Selektivní cytotoxicita bylinné látky Akteosid proti nádorovým buňkám a její mechanistické poznatky

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Christina Cheimonidi et al

ABSTRAKTNÍ

Přírodní produkty se vyznačují extrémní strukturální rozmanitostí a nabízejí tak jedinečný zdroj pro identifikaci nových protinádorových látek. Zde uvádíme, že rostlinná látkaakteosidizolován pokročilými fytochemickými metodami z listů Lippia citriodora vykazoval zvýšenou cytotoxicitu proti metastatickým nádorovým buňkám; působil v synergii s různými cytotoxickými látkami a senzibilizovanými chemorezistentními rakovinnými buňkami.Akteosidnebyl toxický ve fyziologických buněčných kontextech, zatímco zvyšoval oxidační zátěž, ovlivňoval aktivitu proteostatických modulů a potlačoval matricové metaloproteinázy v nádorových buněčných liniích. Intraperitoneální nebo perorální (prostřednictvím pitné vody) podávání akteosidu u myší melanomu model upregulované antioxidační odpovědi v nádorech; přesto pouze intraperitoneální porod potlačil růst nádoru a vyvolal protinádorově reaktivní imunitní odpovědi. Identifikace/kvantitační analýza hmotnostní spektrometrií odhalila, že intraperitoneální podáníakteosidvedlo k významně vyšší koncentraci sloučeniny v plazmě a nádorech léčených myší oproti perorálnímu podání, což naznačuje, že její protinádorový účinek in vivo závisí na způsobu podání a dosažené koncentraci v nádoru. A konečně, studie molekulárního modelování a testy enzymatické aktivity ukázaly, žeakteosidinhibuje proteinkinázu C. Závěrem lze říci, že akteosid je příslibem jako chemické lešení pro vývoj nových protinádorových látek.

Klíčová slova:Akteosid, Rakovina, Přírodní sloučenina, Oxidační stres, Proteostáza, Imunomodulace

cistanche acteosid

1. Úvod

Karcinogeneze je charakterizována deregulací několika buněčných signálních drah a je spojena se zvýšeným buněčným oxidačním, replikačním, metabolickým, genotoxickým a proteotoxickým stresem [1]. K přizpůsobení a překonání těchto stresových fenotypů maligní buňky upregulují (kromě onkogenů) několik neakogenních cest, jejichž cílem je buď potlačit, nebo (alespoň) zmírnit probíhající stres. Mezi různými neonkogenními cestami, u kterých bylo zjištěno, že jsou často upregulovány během tumorigeneze, jsou moduly proteostázové sítě (PN) spolu s buněčnými antioxidačními odpověďmi [2,3].

Klíčovými složkami PN jsou dva hlavní degradační stroje, jmenovitě Autofagicko-lysosomová dráha (ALP) a Ubiquitin-Proteazomová dráha (UPP), spolu se sítí buněčných molekulárních chaperonů. ALP se podílí hlavně na degradaci proteinových agregátů a poškozených organel [4], zatímco UPP degraduje normální proteiny s krátkou životností a neopravitelné špatně složené nebo rozložené proteiny [5–8]. 26Seukaryotický proteazom je tvořen regulačními částicemi 19S (RP) a částicemi 20 Score (CP); ten se skládá ze čtyř skládaných heptamerických prstenců (dva z α typu obklopující dva β typu), které tvoří strukturu podobnou sudu. Aktivity chymotrypsinu (CT-L), trypsinu (T-L) a kaspázy (C-L) proteazomové peptidázy se nacházejí v proteazomálních podjednotkách β5, β2 a β1 [6]. Prokázaná klinická účinnost inhibitorů proteazomu Bortezomibu (Velcade®; také nazývaného PS-341) a Karfifilzomibu proti různým hematologickým malignitám [9] poskytla "důkaz o konceptu" cílení UPP jako slibné strategie pro léčbu rakoviny. Komplexní síť buněčných antioxidačních obranných drah, která je často upregulována během karcinogeneze [3,10], zahrnuje antioxidační enzymy, stejně jako několik transkripčních faktorů, které mobilizují cytoprotektivní genomické odpovědi; patří mezi ně vidlicový box O (Foxo) a faktor související s jaderným faktorem erytroidem 2 (Nrf-2). Nrf-2 je ústřední při ochraně buněk před oxidačním a/nebo xenobiotickým poškozením, protože stimuluje expresi antioxidačních genů a genů fáze II [11-13].

My a další jsme nedávno navrhli, že cílení na tyto nádorové závislosti (tj. proteostatické moduly a / nebo antioxidační cesty odpovědi) nebo zvýšení buněčných hladin ROS v kontextu transformovaného genotypu nabízejí potenciální terapeutické okno pro selektivní zabíjení nádorových buněk [3,14]; na podporu bylo hlášeno selektivní zabíjení rakovinných buněk malou molekulou, která upregulovala buněčné hladiny ROS [2]. Očekává se, že kombinatorické přístupy zahrnující také aktivaci protinádorově reaktivních imunitních odpovědí [15] pravděpodobně maximalizují terapeutické okno nabízené inhibicí PN a antioxidačních odpovědí a / nebo zvýšením buněčných hladin ROS.

Přírodní produkty (extrakty nebo čisté sloučeniny) (NP) z různých zdrojů (rostliny, mořské organismy, mikroorganismy atd.) jsou vyšetřovány na jejich schopnost působit jako protinádorové látky kvůli jejich extrémní strukturální rozmanitosti a chemické složitosti, stejně jako proto, že působí pleiotropně modulující několik buněčných signálních drah [16]. NP údajně aktivují protiinflflamační, protinádorové a/nebo antimetastatické odpovědi [16,17] a také se vyhýbají multirezistentické rezistenci [18,19]. Mezi nimi fenolické sloučeniny (včetně fenylethanoidních glykosidů) přitahují značný zájem kvůli jejich hlášené roli v prevenci a / nebo léčbě různých lidských onemocnění.

Akteosid, také nazývaný použití nebo verbascosid [20], je fenylethanoidní glykosid izolovaný z mnoha dvouděložných. Acteosid údajně vykazuje některé zajímavé biologické aktivity, včetně antioxidačních, protizánětlivých a buněčných apoptózových regulačních vlastností [21,22]. Nicméně jeho potenciální protinádorová aktivita nebyla řešena. Uvádíme zde, že akteosid vykazoval zvýšenou cytotoxicitu proti buňkám rakoviny savců bez zjevných toxických účinků ve fyziologických buněčných kontextech. Kromě toho akteosid potlačil růst melanomového nádoru v myším modelu Vivo (mimo jiné) aktivací protinádorově reaktivních imunitních odpovědí.

účinkycistanche acteosid

2. Materiály a metody

2.1 Rostlinný materiál a extrakce

sušené listy Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) byly zakoupeny na místním trhu v Aténách v Řecku. Listy byly rozdrceny a extrahovány mechanickým mícháním po dobu 12 hodin metanolem (2 × 20 l). Methanolický extrakt byl odpařen do sucha a promyt směsí CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 l). Nerozpustný zbytek byl oddělen a vysušen za vzniku zelenožlutého prášku (450 g).

2.2 Čištění akteosidů a analýza UPLC-HRMS

Část (10 g) výše uvedeného zbytku byla podrobena protiproudé chromatografii za použití přístroje pro rychlou odstředivou dělicí chromatografii (FCPC) (Kromaton, Francie); jako bifázický rozpouštědlový systém byla použita směs EtOAc/EtOH/H2O v poměru 5/0,5/4,5. Shromážděné frakce byly podrobeny tenkovrstvé chromatografii; poté byly chromatogramy pozorovány pod UV lampou (254 a 365 nm) a vizualizovány postřikem methanol vanilin sulfátem s následným zahříváním po dobu dvou minut. Celkem 2,1 g akteosidu (čistota ≥ 90%) bylo izolováno výše uvedeným procesem. Identifikace akteosidů byla provedena spektry nukleární magnetické rezonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie (MS), zatímco jeho čistota byla stanovena analýzou UPLC-MS a NMR; podrobnosti viz Suppl. Materiály a metody.

2.3. Buněčné linie

Lidské plicní embryonální fibroblasty (buňky IMR90) spolu s B16. F1, B16. Buněčné linie myší F10, YAC-1 a WEHI-164 byly získány z American Tissue Culture Collection (ATCC). Buněčné linie lidského osteosarkomu U2 OS a Sa OS laskavě daroval prof. V. Gorgoulis (Lékařská fakulta, Národní a Kapodistriánská univerzita v Aténách, Řecko), zatímco buňky osteosarkomu KH OS a buněčné linie chemorezistentního osteosarkomu [23] byly darem Dr. E. Gonose (National Hellenic Research Foundation, Řecko). Buněčné linie rakoviny myší C5N a A5 patří do vícestupňového modelu karcinogeneze myší kůže [24,25] a byly darovány prof. A. Balmainem (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Kultivační podmínky použitých buněčných linií jsou uvedeny v Suppl. Materials and Methods.

přínoscistanche acteosid

2.4. Melanomový myší model samce

Myši C57BL/6 (25–30 g hmotnosti, 6–8 týdnů věku) byly získány z řeckého Pasteurova institutu a umístěny pod kontrolovanou teplotou (22 °C) a fotoperiodou (12 h světlo: 12 h tmavá) s volným přístupem k vodě a potravinám. Myši byly subkutánně naočkovány 105 B16. F1 melanomové buňky (ve 100 μl PBS) a byly náhodně zařazeny do 3 skupin (n = 5/skupina). Když se nádory staly hmatatelnými (den 11), myši dostávaly akteosid dvěma cestami; buď intraperitoneálně (IP) (1 mg/myš zředěná ve 200 μl PBS; celkem 6 dávek podávaných každý druhý den) nebo perorálně pitnou vodou (OR) (2,5 mg/myš; celkem 13 dávek po dobu 13 po sobě jdoucích dnů). Kontrolním myším byl podán PBS. Růst nádoru byl zaznamenán každé 2 dny měřením hlavní a vedlejší osy vytvořených nádorů digitálním posuvným měřítkem. Měření byla transformována na objem nádoru pomocí vzorce: objem nádoru (cm3) = hlavní osa × vedlejší osa2 × 0,5. V den 28 byla zvířata utracena cervikální dislokací a slezina byla asepticky odstraněna. Experiment byl opakován třikrát s podobnými nálezy.

Splenocyty byly izolovány z individuálně homogenizované sleziny a okamžitě testovány na jejich cytotoxicitu oproti B16. Buněčné cíle F1, YAC-1 a WEHI-164. Cytotoxicita byla hodnocena na základě detekce expozice CD107 na povrchu buněk v důsledku degranulace efektorových buněk. Splenocyty (105 buněk/jamka) byly kokultivovány s cíli v 96jamkových U spodních mikrodestičkách s efektorem k cíli (E: T) poměrem 100:1, při 37 °C v 5% CO2. Do každé jamky byly přidány monoklonální protilátky anti-CD107a a anti-CD107b konjugované s FITC (25 μl/ml) a monensin (6 μl/ml; všechny od BD Biosciences). Buňky byly odebrány o 6 hodin později a analyzovány pomocí průtokového cytometru FACSCanto II. Souběžně byly nádory vyříznuty a zpracovány pro následné testy, jak je popsáno v Suppl. Materiály a metody.

cistanche acteosid