prokázaly, že hAMSC mají potenciál zmírňovat mnoho zánětlivých onemocnění, včetně zánětlivého onemocnění střev, osteoartritidy a autoimunitního onemocnění [11]. Naše nedávná studie ukázala, že hAMSC zlepšily aGVHD regulací rovnováhy T efektorových a Treg buněk [15]. Účinek a mechanismus hAMSC na střevní mikrobiální poruchu u GVHD však nejsou známy. Zde se zaměřujeme na zkoumání potenciálního dopadu hAMSC na aGVHD, stejně jako na střevní mikroekosystém. Byla by to první studie, která by odhalila střevní mikroflóru a její korelaci se střevní imunitou po léčbě aGVHD hAMSC.

Materiály a metody

Izolace, kultivace a identifikace hAMSC

hAMSC byly extrahovány, jak bylo popsáno dříve [15]. Buňky třetí pasáže (P3) byly sklizeny z identifikace fenotypu pomocí barvení protilátkami proti CD34 (581, BD Pharmingen, USA), CD45 (HI30, BD Pharmingen, USA), HLA-DR (G46-6, BD Pharmingen , USA), CD11b (ICRF44, BD Pharmingen, USA), CD90 (5E10, BD Pharmingen, USA), CD73 (AD2, BD Pharmingen, USA) a CD105 (SN6, bioscience, USA), a poté analyzovány průtokovým cytometrem ( BD FACS Canto II). Buňky byly zkontrolovány na jejich víceliniovou diferenciaci pomocí specifického indukčního média (BGscience, Čína) a obarveny olejovou červení-O a Alizarinovou červení na adipogenezi a osteogenní diferenciaci, v daném pořadí. Pro experimenty byly použity hAMSC v pasážích 3 až 6.

cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému

Sbírka lidských PBMC

Vzorky plazmy byly získány od zdravých dobrovolníků s písemným informovaným souhlasem. Mononukleární buňky lidské periferní krve (PBMC) byly izolovány z periferní krve hustotní centrifugací Ficoll-Hypaque (Tianjin Haoyang, Čína), promyty PBS, suspendovány v pufru pro lýzu červené krve (Solarbio, Čína) při 4 stupních po dobu 15 minut. Znovu promyjte a poté suspendujte v PBS pro injekci do ocasní žíly myším NPG.

Myši

Samci a samice myší NPG ve věku 8–10 týdnů a 25–30 g myších samců a samic NPG byly zakoupeny od společnosti Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. a chovány za podmínek SPF v 12hodinovém cyklu světlo-tma s konstantní teplotou a vlhkostí. Všechny postupy na zvířatech byly schváleny Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití na Southern Medical University (č. L2019132) v souladu s pokyny Čínské národní rady pro zdraví a lékařský výzkum pro experimentování na zvířatech.

Akutní GVHD zvířecí model a léčba

Myší model aGVHD byl vytvořen, jak bylo popsáno dříve [15]. Pro léčbu bylo 5 x 105 hAMSC na myš (zde skupina hAMSC) a PBS (zde skupina aGVHD) injikováno ocasní žílou do každé myši třetí den po transplantaci. Ve všech myších modelech byly myši každé dva dny kontrolovány na morbiditu a změny hmotnosti. U každé myši byly skórovány patologické rysy, včetně úbytku hmotnosti, shrbeného držení těla, naježené srsti, kožních lézí, snížené pohyblivosti a průjmu, a poté hodnoceny podle klinického bodovacího systému aGVHD upraveného od systému původně popsaného Cookem [16]. V některých případech myši ve skupině aGVHD trpěly těžkou aGVHD a myši ve skupině hAMSC byly třetí den po léčbě utraceny, aby se odebrala periferní krev a cílové orgány včetně jater, sleziny, plic a střev. Výkaly těchto myší byly odebrány před usmrcením.

HAMSC značené GFP a sledování in vivo

GFP-značené hAMSC byly založeny a identifikovány, jak bylo popsáno dříve [15]. Stručně řečeno, transfekovali jsme gen zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) do hAMSC s lentivirem jako vektorem. 5 x 105 GFP-značených hAMSC suspendovaných v 500 ul PBS bylo injikováno do aGVHD myší přes ocasní žílu. Po 24 hodinách a 72 hodinách byly myši usmrceny, aby se odebrala střeva a poté byly vytvořeny zmrazené řezy. K rozlišení buněk příjemce bylo použito kontrastní barvení DAPI.

Histopatologické hodnocení

Cílové orgány aGVHD byly odebrány v době nekropsie a poté zpracovány na bloky zalité v parafínu, aby se vytvořily 5-μm silné řezy pro barvení hematoxylinem a eosinem (H&E). Histologické skóre bylo hodnoceno na základě destrukce tkáňové struktury a infiltrace lymfocytů [17]. Pro imunohistochemii byly řezy deparafnizovány, rehydratovány a ošetřeny 3% H2O2 v methanolu po dobu 20 minut, aby se inaktivovala aktivita endogenní peroxidázy. Poté byly řezy podrobeny získání antigenu a ošetřeny sérovým albuminem po dobu 1 hodiny. Následně byly řezy inkubovány s králičími anti-lidskými CD45 protilátkami (EP322Y, Abcam, Anglie) nebo ZO-1 protilátkami ((EPR19945-296, Abcam, Anglie) po dobu 1 hodiny při 37 stupních. protilátky byly detekovány pomocí sekundární protilátky konjugované s HRP (Genentech, USA) a vizualizovány pomocí DAB. Pozitivní oblast byla analyzována pomocí Image J.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

16S rRNA sekvenování fekální mikrobioty

Fekální genomová DNA byla extrahována z 0,1 g zmrazených vzorků stolice pomocí soupravy EZNA® stolice DNA Kit (Omega BioTek, Norcross, GA, USA) podle protokolu výrobce. S použitím genomové DNA jako templátu byly k zesílení použity specifické primery (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ a 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) s čárovými kódy a PremixTaq (TaKaRa, Čína). hypervariabilní oblasti V3-V4 bakteriálního genu 16S rRNA. Po amplifikaci a purifikaci byl celý genom vzorku sekvenován na vysokokapacitní sekvenační platformě Illumina Hiseq nebo Miseq od Magigene Technology Co., Ltd. (Guangzhou, Čína), aby se získala nezpracovaná data ve formátu FASTQ. Analýzy sekvenčních dat byly prováděny především pomocí platformy Magichand.

Průtoková cytometrická analýza

Cílové orgány aGVHD a periferní krev myší byly získány a připraveny do jednobuněčné suspenze. Buňky byly obarveny monoklonálními protilátkami proti CD3 (UCHT1, Biolegend, USA), CD4 (RPA-T4, Invitrogen, USA), CD8 (RPA-T8, Biolegend, USA), CD25 (BC96, Biolegend, USA) nebo izotypově odpovídající kontrolní IgG (eBioscience, USA) po dobu 30 minut při pokojové teplotě ve tmě. Poté byly buňky zpracovány lyzačním pufrem (BD Pharm Lyse™) při 4 stupních ve tmě po dobu 15 minut. Intracelulární barvení Foxp3 (236A/E7, Invitrogen, USA) bylo provedeno podle doporučení výrobce (Fixation/Permeabilization Solution Kit; eBioscience). Poté byly provedeny polychromatické analýzy průtokovou cytometrií na průtokovém cytometru.

Kvantifikace cytokinů

Hladiny cytokinů v séru a tkáňovém supernatantu myší byly stanoveny pomocí cytokinové soupravy Cytometric Bead Array (CBA) Human Thl/Th2/Th17 (BD Pharmingen, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, 50 μl každého ze vzorků supernatantu bylo inkubováno s 50 μl smíšených kuliček pro zachycení lidských Th1/Th2/Th17 cytokinů a 50 μl lidského Th1/Th2/Th17 PE detekčního činidla při pokojové teplotě ve tmě, poté suspendováno pro analýzu průtokovou cytometrií o 3 hodiny později.

Kvantitativní PCR v reálném čase

Celková RNA byla extrahována z myší tkáně tlustého střeva po izolaci pomocí činidla Trizol (TaKaRa, Čína). Celková RNA byla použita jako templát pro reverzní transkripci cDNA. -aktin byl použit jako interní reference. Exprese mRNA byla měřena pomocí qPCR s použitím následujících primerů: ZO-1-F, 5'-ACCACCAACCCGAGAAGAC-3' a ZO- 1-R, 5'-CAGGAGTCATGGACGCACA-3 '; occludin-F, 5'-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3', a occludinR, 5'-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3'; -actin-F, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' a -actin-R, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'. K měření hladin exprese RNA byla použita metoda 2-ct.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Hladiny D-LA a DAO v plazmě byly měřeny pomocí souprav ELISA (Jingmei, Čína) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, odebrané plazmatické supernatanty byly vloženy do 96-jamkových destiček potažených specifickou protilátkou. Absorbance byla zaznamenána při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Multikan MK3, Thermo Fisher Scientific).

Statistická analýza

Data byla prezentována jako průměr ± SD. Pomocí GraphPad Prism8 byl proveden a vizualizován t-test nezávislých vzorků.0. Analýza sekvenačních dat 16S rRNA byla provedena pomocí platformy Magichand (http://cloud.magigenecom/). Korelační analýza mezi střevní mikroflórou a imunitou byla provedena pomocí R balíčků (v3.6.3), aby se zobrazila korelační matice. P hodnoty<0.05 were considered statistically significant. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. not signifcant.

Výsledek

Identifikace hAMSC

hAMSC vykazovaly v kultuře polygonovou nebo fibroblastům podobnou morfologii (obr. 1A) a byly silně pozitivní na povrchovou expresi MSC-specifických markerů CD90, CD105 a CD73, ale negativní na CD34, CD45, HLA-DR a CD11b (obr. 1C). Pokud jde o víceliniovou diferenciaci, naše výsledky ukázaly, že hAMSC prokázaly adipocytickou a osteoblastickou diferenciaci (obr. 1B).

hAMSC významně zmírnily příznaky aGVHD u myší

Nejprve jsme hodnotili terapeutický účinek hAMSC na aGVHD. Ve srovnání se skupinou aGVHD, hAMSC významně zlepšily aGVHD, o čemž svědčí výrazně snížená ztráta hmotnosti (obr. 2B) a snížené klinické skóre aGVHD (obr. 2C). Kromě toho skupina hAMSC měla významně vyšší míru přežití ve srovnání s myší aGVHD (obr. 2D). Patologická histologická analýza ukázala, že aGVHD způsobilo vážné poškození tkáně a infiltraci leukocyty. hAMSC, jak bylo prokázáno pomocí H&E, zeslabily narušení tkáně a infiltraci exogenních T buněk v cílových orgánech aGVHD (obr. 2E). Výsledky IHC také potvrdily, že hAMSC zlepšily abnormální patologické projevy (obr. 2F). Tyto výsledky naznačují, že hAMSC měly potenciál zlepšit symptomy aGVHD u myší s aGVHD.

hAMSC ovlivnily hostitelskou imunitu u myší aGVHD

Abychom pochopili základní imunomodulační mechanismy, kterými hAMSC snižují aGVHD, měřili jsme aktivaci a expanzi T buněk v periferní krvi a cílových orgánech. Test průtokovou cytometrií odhalil, že hAMSC pozoruhodně inhibovaly počet CD3+CD4+T a CD3+CD8+T buněk v krvi a cílových orgánech (obr. 3A, B). Navíc podíl CD4+CD25+Foxp3+Tregů v krvi a cílových orgánech myší ve skupině hAMSC byl významně vyšší než ve skupině aGVHD (obr. 3C). . Dále jsme zkoumali účinek hAMSC na profil cytokinů (obr. 4). Podávání hAMSC vedlo ke zřejmému poklesu hladin IL-17A, IFN-, TNF, IL-6 a IL{13}} v cílových orgánech a krvi ve srovnání s hladinami ve skupině aGVHD, kromě hladiny TNF ve slezině. Mezitím, kromě hladin IL-10 v játrech, myši léčené hAMSC vykazovaly podstatně zvýšené hladiny IL-10 a IL-4 v cílových orgánech a krvi. Celkově vzato, hAMSC hrály ochrannou roli v aGVHD tím, že zvrátily imunitní nerovnováhu podskupin T buněk a cytokinovou bouři.

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

hAMSC zlepšily poškození střevní bariéry u myší aGVHD

Abychom zjistili, zda hAMSC mohou opravit střevní bariéru v aGVHD, nejprve jsme pozorovali, zda hAMSC mohou migrovat do střev. Jak je znázorněno na obr. 5A, GFP-značené hAMSC byly detekovány ve střevech po injekci do hAMSC a mohly se přihojit a infiltrovat do střev. Poté jsme navrhli histopatologické hodnocení tkáně tenkého střeva. Ve skupině aGVHD bylo střevo erodováno a nekrotické, střevní klky byly zjevně zničeny, klky byly zlomeny a masivní leukocyty infiltrovaly střevní sliznici, submukózu a lamina propria. Střevní klky byly pravidelně uspořádány a po léčbě hAMSC nedošlo k žádnému zlomení střevních klků nebo oddělení epitelu klků (obr. 5B). Infiltrace lidských lymfocytů byla také pozorována pomocí imunohistochemie ve střevech ve skupině aGVHD, zatímco léčba hAMSC mohla snížit jejich infiltraci (obr. 5C). Abychom vyhodnotili ochranný účinek hAMSC na integritu střevní sliznice, provedli jsme imunohistochemii k detekci účinku na ZO-1. Ve skupině léčené hAMSCs byla hladina exprese proteinu s úzkým spojením ZO-1 významně zvýšena ve srovnání se skupinou aGVHD (obr. 5D). Zkoumali jsme také hladiny exprese mRNA střevních proteinů těsného spojení (TJ) a plazmatické hladiny kyseliny D-mléčné (D-LA) a diaminoxidázy (DAO), abychom určili funkci střevní bariéry a střevní permeabilitu. Při intravenózním podání by hMASC mohly významně zvýšit hladiny exprese mRNA ZO-1 a Occludinu, klíčových proteinů TJs (obr. 5E, F), a zároveň snížit hladiny D-LA a DAO (obr. 5G, H). Když se tedy objevila aGVHD, střevní bariéra byla poškozena redukcí střevních proteinů těsného spojení a zvýšením střevní permeability. Mezitím by hAMCS mohly výrazně zvrátit narušení střevní bariéry.

Obr. 1 Fenotypová a funkční charakterizace hAMSC. (A) Reprezentativní mikrofotografie hAMSC z pasáže 0 do 3 (bez barvení, 100×). (B) Schopnost víceliniové diferenciace hAM SC. Adipogenní diferenciace hAMSC (vlevo) byly obarveny olejovou červení-O a osteoblastické diferenciace hAMSC (vpravo) byly obarveny alizarinovou červení (barvení, 100×). (C) Průtoková cytometrická analýza indikující hAMSC pozitivní na CD90, CD105 a CD73, zatímco negativní na CD34, CD45, CD11b a HLA-DR

Obr. 2 hAMSC zmírnily aGVHD u NPG myší. (A) Schematický diagram ilustrující rozvrh podávání hAMSC v myších modelech aGVHD. (B) Změny tělesné hmotnosti v různých skupinách (n=10). (C) klinické skóre aGVHD (na základě úbytku hmotnosti, shrbeného držení těla, zježené srsti, kožních lézí, snížené pohyblivosti a průjmu) v různých skupinách (n=10). (D) Přežití mezi různými skupinami (n=10). (E) Reprezentativní mikroskopické snímky barvení H&E (400×) a histologické skóre (na základě destrukce struktury tkáně a infltrace lymfocytů) (n=4). (F) Reprezentativní mikroskopické snímky imunohistochemie (400×) a podíl CD45 pozitivní oblasti (n=4). Hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD

Obr. 3 hAMSC inhibovaly expanzi donorových T buněk, zatímco zesilovaly tvorbu nebo expanzi Tregs in vivo. (A) Průtoková cytometrická analýza CD3+CD4+T buněk (n=6), (B) Průtoková cytometrická analýza CD3+CD8+ T buňky(n=6), (C) Analýza průtokovou cytometrií CD4+CD25+Foxp3+Tregs (n=6). Hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD

Obr. 4 hAMSC downregulovaly prozánětlivé cytokiny IL-17A, IFN-, TNF, IL-6, IL-2 a upregulovaly protizánětlivé cytokiny IL-10 a IL -4 in vivo (n=5). Hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD

Alternace střevní mikrobioty po léčbě hAMSC u myší aGVHD

Sekvenování 16S rRNA bylo provedeno ve fekální bakteriální DNA izolované z různých skupin myší. Indexy diverzity, včetně indexů OUT, Chao1 a Shannon, vykazovaly podobné tendence a myši léčené hAMSC obsahovaly mikroflóru s výrazně vyšší diverzitou ve srovnání se skupinou aGVHD (obr. 6A). Hlavní souřadnicová analýza (PCoA) založená na Un vážené unifrac vzdálenosti, Manhattanské vzdálenosti a Bray-Curtisově metrické vzdálenosti poskytla rozptýlené datové body na grafech dvou skupin, přestože rozdíl nebyl významný (obr. 6B). Následně jsme hodnotili krajinu střevní mikroflóry, abychom dále prozkoumali potenciální rozdíl ve složení mezi těmito dvěma skupinami. Bylo vypočteno celkem 773 OTU a skupina hAMSC měla vyšší OTU ve srovnání se skupinou aGVHD (obr. 6C). Pokud jde o bakteriální složení na úrovni kmene, Firmicutes a Bacteroidetes byly dva nejvíce převládající kmeny (obr. 6D). Také jsme zorganizovali srovnávací teplotní mapu pro analýzu střevní mikroflóry mezi těmito dvěma skupinami (obr. 6E). Rod Odoribacter a Ruminococcus_1 vykazoval relativně vysoké zastoupení ve skupině hAMSC, což jsou mikroby důležité pro udržení střevní homeostázy (obr. 6F, G). Abychom potvrdili, která bakterie byla změněna léčbou hAMSC a následně ovlivnila progresi onemocnění proti aGVHD, provedli jsme srovnání tříd s vysokými rozměry pomocí lineární diskriminační analýzy (LDA) velikosti účinku (LEfSe), která detekovala výrazné rozdíly v převaze bakteriálních komunit mezi ty dvě skupiny. Jak je ukázáno na (Obr. 6H, I), Streptococcaceae (čeleď a rod Streptococcus), Paludibacteraceae, F0058 a Delftia byly klíčovými typy bakterií přispívajících k dysbióze střevní mikroflóry ve skupině aGVHD. Nicméně prospěšné bakterie Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter a Clostridia (třída a řád Clostridiales) vykazovaly relativní obohacení ve skupině hAMSC, což může být spojeno se zmírněním aGVHD zprostředkovaným hAMSC. Dohromady se rozmanitost a složení střevní mikrobioty zlepšily po podání hAMSC a posunuly se v celkovém trendu, který byl pro tělo prospěšný.

cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému

hAMSC regulovaly interakce mezi střevní mikrobiotou a střevní imunitou

Pro pochopení potenciálního vztahu mezi střevní mikroflórou a střevní slizniční bariérou byly korelace mezi TJ a střevní mikroflórou na úrovni rodu analyzovány Spearmanovou korelační analýzou. Jak ukazuje obr. 7, existoval pozitivní vztah mezi ZO-1 a prospěšnými bakteriemi, Ruminococcaceae_UCG.014, Muribaculum, Ruminococcus_1 a Ruminiclostridium{5}}. Relativní množství prospěšných bakterií Roseburia, Odoribacter, Ruminococcus_1 a Ruminococcaceae_UCG.014 vykazovalo dramaticky pozitivní korelace s Occludinem. Dále jsme provedli korelační analýzu mezi střevní mikroflórou a střevní imunitní bariérou Spearmanovou metodou rankové korelace (obr. 7). Pozorovali jsme, že nárůst Roseburia, Muribaculum a Ruminococcus _1 negativně koreloval s procentem CD3 +CD4+T buněk. Navíc nárůst prospěšných bakterií, Ruminococcus{13}} a Ruminiclostridium _9, pozitivně koreloval s procentem Tregs, zatímco negativně koreloval s IL-17. Množství Lactobacillus a Candidatus_Arthromitus negativně korelovalo s IFN- . Mezi množstvím Muribaculum a IL byla negativní korelace-2. Zvýšení četnosti Candidatus{19}}Saccharimonas a snížení počtu Escherichia. Množství shigel pozitivně korelovalo s hladinou IL-10 (obr. 7). Výsledky korelační analýzy ukázaly, že hAMSC zlepšily zánětlivé prostředí hostitele a regulovaly střevní homeostázu, která může být spojena s modulací střevní mikrobioty, a následně zabránily aGVHD.

Obr. 5 hAMSC zlepšily dysfunkci střevní bariéry u aGVHD myší. (A) HAMSC značené GFP infiltrovaly do střev. (B) Reprezentativní mikroskopické snímky H&E barvení střev (400×) a histologické skóre (na základě destrukce tkáňové struktury a infiltrace lymfocytů) (n=4). (C) Reprezentativní mikroskopické snímky imunohistochemie (400×) střev a podíl CD45 pozitivní oblasti (n=4). (D) Reprezentativní mikroskopické snímky imunohistochemie (400×) střev a podíl ZO-1 pozitivní oblasti (n=4). (E) Hladiny exprese mRNA ZO-1 a okluzinu (n=3). (F) Plazmatické hladiny D-LA a DAO (n=4).Hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD

Diskuse

Pokročilá mikrobiální analýza poskytla nový pohled na komplexní interakce mezi hostitelem a střevní mikroflórou [18]. Střevní mikroflóra by mohla být po allo-HSCT změněna a je úzce spojena s aGVHD, což naznačuje, že střevní mikroflóra může být novým cílem léčby aGVHD [5]. Četné studie včetně naší nedávné studie zkoumaly a potvrdily terapeutický účinek MSC na aGVHD [15, 19, 20]. Účinek na střevní mikroflóru během tohoto období však zůstává nejasný. V této studii jsme zkoumali dopad hAMSC na aGVHD a potenciální mechanismy v něm in vivo. V souladu s předchozími studiemi [15, 21–23] naše výsledky ukázaly, že hAMSC mají příznivý ochranný účinek na aGVHD u myší, o čemž svědčí oslabené symptomy aGVHD a prodloužené přežití. Také jsme prokázali, že hAMSC vykazovaly imunosupresivní účinek prostřednictvím snížení expanze dárcovských T buněk a zároveň zvýšení generace Tregs v aGVHD. Mezitím by hAMSC mohly downregulovat prozánětlivé cytokiny a upregulovat protizánětlivé cytokiny in vivo, aby inhibovaly zánětlivé reakce. Střevní bariéra, hustá struktura složená z monovrstvy střevních epiteliálních buněk, si zachovává svou integritu a zabraňuje translokaci luminální mikrobioty ve zdravém stavu [24]. Během allo-HSCT poškozují kondicionační režimy střevní bariéru, což je počáteční krok ve vývoji aGVHD, protože umožňuje translokaci bakterií přes bariéru a vede k narušení střevní imunitní homeostázy [24, 25]. Hromadné důkazy prokazují, že MSC mají schopnost reparace tkáně, což bylo prokázáno při opravě integrity střevní bariéry u kolitidních myší [26]. Proteiny těsného spojení, včetně ZO-1 a Occludin, mají zásadní roli ve funkci střevní bariéry a translokace střevní mikroflóry přes narušenou střevní bariéru vyvolává zánět [27]. D-LA pochází ze střevních bakterií a DAO se koncentruje hlavně ve střevní sliznici. Vysoké koncentrace plazmatického D-LA a DAO by tedy mohly částečně odrážet změny střevní permeability a střevní bariérové ​​funkce [28]. V současné době jsme zjistili, že hladiny exprese TJs se dramaticky zvýšily po podání hAMSC, zatímco plazmatické hladiny D-LA a DAO významně poklesly, což naznačuje, že hAMSC by mohly zlepšit dysfunkci střevní bariéry a obnovit střevní permeabilitu. Střevo je jedním z orgánů nejzávažněji postižených aGVHD a výzkum ukázal, že bakterie, zejména střevní mikroflóra, hraje ústřední roli v patogenezi a vývoji aGVHD [5, 6]. Jak bylo uvedeno v předchozích studiích, ztráta bakteriální diverzity pacientů s allo HSCT byla spojena se zvýšenou mortalitou na aGVHD [29, 30]. Fekální dominance oportunními patogeny Enterococcus a Proteobacteria byla také spojena se zvýšenou GVHD [6, 31]. V posledních desetiletích byla věnována zvýšená pozornost korelaci mezi střevní mikrobiotou a léčbou MSC u zánětlivých onemocnění. Bylo prokázáno, že MSC zlepšují dysbiózu střevní mikroflóry při revmatoidní artritidě, sepsi a zánětlivém onemocnění střev [32–34]. Abychom dále prozkoumali mechanismus, kterým hAMSC zlepšují aGVHD, zkoumali jsme dopad hAMSC na střevní mikrobiotu. V současné studii podávání hAMSC prokázalo značný vliv na diverzitu mikrobiálních komunit ve srovnání s žádnou transplantací, což naznačuje, že množství střevní mikroflóry by se po léčbě hAMSC mohlo změnit. V měření diverzity však nebyl žádný významný rozdíl, pravděpodobně kvůli malé velikosti vzorků obou skupin nebo nedostatečnému léčebnému cyklu hAMSC. Analýza využívající srovnávací teplotní mapu v úrovních rodu ukázala, že podávání hAMSC zvýšilo množství prospěšných bakterií Odoribacter a Ruminococcus_1 ve střevní flóře, což byli producenti mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA) s protizánětlivými vlastnostmi [35 , 36]. K identifikaci základních dominantních bakterií zprostředkovaných transplantací hAMSC byla mezi těmito dvěma skupinami provedena analýza LEfSe. Ve srovnání se skupinou aGVHD léčba hAMSC významně zvýšila množství některých prospěšných mikrobů souvisejících s protizánětlivými účinky, jako jsou Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter, Clostridia, které byly všechny popsány jako přínosné pro produkci metabolitů SCFA ve střevní mikrobiotě [ 37–42]. Naše pozorování proto ukázala, že po podání hAMSC se dysbióza střevní mikroflóry zlepšila, což se projevuje zlepšenou diverzitou a zvýšeným relativním množstvím prospěšných bakterií.

Obr. 6 Střídání střevní mikroflóry u aGVHD myší. (A) srovnání -diverzity. (B) srovnání -diverzity. (C) Vennův diagram OTU. (D) Relativní bakteriální hojnost na úrovni kmene. (E) Heatmap hojnosti druhů na úrovni rodu. (F) Relativní abundance Odoribacter na úrovni rodu. (G) Relativní abundance Ruminococcus_1 na úrovni rodu. (H) Kladogram založený na analýze LEfSe. (I) Skóre LDA vypočítané z vlastností odlišně hojných mezi skupinami aGVHD a hAMSC. (AI) n=3 myší na skupinu. Hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD

aGVHD je komplikovaný zánětlivý proces, který je iniciován destrukcí integrity střevní bariéry s následnou translokací střevní mikrobioty a jejích složek. Rozpoznání molekulárních vzorů asociovaných s poškozením a molekulárních vzorů asociovaných s patogeny buňkami prezentujícími antigen indukuje prozánětlivou odpověď včetně aktivace T lymfocytů a cytokinové bouře ke zhoršení poškození střevní bariéry a podpoře rozvoje aGVHD [24, 43]. Na druhé straně střevní mikrobiota a metabolity odvozené od mikrobioty, jako jsou SCFA, hrají důležitou roli při udržování integrity střevní bariéry a střevní homeostázy, stejně jako utváření slizničního imunitního systému a vyvažování obrany hostitele s mikrobiálními složkami a metabolity [24, 44] . Vzájemná komunikace mezi hostitelem a střevní mikroflórou na střevní bariéře reguluje slizniční a systémové imunitní reakce a v patologických stavech může vést ke GVHD [6, 45, 46]. Naznačuje, že střevní mikroflóra úzce souvisí s expresí proteinů těsného spojení [47]. Tato studie ukázala, že exprese mRNA TJs ZO-1 a Occludinu byla negativně korelována s relativním množstvím škodlivých bakterií, zatímco měla pozitivní korelaci s prospěšnými bakteriemi, což naznačuje, že střevní mikroflóra byla důležitá pro udržení integrity střevní bariéra. Střevní mikroflóra je navíc velmi důležitá pro udržení střevní imunitní bariéry [47]. Pozorovali jsme, že některé prospěšné bakterie negativně korelovaly s procentem CD3+CD4+T buněk, ale pozitivně korelovaly s procentem Tregs. Zde jsme odhalili, že prospěšné bakterie, většinou producenti SCFA, negativně korelovaly s prozánětlivými cytokiny, ale pozitivně korelovaly s protizánětlivými cytokiny, zatímco škodlivé bakterie jsou naopak korelovány. Stručně řečeno, významný rozdíl ve střevní mikrobiotě mezi jednotlivými léčbami naznačoval úplný obraz interakcí mezi střevní mikroflórou a střevní bariérou, imunitou. V našich experimentech stále existovalo několik omezení, která stojí za to diskutovat. Za prvé, ačkoli naše studie zkoumala účinky hAMSC na imunitu, střevní bariéru a střevní mikrobiotu u aGVHD, základní mechanismus je stále třeba ověřit v další studii. Za druhé, deplece střevní mikroflóry a transplantace fekální mikroflóry jsou potřebné k řešení kauzálních korelací mezi střevní mikrobiotou, střevní bariérou a imunitou. Za třetí, je opodstatněný další výzkum zkoumající dopad hAMSC na SCFA odvozené z mikrobioty a další metabolity. Závěrem lze říci, že náš výzkum naznačil, že hAMSC zmírnily aGVHD podporou normalizace střevní mikrobioty a regulací interakcí mezi střevní mikrobiotou a střevní bariérou, imunitou. Naše studie je první, která systematicky definuje účinky a základní mechanismy hAMSC regulujících střevní mikroflóru a střevní imunitu u aGVHD.

Obr. 7 Korelační analýza mezi střevní mikroflórou a střevní imunitou. Spearmanova korelační analýza byla provedena mezi relativním množstvím 15 různých střevních mikrobiot (na úrovni rodu) a úrovní exprese mRNA TJs, procentem imunitních buněk a také koncentrací cytokinů ve střevech mezi těmito dvěma skupinami. Hodnoty Spearman r se pohybují od -0,5 (modrá) do 0,5 (červená)

Reference

1. Schmid, C. (2021). O krok blíže ke GVL bez GVHD. Krev, 137(19), 2565–2566. https://doi.org/10.1182/blood.2020010132

2. Chang, Y., Zhao, X., & Huang, X. (2018). Strategie pro posílení a zachování antileukemických účinků bez zhoršení reakce štěpu proti hostiteli. Frontiers in Immunology, 9, 3041. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.03041

3. Zhu, W., Winter, MG, Byndloss, MX, Spiga, L., Duerkop, BA, Hughes, ER, Büttner, L., de Lima Romão, E., Behrendt, CL, Lopez, CA, Sifuentes- Dominguez, L., Huf-Hardy, K., Wilson, RP, Gillis, CC, Tükel, Ç., Koh, AY, Burstein, E., Hooper, LV, Bäumler, AJ, & Winter, SE (2018). Přesná úprava střevní mikroflóry zlepšuje kolitidu. Příroda, 553(7687), 208–211. https://doi.org/10.1038/nature25172

4. Zhao, L., Zhang, F., Ding, X., Wu, G., Lam, YY, Wang, X., Fu, H., Xue, X., Lu, C., Ma, J. , Yu, L., Xu, C., Ren, Z., Xu, Y., Xu, S., Shen, H., Zhu, X., Shi, Y., Shen, Q., … Zhang, C (2018). Střevní bakterie selektivně podporované dietní vlákninou zmírňují diabetes 2. typu. Science (New York, NY), 359(6380), 1151–1156. https://doi.org/10.1126/science.aao5774

5. Shono, Y., & van den Brink, MRM (2018). Poškození střevní mikroflóry při alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Recenze přírody. Rak, 18(5), 283–295. https://doi.org/10.1038/ nrc.2018.10

6. Stafas, A., Burgos da Silva, M., & van den Brink, MRM (2017). Střevní mikrobiota při alogenní transplantaci hematopoetických buněk a reakci štěpu proti hostiteli. Krev, 129(8), 927–933. https://doi.org/10.1182/blood{10}}

7. Wu, K., Yuan, Y., Yu, H., Dai, X., Wang, S., Sun, Z., Wang, F., Fei, H., Lin, Q., Jiang, H & Chen, T. (2020). Střevní mikrobiální metabolit trimethylamin N-oxid zhoršuje GVHD indukcí polarizace makrofágů M1 u myší. Krev, 136(4), 501–515. https://doi.org/10.1182/blood.2019003990

8. Mathewson, ND, Jenq, R., Mathew, AV, Koenigsknecht, M., Hanash, A., Toubai, T., Oravecz-Wilson, K., Wu, S., Sun, Y., Rossi, C ., Fujiwara, H., Byun, J., Shono, Y., Lindemans, C., Calafore, M., Schmidt, TM, Honda, K., Young, VB, Pennathur, S., … Reddy, P. (2016). Metabolity odvozené ze střevního mikrobiomu modulují poškození střevních epiteliálních buněk a zmírňují reakci štěpu proti hostiteli. Nature Immunology, 17(5), 505–513. https://doi.org/10.1038/ni.3400

9. Dave, JR, Chandekar, SS, Behera, S., Desai, KU, Salve, PM, Sapkal, NB, Mhaske, ST, Dewle, AM, Pokare, PS, Page, M., Jog, A., Chivte , PA, Srivastava, RK, & Tomar, GB (2022). Lidské gingivální mezenchymální kmenové buňky si zachovávají své růstové a imunomodulační charakteristiky nezávisle na věku dárce. Science Advances, 8(25), m6504. https://doi.org/10. 1126/sciadv.abm6504

10. Zhao, K., & Liu, Q. (2016). Klinická aplikace mezenchymálních stromálních buněk při transplantaci krvetvorných buněk. Journal of Hematology & Oncology, 9(1), 46. https://doi.org/ 10.1186/s13045-016-0276-z

11. Liu, Q., Huang, Q., Wu, H., Zuo, G., Gu, H., Deng, K., & Xin, H. (2021). Charakteristika a terapeutický potenciál lidských kmenových buněk odvozených z amnia. International Journal of Molecular Sciences, 22(2), 970. https://doi.org/10.3390/ijms22020970

12. Li, J., Zhou, Z., Wen, J., Jiang, F., & Xia, Y. (2020). Lidské amniotické mezenchymální kmenové buňky podporují endogenní regeneraci kostí. Frontiers in Endocrinology, 11, 543623. https://doi.org/10.3389/fendo.2020.543623

13. Díaz-Prado, S., Muiños-López, E., Hermida-Gómez, T., Cicione, C., Rendal-Vázquez, ME, Fuentes-Boquete, I., de Toro, FJ, Blanco, FJ ( 2011). Lidská amniová membrána jako alternativní zdroj kmenových buněk pro regenerativní medicínu. Diferenciace; Výzkum biologické rozmanitosti, 81(3), 162–171. https://doi.org/10.1016/j.dif.2011.01.005

14. Hong, J., Gao, Y., Song, J., Zhuo, W., Sun, H., & Ping, B. (2016). Porovnání biologických charakteristik a imunosupresivní aktivity mezi lidskými amniovými mezenchymálními kmenovými buňkami a mezenchymálními kmenovými buňkami lidské kostní dřeně. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 24(3), 858–864. https:// doi.org/10.7534/j.issn.{8}}.2016.03.041

15. Gao, Y., Li, W., Bu, X., Xu, Y., Cai, S., Zhong, J., Du, M., Sun, H., Huang, L., He, Y Hu, X., Liu, Q., Jin, H., Wang, Q., & Ping, B. (2021). Lidské amniotické mezenchymální kmenové buňky inhibují aGVHD regulací rovnováhy Treg a T efektorových buněk. Journal of Inflammation Research, 14, 3985–3999. https://doi.org/10.2147/ JIR.S323054

16. Cooke, KR, Kobzik, L., Martin, TR, Brewer, J., Delmonte, JJ, Crawford, JM, & Ferrara, JL (1996). Experimentální model syndromu idiopatické pneumonie po transplantaci kostní dřeně: I. Role minoritních H antigenů a endotoxinu. Krev, 88(8), 3230–3239.

17. Yañez, R., Lamana, ML, García-Castro, J., Colmenero, I., Ramírez, M., & Bueren, JA (2006). Mezenchymální kmenové buňky odvozené z tukové tkáně mají in vivo imunosupresivní vlastnosti použitelné pro kontrolu reakce štěpu proti hostiteli. Kmenové buňky (Dayton, Ohio), 24 (11), 2582–2591.

18 Hooper, LV, Littman, DR a Macpherson, AJ (2012). Interakce mezi mikrobiotou a imunitním systémem. Science (New York, NY), 336(6086), 1268–1273. https://doi.org/10.1126/ science.1223490

19. Kelly, K., & Raško, JEJ (2021). Mezenchymální stromální buňky pro léčbu reakce štěpu proti hostiteli. Frontiers in Immunology, 12, 761616. https://doi.org/10.3389/fmmu.2021.761616

20. Macías-Sánchez, MDM, Morata-Tarifa, C., Cuende, N., Cardesa-Gil, A., Cuesta-Casas, M. Á., Pascual-Cascon, MJ, Pascual, A., Martín-Calvo , C., Jurado, M., Perez-Simón, JA, Espigado, I., Garzón López, S., Carmona Sánchez, G., Mata-Alcázar-Caballero, R., & Sánchez-Pernaute, R. (2022 ). Mezenchymální stromální buňky pro léčbu akutní a chronické reakce štěpu proti hostiteli rezistentní na steroidy: Multicentrická zkušenost s použitím ze soucitu. Stem Cells Translational Medicine, 11(4), 343–355. https://doi.org/10.1093/ stcltm/szac003

21. Tago, Y., Kobayashi, C., Ogura, M., Wada, J., Yamaguchi, S., Yamaguchi, T., Hayashi, M., Nakaishi, T., Kubo, H., & Ueda, Y. (2021). Lidské mezenchymální kmenové buňky odvozené z amnia zeslabují xenogenní reakci štěpu proti hostiteli tím, že brání aktivaci a proliferaci T buněk. Scientifc Reports, 11(1), 2406. https://doi. org/10.1038/s{10}}r

22. Yamahara, K., Harada, K., Ohshima, M., Ishikane, S., Ohnishi, S., Tsuda, H., Otani, K., Taguchi, A., Soma, T., Ogawa, H ., Katsuragi, S., Yoshimatsu, J., Harada-Shiba, M., Kangawa, K., & Ikeda, T. (2014). Srovnání angiogenních, cytoprotektivních a imunosupresivních vlastností lidských mezenchymálních kmenových buněk odvozených z amnia a choria. PLoS One, 9(2), e88319. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088319

23. Yamahara, K., Hamada, A., Soma, T., Okamoto, R., Okada, M., Yoshihara, S., Yoshihara, K., Ikegame, K., Tamaki, H., Kaida, K ., Inoue, T., Ohsugi, Y., Nishikawa, H., Hayashi, H., Ito, YM, Iijima, H., Ohnishi, S., Hashimoto, D., Isoe, T., … Fujimori, Y (2019). Bezpečnost a účinnost amniových mezenchymálních kmenových buněk (AM01) u pacientů s akutním onemocněním štěpu proti hostiteli refrakterním na steroidy po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk: protokol studie pro fázi I/II japonské studie. BMJ Open, 9(7), e26403. https://doi.org/10.1136/bmjop cs-2018-026403

24. Lin, D., Hu, B., Li, P., Zhao, Y., Xu, Y., & Wu, D. (2021). Role střevní mikrobioty a mikrobiálních metabolitů u akutní GVHD. Experimentální hematologie a onkologie, 10(1), 49. https:// doi.org/10.1186/s40164-021-00240-3

25. Ghimire, S., Weber, D., Mavin, E., Wang, XN, Dickinson, AM, & Holler, E. (2017). Patofyziologie GvHD a dalších závažných komplikací souvisejících s HSCT. Frontiers in Immunology, 8, 79. https://doi.org/10.3389/fmmu.2017.00079

26. Xu, J., Wang, X., Chen, J., Chen, S., Li, Z., Liu, H., Bai, Y., & Zhi, F. (2020). Mezenchymální kmenové buňky odvozené z embryonálních kmenových buněk podporují integritu a regeneraci epitelu tlustého střeva zvýšením cirkulujícího IGF-1 u kolitidy u myší. Theranostics, 10(26), 12204– 12222. https://doi.org/10.7150/thno.47683

27. Zhao, Y., Huang, J., Li, T., Zhang, S., Wen, C., & Wang, L. (2022). Berberin zlepšuje aGVHD remodelací střevní mikroflóry, potlačením signalizace TLR4 a opravou bariéry tlustého střeva pro inhibici zánětu NLRP3. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 26(4), 1060–1070. https://doi.org/10. 1111/jcmm.17158

28. Yuan, M., Lin, L., Cao, H., Zheng, W., Wu, L., Zuo, H., Tian, ​​X., & Song, H. (2022). Střevní mikroflóra se podílí na ochranném účinku HO-1/BMMSC na transplantaci jater steatotickými jaterními štěpy u potkanů. Frontiers in Microbiology, 13, 905567. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.905567

29. Taur, Y., Jenq, RR, Perales, M., Littmann, ER, Morjaria, S., Ling, L., No, D., Gobourne, A., Viale, A., Dahi, PB, Ponce , DM, Barker, JN, Giralt, S., van den Brink, M., & Pamer, EG (2014). Účinky bakteriální diverzity střevního traktu na mortalitu po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Krev, 124(7), 1174–1182. https://doi.org/10.1182/ krev-2014-02-554725

30. Jenq, RR, Taur, Y., Devlin, SM, Ponce, DM, Goldberg, JD, Ahr, KF, Littmann, ER, Ling, L., Gobourne, AC, Miller, LC, Docampo, MD, Peled, JU, Arpaia, N., Cross, JR, Peets, TK, Lumish, MA, Shono, Y., Dudakov, JA, Poeck, H., … van den Brink, MRM (2015). Intestinální Blautia je spojena se sníženou smrtí na onemocnění štěpu proti hostiteli. Biology of Blood and Marrow Transplantation: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 21(8), 1373–1383. https://doi.org/10.1016/j.bbmt.2015.04.016

31. Le Bastard, Q., Chevallier, P., & Montassier, E. (2021). Střevní mikrobiom při alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk a specifické změny spojené s akutním onemocněním štěpu proti hostiteli. World Journal of Gastroenterology, 27(45), 7792–7800. https://doi.org/10.3748/wjg.v27.i45.7792

32. Li, X., Lu, C., Fan, D., Lu, X., Xia, Y., Zhao, H., Xu, H., Zhu, Y., Li, J., Liu, H & Xiao, C. (2020). Lidské pupeční mezenchymální kmenové buňky vykazují terapeutický potenciál u revmatoidní artritidy regulací interakcí mezi imunitou a střevní mikroflórou prostřednictvím receptoru Aryl uhlovodíku. Hranice v buněčné a vývojové biologii, 8, 131. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00131

33. Sun, J., Ding, X., Liu, S., Duan, X., Liang, H., & Sun, T. (2020). Mezenchymální kmenové buňky odvozené z tukové tkáně zmírňují akutní poškození plic a zlepšují střevní mikroflóru u septických potkanů. Stem Cell Research & Therapy, 11(1), 384. https://doi.org/10.1186/ s13287-020-01902-5

34. Soontararak, S., Chow, L., Johnson, V., Coy, J., Wheat, W., Regan, D., & Dow, S. (2018). Mezenchymální kmenové buňky (MSC) odvozené z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) ekvivalentní k MSC odvozeným z tukové tkáně při podpoře střevního hojení a normalizace mikrobiomu u myšího modelu zánětlivého onemocnění střev. Stem Cells Translational Medicine, 7 (6), 456–467. https://doi.org/ 10.1002/sctm.17-0305

35. Li, J., Zou, C., & Liu, Y. (2022). Zmírnění potravinové alergie vyvolané ovalbuminem u myší cíleným podáváním kyanidin-3--O-glukosidu do konečníku a tlustého střeva. Foods (Basilej, Švýcarsko), 11(11), 1542. https://doi.org/10.3390/foods11111542

36. Maruyama, S., Matsuoka, T., Hosomi, K., Park, J., Nishimura, M., Murakami, H., Konishi, K., Miyachi, M., Kawashima, H., Mizuguchi, K ., Kobayashi, T., Ooka, T., Yamagata, Z., & Kunisawa, J. (2022). Klasifikace výskytu dyslipidémie na základě střevních bakterií souvisejících s příjmem ječmene. Frontiers in Nutrition, 9, 812469. https://doi.org/10.3389/fnut.2022.812469

37. Lee, SH, Park, H., Kang, CD, Choi, DH, Park, SC, Park, JM, Nam, S., Chae, GB, Lee, KY, Cho, H., & Lee, SJ ( 2022). Suplementace vysokými dávkami intramuskulárního vitaminu D3 ovlivňuje střevní mikroflóru pacientů s infekcí Clostridioides difcile. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 12, 904987. https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.904987

38. Meyer, RK, Lane, AI, Weninger, SN, Martinez, TM, Kangath, A., Laubitz, D., & Duca, FA (2022). Oligofruktóza obnovuje postprandiální hladiny mastných kyselin s krátkým řetězcem během krmení s vysokým obsahem tuků. Obezita (Silver Spring, Md.), 30(7), 1442–1452. https://doi.org/ 10.1002/oby.23456

39. Sang, J, Zhuang, D, Zhang, T, Wu, Q, Yu, J, Zhang, Z (2022) Konvergentní a divergentní věkové vzorce diverzity střevní mikroflóry u lidí a primátů. M-Systems: e151221. https://doi.org/10.1128/msystems.{6}}

40. Ge, X., He, X., Liu, J., Zeng, F., Chen, L., Xu, W., Shao, R., Huang, Y., Farag, MA, Capanoglu, E. , El-Seedi, HR, Zhao, C., & Liu, B. (2022). Zmírnění diabetu 2. typu novou koordinací 6, 8-guanidyl luteolin chinon-chrom prostřednictvím biochemických mechanismů a interakcí střevní mikroflóry. Journal of Advanced Research, S2090–1232(22), 121–129. https://doi.org/ 10.1016/j.jare.2022.06.003

41. Ding, Q., Cao, F., Lai, S., Zhuge, H., Chang, K., Valencak, TG, Liu, J., Li, S., & Ren, D. (2022). Lactobacillus plantarum ZY08 zmírňuje chronickou alkoholem indukovanou jaterní steatózu a poškození jater u myší prostřednictvím obnovení homeostázy střevních fora. Food Research International (Ottawa, Ont.), 157, 111259. https://doi.org/10. 1016/j.foodres.2022.111259

42. Rees, NP, Shaheen, W., Quince, C., Tselepis, C., Horniblow, RD, Sharma, N., Beggs, AD, Iqbal, TH, & Quraishi, MN (2022). Systematický přehled prediktivních biomarkerů dárce a příjemce odpovědi na transplantaci fekální mikroflóry u pacientů s ulcerózní kolitidou. EBioMedicine, 81, 104088. https:// doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104088

43. Li, A., Abraham, C., Wang, Y., & Zhang, Y. (2020). Nové poznatky o základní biologii akutního onemocnění štěpu proti hostiteli. Haematologica, 105(11), 2540–2549. https://doi.org/10.3324/haematol. 2019.{12}}. Kayama, H., Okumura, R., & Takeda, K. (2020). Interakce mezi mikrobiotou, epitelem a imunitními buňkami ve střevě. Annual Review of Immunology, 38, 23–48. https://doi.org/ 10.1146/Annu rev-immunol-070119-115104

45. Schluter, J., Peled, JU, Taylor, BP, Markey, KA, Smith, M., Taur, Y., Niehus, R., Stafas, A., Dai, A., Fontana, E., Amoretti , LA, Wright, RJ, Morjaria, S., Fenelus, M., Pessin, MS, Chao, NJ, Lew, M., Bohannon, L., Bush, A., … Xavier, JB (2020). Střevní mikroflóra je spojena s dynamikou imunitních buněk u lidí. Příroda, 588(7837), 303–307. https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2971-8

46. ​​Yang, J, Yang, H, Li, Y (2022) Trojité interakce mezi střevní mikrobiotou, mykobiotou a imunitou hostitele. Kritické recenze v potravinářství a výživě: 1–21. https://doi.org/10.1080/10408 398.2022.2094888

47. An, J., Liu, Y., Wang, Y., Fan, R., Hu, X., Zhang, F., Yang, J., & Chen, J. (2022). Role střevní slizniční bariéry při autoimunitním onemocnění: potenciální cíl. Frontiers in Immunology, 13, 871713. https://doi.org/10.3389/fmmu.2022.871713