Schlafens může uspat viry, část 2

5. SLFN5 jako modulátor přirozeného imunitního signálu

Ačkoli IFN typu I hrají důležitou roli v obraně hostitele proti infekci patogeny, jejich produkce musí být řádně regulována, aby se zabránilo nepřiměřeně škodlivým imunitním reakcím. Negativní regulátory jsou tedy nezbytné pro to, aby se buňky zotavily ze signalizace IFN, protože dysregulace produkce IFN vede k autoimunitním poruchám. Některé ISG mohou regulovat dráhy, které ovlivňují jejich expresi, ať už pozitivně nebo negativně.

Například ISG56 je spojen s adaptorovým proteinem STING a narušuje interakci STING s downstream molekulami VISA/MAVS nebo TBK1, čímž inhibuje virem indukovanou aktivaci IRF3, expresi IFN a buněčné antivirové reakce. Dalším negativním regulátorem je ISG15 dekonjugující proteáza ubikvitin-specifická peptidáza 18 (USP18). USP18 inhibuje signalizaci JAK-STAT interakcí s IFNAR2 způsobem nezávislým na proteáze [64].

Uncoupling protease (uPA) je důležitá proteáza, která může degradovat proteiny v extracelulární matrix a podílet se na fyziologických a patologických procesech, jako je migrace buněk, nádorové metastázy a angiogeneze. Na druhé straně je imunita důležitým obranným mechanismem lidského těla proti patogenům a nádorovým buňkám. Jaký je tedy vztah mezi uPA a imunitou?

Několik studií ukázalo, že uPA může ovlivnit funkci imunitního systému prostřednictvím několika mechanismů. Za prvé, exprese uPA a jeho receptoru uPAR může regulovat migraci a infiltraci imunitních buněk, a tím ovlivnit výskyt zánětu a imunitní reakce. Za druhé, uPA může aktivovat další proteázy na povrchu imunitních buněk, jako jsou MMP, katepsiny atd., čímž se účastní biologických procesů, jako je signální transdukce, proliferace a diferenciace. A co je nejdůležitější, uPA může také ovlivnit proces imunitního dozoru nad nádory, takže lidský imunitní systém není schopen rozpoznat a napadnout rakovinné buňky, čímž podporuje růst nádoru a metastázy.

Celkově byla úloha uPA v růstu nádoru a patologii rozsáhle studována, zatímco jeho účinek na imunitní systém musí být ještě dále prozkoumán. Budoucí výzkum může začít od aspektů uPA v infiltraci imunitních buněk, imunitní regulaci a imunitním úniku nádoru, prozkoumat vztah mezi uPA a imunitním systémem a poskytnout nové nápady a cíle pro vývoj léčby nádorů a imunoterapie. Z tohoto pohledu je potřeba dbát na zlepšení naší imunity. Cistanche dokáže výrazně zlepšit imunitu. Masová pasta je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály a snižovat oxidační stres. Stimulovat a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Click cistanche tubulosa výhody

Lidský SLFN5 byl popsán jako negativní regulátor transkripce genu indukované IFN [65]. Bylo zjištěno, že STAT1 je přítomen jako komplex, který se váže na protein SLFN5 IFN-dependentním způsobem typu I a váže se na prvek ISRE v promotoru ISG. Zdá se, že SLFN5 slouží jako represor STAT1-indukované genové transkripce prostřednictvím přímé proteinové interakce. V souladu s tím bylo prokázáno, že SLFN5 je obohacen o promotory typu I IFN-indukovatelných ISG, kde se váže STAT1.

Experimenty s mikročipy odhalily, že knockoutované buňky SLFN5 exprimovaly více ISG než buňky divokého typu, což naznačuje potenciální roli SLFN5 při regulaci STAT1-zprostředkované IFN typu I indukované transkripční aktivací ISG [65]. Podobně ve fibroblastech lidské předkožky a buňkách HeLa se bazální hladina ISG15, dobře známého antivirového proteinu, zvýšila v důsledku deplece SLFN5; navíc byla pozorována rychlá indukce exprese proteinu ISG15 DNA viry, jako je lidský cytomegalovirus (HCMV), [20]. V souladu s tím se zdá, že SLFN5 je transkripční represor transkripce genu IFN, stejně jako gen odezvy stimulovaný IFN.

Proteiny ZEB jsou transkripční faktory vázající homeobox se zinkovým prstem E, které jsou nejlépe známé pro svou roli při řízení epiteliálního-mezenchymálního přechodu a metastáz u některých rakovin, včetně BRCA mutantních rakovinných buněk [66,67]. Jsou také široce exprimovány imunitními buňkami a regulují důležité transkripční sítě nezbytné pro diferenciaci, udržování a funkci imunitních buněk [68].

Nedávno bylo zjištěno, že lidský SLFN5 může inhibovat transkripci ZEB1 přímou vazbou na vazebný motiv SLFN5 na promotoru ZEB1, čímž udržuje morfologii epiteliálních buněk a inhibuje metastázy v rakovinných buňkách mutantu BRCA [69,70]. SLFN5 zvyšuje PTEN snížením regulace transkripce ZEB1. Prostřednictvím osy PTEN/PI3K/AKT/mTOR inhibuje zvýšení PTEN růst plicního adenokarcinomu a podporuje apoptózu [47].

Ačkoli interakce SLFN5 s promotorem ZEB1 v imunitních buňkách nebyla ověřena, tyto zprávy naznačují roli SLFN5 jako multifunkčního modulátoru imunitních buněk. Je zajímavé, že SLFN12 inhibuje ZEB1; na rozdíl od SLFN5 se však předpokládá, že ovlivňuje post-transkripční regulaci díky své cytoplazmatické lokalizaci bez signální sekvence jaderné lokalizace. Nadměrná exprese SLFN12 urychlila degradaci proteazomu ZEB1 a zpomalila translaci ZEB1 v trojitě negativních buňkách karcinomu prsu [9].

6. SLFN5, dvousečný meč v IFN terapii

Některé malignity lze léčit terapií IFN v kombinaci s chemoterapií a ozařováním. Tímto terapeutickým přístupem lze léčit hematologické malignity a lymfomy [71]. Rekombinantní IFN 2b se podává pacientům s recidivami melanomů [72]. Hepatitida B a hepatitida C se léčí IFN a dalšími antivirotiky, typicky kombinovanými [73,74]. Protirakovinné účinky IFN typu I byly v posledních desetiletích široce uznávány, zejména jejich zapojení do zprostředkování interakcí mezi nádory a imunitním systémem.

U myšího maligního melanomu a renálního karcinomu podporuje IFN expresi Slfn1, Slfn2, Slfn3, Slfn5 a Slfn8. Ztráta Slfn2, Slfn4 nebo Slfn5 zvýšila buněčnou proliferaci a maligní růst nezávislý na ukotvení a zároveň snížila antiproliferativní účinek IFN, což znamená, že Schlafens hraje zásadní roli v tumorigenezi a kontrole růstu neoplastických buněk [75].

Veškerá exprese lidské Schlafen mRNA byla indukována v normálních melanocytech terapií IFN, zatímco pouze SLFN5 byl indukován v buňkách maligního melanomu a buňkách renálního karcinomu [8,40]. Když jsou melanomové buňky stimulovány IFN, exprese SLFN5 je značně zvýšena, čímž se snižuje proliferace rakovinných buněk. Naproti tomu deplece SLFN5 posílila schopnost melanomů tvořit kolonie, a to i v přítomnosti IFN [40].

To naznačuje potenciální roli SLFN5 v protirakovinných účincích IFN. SLFN5 však také potenciálně snižuje protirakovinný účinek IFN v gliomových rakovinných buňkách tím, že transkripčně spolupotlačuje STAT1-zprostředkované odpovědi IFN, na rozdíl od jeho prospěšné role u melanomu a karcinomu ledviny [65]. Snížení SLFN5 vede ke zvýšené buněčné vnímavosti k IFN-indukovaným antiproliferativním odpovědím v glioblastomových buňkách, což znamená, že SLFN5 funguje jako negativní regulátor IFN odpovědi v gliomových rakovinných buňkách [65].

Budoucí terapeutické cílení SLFN5 u malignit tedy může vyžadovat přesnou analýzu dalších souvisejících faktorů a pro selektivní cílení SLFN5 může být vyžadován návrh terapeutického cílení konkrétního nádoru.

7. Funkce virového schlafenu

Přítomnost intaktních v-Slfn ORF v některých OPV naznačuje, že mohou být zachovány pro kritickou funkci. Ačkoli existuje jen málo výzkumů funkce v-Slfn, byly hlášeny poměrně podrobné studie in vitro a in vivo na v-Slfn z CMLV. Exprese tohoto genu byla potvrzena 2 hodiny po infekci CMLV a byla exprimována v časném stadiu infekce nezávisle na replikaci virové DNA [35].

Na rozdíl od myšího Slfn1 exprese CMLV v-Slfn neovlivňuje proliferaci myších fibroblastů. Předpokládá se, že je to způsobeno nedostatkem podobnosti mezi prvními 27 aminokyselinami myšího Slfn1 a v-Slfn, což je oblast, která je nezbytná pro inhibici růstu fibroblastů zprostředkovanou myším Slfn1-. Když byl protein CMLV v-Slfn exprimován ve VACV postrádajícím intaktní v-Slfn, neovlivnilo to replikaci rekombinantního viru ani morfologii plaku [35].

Navíc intradermální infekce myší tímto rekombinantním VACV neovlivnila velikost kožních lézí [35]. U myší s intranazální infekcí však v-Slfn způsobil menší úbytek hmotnosti a rychlejší zotavení ve srovnání s kontrolními skupinami. Tři dny po infekci in vivo byl titr viru stejný jako u kontrolní skupiny, ale po sedmi dnech bylo pozorováno zeslabení zprostředkované v-Slfn.

To naznačuje, že exprese v-Slfn nebrání replikaci viru, ale spíše urychluje odstranění viru imunitním systémem. To je v souladu s pozorováním, že rekombinantní virus nesoucí v-Slfn byl zpožděn v šíření do sleziny a byl rychleji odstraňován z tohoto orgánu. Kromě toho byl pozorován rozsáhlejší nábor lymfocytů do infikované plicní tkáně v přítomnosti exprese v-Slfn, ačkoli tyto buňky byly méně aktivované. Vysoce virulentní viry mohou rychle přemoci svého hostitele a omezit přenos viru. Myšlenka, že v-Slfn může snížit virulenci poxvirů, což umožňuje viru se vhodně šířit v hostitelské populaci, je přesvědčivá [35].

Nedávno byla objevena nová vlastnost v-Slfn u poxvirů (obrázek 1). Cyklická GMP-AMP syntáza (cGAS) detekuje cytosolovou DNA během virové infekce a navozuje antivirový stav. cGAS aktivuje stimulátor interferonových genů (STING) syntézou druhého posla, cyklického GMP-AMP (cGAMP) [76–78]. S objevem virové cGAMP nukleázy pojmenované Poxin (poxvirová imunitní nukleáza) dostal imunomodulační potenciál poxvirů nový pohled [6].

Nedávné studie prokázaly, že Poxin, který je doménou v-Slfns, může degradovat cGAMP a je nutný k zamezení aktivace cGAS-STING [79–81]. Bylo zjištěno, že poxin je produktem genu VACV B2R. Tento gen je také známý jako p26 u entomopoxvirů a bakulovirů [80]. Většina orthopoxvirů zahrnuje protein v-Slfn složený ze dvou domén, které se vyvinuly z různých původů. Podle analýzy aminokyselinové sekvence je doména podobná sekvenci bakuloviru p26 fúzována k N-konci v-Slfn domény podobné myší krátké formě Schlafen [35]; tato doména podobná p{12}}je Poxin, cGAMP nukleáza. VACV, ve kterém byla poprvé popsána aktivita Poxinu, si nezachovává intaktní v-Slfn. Ztráta poxinu vedla ke značnému snížení replikace VACV in vivo [80].

Důležitost sebe sama, která zahrnuje doménu Poxin, byla rozsáhle studována u viru ectromelia (ECTV), který způsobuje myší neštovice. Poxin doména, ale ne doména podobná Slfn, byla dostatečná k inhibici signalizace cGAS-STING s aktivitou nukleázy cGAMP způsobem srovnatelným s fúzí domény typu Poxin-Schlafen v plné délce. To naznačuje, že doména ECTV Poxin zachovává plný potenciál v-Slfn k zabránění aktivaci snímání DNA prostřednictvím osy cGASSTING [79].

V několika modelech infekce myší byla replikace ECTV postrádající v-Slfn významně oslabena a myši vykazovaly silnou IFN odpověď [79]. Fúze domény v-Slfn typu Poxin – Schlafen je vysoce konzervovaná napříč orthopoxviry, jako jsou ECTV, CMLV a nově se objevující virus zoonotických opičích neštovic, což naznačuje důležitost nukleázové aktivity cGAMP.

Role domény podobné Slfn v aktivaci Poxinu je nejasná. Poxin si zachoval svou cGAMP nukleázovou aktivitu v nepřítomnosti domény podobné Slfn. Nicméně zůstává nezbytné prozkoumat, proč je doména podobná Slfn konzervována v mnoha OPV. Vzhledem k výše uvedenému pozorování, že virulence chimérických virů byla snížena přidáním Slfn-like domény CMLV k VACV, je přijatelná hypotéza, že regulace virulence viru může přispět k vytvoření příznivých podmínek pro šíření viru v přírodě.

8. Schlafens jako antivirové restrikční faktory

Antivirové restrikční faktory jsou hostitelské buněčné proteiny, které fungují jako první obranná linie, brání replikaci a šíření viru. Restrikční faktory rozpoznávají patogeny a interferují se specifickými kroky v infekčním cyklu viru. Jedinečné vlastnosti restrikčních faktorů, které slouží k omezení virů v raných stádiích, zahrnují konstitutivní expresi, soběstačnou aktivitu a okamžitou akci [82]. Restrikční faktory jsou příležitostně zvýšeny v reakci na IFN. Ačkoli mnoho typů buněk konstitutivně exprimuje restrikční faktory v nízkých hladinách vyžadovaných buňkami v nepřítomnosti invaze patogenu, účinná kontrola patogenu často vyžaduje indukci restrikčních faktorů v reakci na infekci [83]. Vzhledem k tomu, že Schlafens patří do skupiny ISG, jejichž exprese je zvýšená v reakci na virovou infekci nebo stimulaci různými molekulárními vzory asociovanými s patogeny (PAMPs) [36–39], předpokládá se, že mohou mít antivirovou aktivitu.

Spolu s objevem buněčných biologických funkcí Schlafens během posledního desetiletí byly také odhaleny interakce s viry. V této části popíšeme známé antivirové funkce Schlafens a zhodnotíme je v chronologickém pořadí, ve kterém byly hlášeny (obrázek 2). Byly objasněny mechanismy imunitního úniku, kterými viry antagonizují mnoho restrikčních faktorů. Kromě toho, v souladu s tématem, že viry mohou antagonizovat restrikční faktory jako součást mechanismů imunitního úniku, existuje několik nedávno publikovaných příkladů virových strategií k potlačení antivirového účinku Schlafens.

Bylo hlášeno, že schlafeny patřící do různých skupin mají během infekce odlišné role s mnoha viry. Existují určité důkazy, že nesprávná funkce myšího Slfn2 skupiny I predisponuje buňky k virové infekci ve smyslu získané imunity [55]. Skupina II SLFN12 je kandidát na antivirový faktor proti viru vezikulární stomatitidy a různým retrovirům, včetně HIV-1, viru infekční anémie koní (EIAV), lidskému endogennímu retroviru typu K (HERK-V), viru myší leukémie (MLV), a primátový pěnivý virus (PFV) [84,85]. Studie o interakci těchto krátkých nebo intermediárních forem schlafenů s viry však chybí a většina dosavadních studií se zaměřila na antivirovou funkci schlafenů skupiny III. Proto je klíčové prozkoumat, zda C-terminální rozšířená doména Schlafens hraje významnou roli v jejich funkci vnitřního restriktivního faktoru.

8.1. Role SLFN11 během virové infekce

Lidský SLFN11 byl poprvé popsán v roce 2012 jako silný inhibitor viru lidské imunodeficience 1 (HIV-1), který narušuje produkci virového proteinu [18]. Objevili to Li et al. že SLFN11 váže transferové RNA (tRNA) a potlačuje produkci proteinů selektivně v závislosti na využití kodonů [18]. Další výzkum odhalil, že koňský SLFN11 inhibuje tvorbu EIAV mechanismem podobným tomu, který využívá lidský SLFN11 [23]. Systematické zkoumání replikačního cyklu HIV prokázalo, že SLFN11 neovlivňuje reverzní transkripci, integraci nebo tvorbu a jaderný export virové RNA, ani neinterferuje s pučením nebo uvolňováním virových částic. Místo toho bylo zjištěno, že indukuje selektivní inhibici syntézy virových proteinů.

Využitím konkrétního virového kodonového zkreslení na A/T nukleotidu funguje SLFN11 v okamžiku produkce virového proteinu. Ačkoli antivirový účinek SLFN11 byl podobný jako u jiných virů s neobvyklým zkreslením kodonů, jako je chřipka, nebyl účinný proti adenoasociovanému viru nebo viru herpes simplex (HSV). Tato zjištění prokázala, že SLFN11 je vysoce účinným interferonem indukovatelným restrikčním faktorem pro retroviry, jako je HIV, který zprostředkovává antivirové účinky prostřednictvím diskriminace použití kodonů [18]. Toto zajímavé zjištění může částečně vysvětlit dříve pozorovanou IFN supresi specifické syntézy virových proteinů v buňkách infikovaných HIV [18, 86]. Zdůrazňuje také, jak může imunitní systém využít možné rozdíly mezi vlastním a cizím pro hostitelské buňky k cílení a likvidaci virů. Nezdá se, že by existovala preference typu tRNA ve vazbě SLFN11 na tRNA [18].

Bude nutné provést biochemické experimenty, abychom odhalili, jak SLFN11 moduluje funkci tRNA a ovlivňuje využití kodonů specifických pro virus. SLFN11 je vysoce exprimován nejen v CD4 plus T buňkách, ale také v monocytech a moDC [37,87]. Je známo, že CD4 plus T buňky jsou primárním rezervoárem pro latentní infekci HIV a latenci HIV lze stanovit také v monocytech a makrofázích [88]. Předpokládá se tedy, že vysoká exprese SLFN11 v těchto buňkách hraje roli v latentní infekci HIV a může být klíčovou složkou vrozené imunitní odpovědi na HIV.

Nedávno bylo zjištěno, že myší Slfn2 se váže na tRNA a inhibuje její degradaci v prostředí oxidačního stresu [89]. Ačkoli tato studie ukázala, že Slfn2 inhiboval infekci myším cytomegalovirem (MCMV), výsledek byl způsoben adaptivní imunitou zprostředkovanou T buňkami [89]. Nicméně tato pozorování si zaslouží důkladné prozkoumání interakce mezi tRNA modulací Slfn2 a myšími retroviry, stejně jako paralely a rozdíly s lidským SLFN11. Protože N-koncová část SLFN11 je zapojena do vazby tRNA, mohou existovat evoluční podobnosti v sekvenci s krátkou formou Slfn2. Kromě toho objev, že SLFN13 a SLFN14 se účastní modulace tRNA, připravuje cestu pro budoucí výzkumy s cílem zjistit, zda Schlafens sdílejí společné funkce v biologii tRNA [24,90].

Protože příchozí virový genom jednořetězcových RNA virů s pozitivním smyslem vyžaduje okamžitou translaci, aby se umožnila replikace, jsou tyto viry zvláště citlivé na účinky SLFN11 na syntézu proteinů. To bylo prokázáno u rodu Flavivirus, včetně viru West Nile (WNV), viru dengue (DENV) a viru Zika (ZIKV) [21]. Existují podobnosti a rozdíly v mechanismu účinku Schlafenových proteinů proti flavivirům a lentivirům. N-terminální část SLFN11 je nezbytná a dostatečná pro antivirovou aktivitu, protože zabraňuje virem vyvolaným změnám v tRNA repertoáru infikovaných buněk. Na rozdíl od infekce WNV, která postihla pouze podskupinu tRNA v SLFN11-deficientních buňkách [21], HIV-1 celkově zvýšil hladiny tRNA v nepřítomnosti SLFN11 [18].

Schopnost SLFN11 regulovat množství tRNA poolů by mohla souviset s citlivostí buněk k činidlům poškozujícím DNA. Několik studií zjistilo, že rakovinné buňky s vyšší expresí SLFN11 jsou náchylnější k činidlům poškozujícím DNA [12,33,91,92]. Vyšší hladiny SLFN11 mohou omezovat počet konkrétních tRNA, které ovlivňují translaci opravných proteinů DNA kódovaných otevřenými čtecími rámcemi s ovlivněním kodonů, jako jsou ATM a ATR [93]. Navíc SLFN11 ireverzibilně inhibuje replikaci DNA v místech poškození DNA způsobem závislým na C-terminální helikázové doméně [34,94]. Je známo, že různé viry využívají proteiny zapojené do reakce hostitelských buněk na poškození DNA pro svou účinnou replikaci [95].

Účast proteinů kontroly poškození DNA ATM a ATR v infekci HIV byla rozsáhle studována. ATM má pozitivní vliv na pozdní genovou expresi HIV a funkci Rev, virového post-transkripčního regulátoru [96]; mezitím je k dokončení procesu integrace virové DNA a podpoře přežití transdukovaných buněk vyžadována aktivita ATR kinázy [97]. U infekce ZIKV zvyšuje ATM signální dráha replikaci viru [98]. Tato zjištění naznačují, že Schlafens by měl být dále zkoumán z hlediska odolnosti hostitelských buněk vůči virům, které příznivě využívají reakce na poškození DNA k zajištění účinné replikace.

ZIKV vyvolalo v posledních letech rozsáhlé obavy kvůli své schopnosti vyvolat porodní abnormality u kojenců a Guillain-Barrého syndrom u dospělých. ZIKV se může přenášet sexuálně, přežít v mužském reprodukčním systému [99] a u žen projde placentou, aby infikoval plod [100]. O účincích ZIKV na reprodukční zdraví a plodnost jsou dostupné omezené informace. Vzhledem k tomu, že SLFN11 není exprimován v placentě ani varlatech [22], je zapotřebí další výzkum, aby se zjistilo, zda souvisí také s prenatálními a sexuálně přenosnými infekcemi.

Gen SLFN11 se vyvinul při opakované pozitivní selekci u primátů [22]. Kromě toho byla antivirová účinnost SLFN11 nejvyšší u nehumánních druhů primátů, jako jsou giboni a kosmani, ale méně účinná u lidí a u druhů bonobo, které jsou evolučně blízké lidem, což naznačuje, že účinky SLFN11 se staly vysoce druhově specifické. v průběhu času [22]. SLFN11 je funkční v nepřítomnosti infekce a snižuje produkci proteinů z určitých hostitelských transkriptů [18,93]. To znamená, že SLFN11 může obecně inhibovat syntézu proteinů z transkriptů s neoptimalizovanými kodony, a tím předem vytvořit nepříznivé buněčné prostředí pro syntézu virových proteinů.

Viry se vyvinuly způsoby, které působí proti restriktivním faktorům hostitele. Přestože byl prokázán klesající trend proteinů SLFN11 v buňkách infikovaných HCMV [101], viroví antagonisté pro SLFN11 nebyli po mnoho let objeveni. Nedávno však byl prokázán antivirový účinek SLFN11 a jeho virový antagonistický mechanismus na HCMV [102]. Pozdně exprimovaný protein RL1 HCMV se zaměřuje na SLFN11 pro degradaci proteazomu a je prvním objevem virového antagonisty tohoto restrikčního faktoru. V této studii bylo odhaleno, že buněčný komplex CRL4 E3 ubikvitin ligázy se navíc podílí na degradaci SLFN11 pomocí RL1 [102].

I když SLFN11 má významný dopad na replikaci HIV, WNV a ZIKV, tyto viry se mohou stále replikovat v buňkách, které exprimují SLFN11. Ve srovnání s jinými flaviviry nebo HIV je replikace DENV významně snížena expresí SLFN11 [21]. To naznačuje, že DENV je náchylnější než jiné viry k účinkům SLFN11. Dalo by se tedy očekávat, že DENV postrádá antagonistický mechanismus pro SLFN11, zatímco WNV, ZIKV a HIV-1 mohou mít zastřené antagonistické mechanismy.

Byl popsán mechanismus, kterým fosforylace SLFN11 katalytickou podjednotkou G proteinové fosfatázy 1 (PPP1CC) reguluje schopnost štěpení tRNA typu II [103]. Je dobře známo, že aktivita buněčného proteinu je regulována virovými kinázami [104]. Dosud nebyl nalezen žádný důkaz, který by podporoval hypotézu, že viry regulují fosforylaci SLFN11 prostřednictvím virem kódovaných kináz nebo nepřímo prostřednictvím kináz hostitelských buněk, jako je PPP1CC. Je zapotřebí další výzkum, aby se prozkoumala možnost, že viry využívají fosforylaci proteinů k obcházení antivirové aktivity Schlafens, jak bylo pozorováno u jiných restrikčních faktorů hostitele [105–112].

8.2. Role SLFN13 během virové infekce

Krystalografická analýza odhalila, že SLFN13 je novou třídou tRNA/rRNA nukleáz [24]. Kromě toho bylo také hlášeno, že SLFN13 měl antivirovou funkci proti HIV a ZIKV inhibicí syntézy proteinů prostřednictvím nukleolytické aktivity, podobně jako SLFN11. Klíčovým determinantem štěpení tRNA SLFN13, který blokuje syntézu proteinů, je však sekundární struktura tRNA a nekoreluje s antikodonovou sekvencí [24], která se zdá být odlišná od mechanismu založeného na použití kodonů. SLFN11.

Sekvence N-terminální domény SLFN13, která je nezbytná pro funkci enzymu, je konzervována v jiných Schlafenových proteinech. Nicméně, specifické kladně nabité aminokyselinové zbytky jsou různé. Bylo potvrzeno, že někteří členové rodiny, jako je lidský SLFN5 a myší Slfn1, se nepodílejí na štěpení tRNA [24]. Je tedy pravděpodobné, že distribuce kladně nabitých aminokyselinových zbytků uvnitř N-terminální domény může určit schopnost a selekční tendence štěpení tRNA/rRNA, stejně jako antivirová spektra pro jiné Schlafeny.

Bylo pozorováno, že infekce viry chřipky A (PR8) a B (Victoria) indukují expresi mRNA SLFN13 v buňkách lidského adenokarcinomu plic A549 [19]. Tato indukce byla robustnější u virové mutantní infekce s deficitem NS{4}}, pravděpodobně kvůli schopnosti NS1 potlačit aktivaci promotoru IFN zprostředkovanou RIG-I [113]. Kromě toho deplece SLFN13 zvýšila tvorbu plaků viru chřipky A a B, což znamená, že SLFN13 podporuje antivirové reakce na tyto viry [19]. Není však známo, zda antivirová funkce SLFN13 proti viru chřipky souvisí se štěpením tRNA/rRNA. Existuje tedy potřeba určit, zda nukleolytická aktivita Schlafenu je společným mechanismem pro antivirovou funkci zprostředkovanou Schlafenem. Absence antivirového účinku SLFN11 proti viru s negativním jednovláknovým RNA genomem [21] naznačuje existenci mechanismu nezávislého na funkci SLFN13 proti chřipkovému viru.

8.3. Role SLFN14 během virové infekce

Antivirové funkce byly také popsány u SLFN14 a exprese je zvýšena infekcí chřipkou A [19]. Deplece SLFN14 omezila upregulaci IP-10, hlavního ISG, po infekci chřipky. Tyto výsledky naznačují možný mechanismus, kterým SLFN14 rozpoznává genom virové RNA, zesiluje aktivační signál zprostředkovaný RIG-I a inhibuje replikaci chřipky [19]. Je však nutné potvrdit, zda SLFN14, stejně jako u helikáz, jako je DDX1 nebo RIG-I, skutečně detekuje virový genom [114]. SLFN14 zpožďuje jadernou translokaci nukleoproteinu NP. Zpožděná jaderná translokace NP může narušit replikaci viru tím, že naruší jaderný transport virového ribonukleoproteinu.

Kromě svých účinků na RNA viry bylo u SLFN14 také prokázáno, že má antivirovou aktivitu proti DNA virům, jako je virus varicella-zoster (VZV). Infekce VZV indukuje expresi SLFN14 a inhibuje produkci virového antigenu v buňkách nadměrně exprimujících SLFN14 [19]. Ačkoli se předpokládá, že antivirový mechanismus SLFN14 proti RNA virům a DNA virům je odlišný, pro podrobnější analýzu mechanismu je nutný další výzkum domnělé helikázové domény SLFN14 a asociace IFN signalizace zprostředkované RIG-I. Kromě toho, protože buněčné typy exprimující SLFN14 jsou velmi omezené nebo úroveň exprese je nízká [115], zbývá vyhodnotit skutečnou funkci SLFN14 v buňkách infikovaných virem.

Bylo zjištěno, že SLFN14 má endonukleázovou aktivitu spojenou s ribozomy a může degradovat tRNA, rRNA a mRNA [90]. Při štěpení RNA neexistuje žádná sekvenční specifita nebo preferovaná strukturní specifita a tato enzymatická aktivita je striktně závislá na Mg2 plus - a Mn2 plus a nezávislá na ATP [90]. Enzymatickou aktivitu však vykazovala pouze krátká verze SLFN14 zkrácená na C-konci, zatímco SLFN14 plné délky postrádal endonukleázovou aktivitu a nevázal se na ribozomy [90]. Tato funkce se zdá být způsobem, jak zachovat integritu buněčných RNA. Vzhledem k tomu, že protein SLFN14 je přítomen v nízkých hladinách ve většině buněk a vyskytuje se v jádře, neaktivní prekurzorový stav podobný kaspáze může chránit buněčné RNA proti nespecifické endonukleázové aktivitě. Virové infekce indukují expresi SLFN14 jako u RNázy L [116] a může se podílet na clearance celkové buněčné RNA za účelem inhibice reprodukce viru. Stále je však nutné prokázat, že SLFN14 je zpracován do aktivní formy po infekci nebo v určitých prostředích.

8.4. Role SLFN5 během virové infekce

V lidských buňkách je SLFN5 spolu s SLFN11 nejhojnějším proteinem rodiny Schlafen [18]. SLFN5 je nukleární člen rodiny Schlafen, který je spojován s proliferací a diferenciací imunitních buněk [28,117].

Studie uvádějí, že infekce virem chřipky, WNV a rinovirem vede ke zvýšené expresi SLFN5 [37,118,119]. Funkce SLFN5 proti těmto virům však nebyla zkoumána a na rozdíl od SLFN11 bylo experimentálně zjištěno, že SLFN5 nemá žádnou antivirovou aktivitu proti infekci HIV [18]. Nedávné zkoumání SLFN5 odhalilo antivirový účinek a mechanismus proti HSV-1, viru s genomem dvouvláknové DNA [20]. V této studii byly hostitelské faktory spojené s HSV-1 DNA izolovány pomocí proteomické techniky zvané Isolation of Proteins On Noscent DNA (iPOND), která identifikuje proteiny hromadící se na nově syntetizované DNA [120–122]. Při aplikaci na infekci HSV-1 viry divokého typu a mutantními viry tato technika odhalila, že SLFN5 podléhá proteazomální degradaci v důsledku zrychlené ubikvitinace virovým proteinem ICP0.

HSV {{0}} okamžitě časný protein ICP0 usnadňuje transkripci virového genu a reaktivaci viru z latence. ICP0 obsahuje doménu ubikvitin E3 ubikvitin ligázy, která antagonizuje obranu hostitele prostřednictvím proteazomální degradace vnitřních antivirových hostitelských faktorů [123,124]. Bylo zjištěno, že HSV-1 DNA je spojena s několika ICP{{10}} degradačními cíli, u kterých bylo také prokázáno, že inhibují produkci virových genů a/nebo aktivaci antivirových buněčných signálů [124 ]. Ačkoli předchozí studie identifikovaly substráty ICP0 jako restrikční faktory, mechanismus pro potlačení exprese virových genů není plně objasněn. V této nedávné studii bylo biochemicky potvrzeno, že ICP0 specificky ubikvitinoval a degradoval SLFN5 prostřednictvím proteazomu [20].

Bylo zjištěno, že k přímé interakci mezi ICP{{0}} a SLFN5 dochází prostřednictvím rozšířené C-terminální domény SLFN5, což je oblast, která chybí v SLFN11, která nebyla zaměřena na degradaci. C-terminální oblast SLFN5 obsahuje vnitřně neuspořádanou oblast, častý rys buněčných proteinů vázaných virovými faktory, jako je ICP0 [125]. Antivirový účinek SLFN5 na HSV-1 je zřetelněji pozorován u mutantních virů postrádajících aktivitu E3 ligázy ICP0 než u virů divokého typu. Pozorování, že HSV-1 se zaměřuje na SLFN5 [20] a HCMV se zaměřuje na SLFN11 [102], naznačují, že proteazomem zprostředkovaná degradace může být běžnější virovou strategií používanou k antagonizaci Schlafenovy restrikce.

Antivirový mechanismus SLFN5 byl navržen tak, aby se vázal na virovou DNA a inhiboval nakládání RNA polymerázy II na promotory virových genů [20]. Navíc bylo prokázáno, že na rozdíl od jiných Schlafenů neovlivňuje degradaci mRNA. Ačkoli domnělá helikázová aktivita může být mechanismem, kterým SLFN5 potlačuje genovou transkripci virové DNA, motiv Walker A helikázy SLFN5 neovlivňuje jeho antivirovou funkci [20]. Nezdá se, že by SLFN5 měl žádnou DNA sekvenční specificitu. Zkoumání vazby SLFN5 na oblasti promotoru a těla genu neodhalilo žádnou zjevnou preferenci; byla však patrná tendence vázat se více na virovou DNA než na buněčnou [20]. Nedávná studie struktury SLFN5 prokázala vysokou afinitu k dvouvláknové DNA a identifikovala zbytky podílející se na vazbě nukleové kyseliny [31]. Ačkoli SLFN5 váže tRNA, nesdílí endoribonukleázovou aktivitu uváděnou pro jiné Schlafeny [31]. Ukázalo se také, že SLFN5 preferuje vazbu na volnou DNA před DNA vázanou na nukleozomy [31]. Snadný přístup k euchromatické virové DNA v prostředí lytické infekce může přispět k selektivní vazbě na virovou genomickou DNA [126].

Interakce mezi SLFN5 a virovou DNA byla detekována jak pro příchozí virové genomy, tak pro aktivně se replikující virové genomy v kompartmentech virové replikace [20]. Hostitelský protein PML, dobře známý HSV-1 restrikční faktor, stejně jako ICP0 substrát, také přistupuje k příchozí virové DNA a inhibuje virovou genovou transkripci [127–130]. Ačkoli jsou nutné další biochemické studie, ICP0-zprostředkovaná degradace SLFN5 se zdá být méně účinná než degradace PML [20]. Bezprostředně po infekci je většina HSV-1 DNA obklopena proteinem PML; když je však exprimován ICP0, PML je rychle eliminován a virová DNA je opět zachycena proteinem SLFN5 [20].

To naznačuje, že PML a SLFN5 mohou spolupracovat na vytvoření nepříznivého prostředí pro expresi virových genů. Role SLFN5 proto může být druhou obrannou linií podporující antivirovou funkci PML (obrázek 3). Pozorování, že SLFN5 reguluje imunitní reakce a je také cílem ICP0, naznačuje, že může tvořit součást „samostřežené“ imunitní cesty k monitorování infekce. Degradace SLFN5 pomocí ICP0 by tak mohla vyvolat aktivaci sekundární imunitní odpovědi. Tato hypotéza strážců byla nedávno navržena pro MORC3, další cíl ICP0 [131]. K pochopení souvislostí mezi SLFN5 a dalšími regulátory infekce HSV-1 jsou zapotřebí další studie.

Nedávná analýza jednobuněčného transkriptomu HSV-1 odhalila, že pro expresi genu HSV-1 je nutný nábor -kateninu do kompartmentu virové replikace [132]. Je známo, že SLFN5 inhibuje buněčnou migraci a proliferaci inhibicí exprese kateninu [133,134], což znamená, že SLFN5 může také nepřímo ovlivnit expresi genu HSV-1.

I když SLFN5 nemá žádnou antivirovou aktivitu proti retrovirům, má antivirový účinek proti HSV-2, alfaherpesvirinae blízkému HSV-1. Je zajímavé, že výsledky pro beherpesvirinae HCMV se lišily v závislosti na stadiu infekce [20]. Během prvních 24 hodin po infekci podporuje deplece SLFN5 expresi virových okamžitých časných a časných genových transkriptů; toto je však obráceno v pozdní fázi, což má za následek sníženou expresi těchto virových genů v nepřítomnosti SLFN5. V důsledku toho je výtěžek replikace HCMV u SLFN5-deficientních buněk mírně snížen. Jedním z rozdílů mezi HSV-1 a HCMV je časový průběh infekce, přičemž replikace HSV-1 je mnohem rychlejší než HCMV.

Protože SLFN5 inhibuje transkripci ISG zprostředkovanou STAT{1}} [65], může deplece SLFN5 vést ke zvýšené signalizaci ISG, což snižuje replikaci HCMV. Potlačení SLFN5 ve skutečnosti vedlo k vyšším hladinám exprese ISG15, která se dále zvýšila po infekci HCMV [20]. Výsledkem je, že SLFN5 se přímo podílí na snižování časné virové genové exprese a zdá se, že má zřetelný účinek na HSV-1 v pozdějších fázích. Další DNA virus, adenovirus, nebyl ovlivněn SLFN5 a virová infekce nevedla k degradaci proteinu SLFN5 [20]. Společně tato data naznačují specifičnost k antivirové aktivitě napříč rodinou Schlafenových proteinů, podobnou tomu, co bylo pozorováno u jiných rodin hostitelských restrikčních faktorů.

9. Závěry a výhledy do budoucna

Nepřetržitý a hloubkový výzkum rodiny Schlafen učinil v posledních letech významný pokrok směrem k objasnění rolí Schlafenových proteinů. Současné studie ukázaly, že Schlafenovy proteiny hrají kritickou roli při regulaci imunitní odpovědi i buněčného cyklu. Některé z těchto proteinů jsou spojeny s náchylností k léčbě nádorů a lékovou rezistencí [13–15,135]; tak biologická funkce proteinů rodiny Schlafen v nádorových buňkách poskytuje nové metody a nápady pro detekci a léčbu nádorů. Kromě toho Schlafenovy proteiny vykazují relativně široký inhibiční účinek na retroviry prostřednictvím modulace RNA k inhibici translace. Schlafenovy proteiny se také podílejí na virové infekci nepřímo prostřednictvím interferonové signalizace. Objev mechanismu pro přímou inhibici exprese virového genu prostřednictvím vazby SLFN5 na virovou DNA v jádře zvýraznil potenciální rozmanitost v antivirových mechanismech rodiny Schlafen.

Četné dosavadní poznatky ukazují, že rodina Schlafen má roli v různých buněčných odpovědích, včetně vývoje imunitních buněk a vnitřní/vrozené imunity. Tato rodina proteinů je nepochybně důležitým cílem pro léčbu rakoviny, stejně jako pro výzkum pochopení a prevence virových infekcí. Funkční studie Schlafenových proteinů jsou však stále v plenkách a zbývá vyřešit mnoho důležitých otázek. Ačkoli rodina Schlafen sdílí několik podobných domén, vykazují funkční rozdíly. Tyto rozdíly naznačují, že členové rodiny Schlafen propůjčují specifičnost jejich antivirovým aktivitám, což zdůrazňuje důležitost studia strukturních vlastností a funkčních mechanismů.

Naštěstí byly stanoveny struktury pro potkaní Slfn13 [24] a lidský SLFN5 [31], což poskytuje pohled na probíhající studie proteinů rodiny Schlafen. Kromě toho musí být překonána omezení pokusů na zvířatech pro klinické použití. Rodina Schlafen vykazovala rychlou evoluční tendenci u několika hlodavců a stupeň konzervace mezi hlodavčími a lidskými geny Schlafen není vysoký. Například SLFN5 a SLFN11 jsou nejhojnější a vysoce studované v různých buňkách, ale podobnost SLFN5 mezi myšími a lidmi je pouze 59 procent na základě identity aminokyselinové sekvence a u myší neexistuje žádný ortolog SLFN11. SLFN5 a SLFN14 jsou jediné orthology sdílené mezi myší a lidmi (obrázek 1). Proto existuje potřeba vyvinout novou platformu, jako jsou organoidní modely, které mohou nahradit studie in vivo.

Vzhledem k různým funkcím proteinů rodiny Schlafen se očekává, že různé proteiny vazebných partnerů v buňce budou hrát roli v jejich regulaci. Ačkoli nebyla publikována žádná zpráva o výsledcích globálního proteomického přístupu k interaktomu, je zásadní objevit a studovat roli vazebných partnerů jako faktorů, které odlišují funkci a regulaci intracelulární aktivity proteinů rodiny Schlafen. Studium souvislostí mezi hladinou exprese Schlafen a prognózou rakoviny může být aplikováno na virem zprostředkovaný výzkum nádorů nebo léčbu pomocí virových vektorů. Navzdory svému názvu má pole Schlafen k ospalosti daleko. Probíhající studie poskytnou důležitý pohled na biologii virů i nádorů a navrhnou způsoby, jak lze jejich jedinečné aktivity využít pro terapeutické aplikace.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, ETK a MDW; psaní – příprava původního návrhu, ETK; psaní—recenze a editace, MDW; vizualizace, ETK Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.

Financování:

Tato práce byla podpořena Programem základního vědeckého výzkumu prostřednictvím Korejské národní výzkumné nadace (NRF) financovaného ministerstvem školství (2021R1A2C1010313). MDW byla částečně podporována granty od National Institutes of Health (AI115104 a NS082240) a prostředky z Children's Hospital of Philadelphia.

Poděkování:

Děkujeme Joe Dybasovi za jeho komentáře k rukopisu.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Schwarz, DA; Katayama, CD; Hedrick, SM Schlafen, nová rodina růstových regulačních genů, které ovlivňují vývoj thymocytů. Imunita 1998, 9, 657–668. [CrossRef]

2. Geserick, P.; Kaiser, F.; Klemm, U.; Kaufmann, ONA; Zerrahn, J. Modulace vývoje a aktivace T buněk novými členy genové rodiny Schlafen (slfn) nesoucí motiv podobný RNA helikáze. Int. Immunol. 2004, 16, 1535–1548. [CrossRef] [PubMed]

3. Neumann, B.; Zhao, L.; Murphy, K.; Gonda, TJ Subcelulární lokalizace proteinové rodiny Schlafen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 370, 62–66. [CrossRef] [PubMed]

4. Kuang, C.; Yang, T.; Zhang, Y.; Zhang, L.; Wu, Q. Schlafen 1 inhibuje proliferaci a tvorbu trubic endoteliálních progenitorových buněk. PLoS One 2014, 9, e109711. [CrossRef] [PubMed]

5. Brady, G.; Boggan, L.; Bowie, A.; O'Neill, LAJ Schlafen-1 způsobuje zástavu buněčného cyklu inhibicí indukce cyklinu D1. J. Biol. Chem. 2005, 280, 30723–30734. [CrossRef]

6. Oh, P.-S.; Patel, VB; Sanders, MA; Kanwar, SS; Yu, Y.; Nautiyal, J.; Patel, BB; Majumdar, APN Schlafen-3 snižuje expresi markerů rakovinných kmenových buněk a autokrinní/juxtakrinní signalizaci v buňkách rakoviny tlustého střeva rezistentních na FOLFOX. Dopoledne. J. Physiol. Gastrointestinální vyšetření. Fyziol jater. 2011, 301, G347–G355. [CrossRef]

7. Patel, VB; Yu, Y.; Das, JK; Patel, BB; Majumdar, APN Schlafen-3: Nový regulátor střevní diferenciace. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009, 388, 752–756. [CrossRef]

8. Sassano, A.; Mavrommatis, E.; Arslan, AD; Kroczynska, B.; Beauchamp, EM; Khuon, S.; Chew, T.-L.; Zelená, KJ; Munshi, HG; Verma, AK; a kol. Human Schlafen 5 (SLFN5) je regulátorem motility a invazivity buněk renálního karcinomu. Mol. Buňka. Biol. 2015, 35, 2684–2698. [CrossRef]

9. Al-Marsoummi, S.; Vomhof-DeKrey, E.; Basson, MD Schlafen12 Snižuje agresivitu trojnásobně negativního karcinomu prsu prostřednictvím post-transkripční regulace ZEB1, která řídí diferenciaci kmenových buněk. Buňka. Physiol. Biochem. 2019, 53, 999–1014. [CrossRef]

10. Al-Marsoummi, S.; Pacella, J.; Dockter, K.; Soderberg, M.; Singhal, SK; Vomhof-Dekrey, EE; Basson, MD Schlafen 12 je prognosticky příznivý a snižuje C-Myc a proliferaci u plicního adenokarcinomu, ale ne u spinocelulárního karcinomu plic. Cancers 2020, 12, 2738. [CrossRef]

11. Companioni Nápoles, O.; Tsao, AC; Sanz-Anquela, JM; Sala, N.; Bonet, C.; Pardo, ML; Ding, L.; Simo, O.; Saqui-Salces, M.; Blanco, VP; a kol. Exprese SCHLAFEN 5 koreluje se střevní metaplazií, která progreduje do rakoviny žaludku. J. Gastroenterol. 2016, 52, 39–49. [CrossRef] [PubMed]

12. Zoppoli, G.; Regairraz, M.; Leo, E.; Reinhold, WC; Varma, S.; Ballestrero, A.; Doroshow, JH; Pommier, Y. Předpokládaná DNA/RNA helikáza Schlafen-11 (SLFN11) senzibilizuje rakovinné buňky k činidlům poškozujícím DNA. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2012, 109, 15030–15035. [CrossRef] [PubMed]

13. Tian, ​​L.; Song, S.; Liu, X.; Wang, Y.; Xu, X.; Hu, Y.; Xu, J. Schlafen-11 senzibilizuje buňky kolorektálního karcinomu na irinotekan. Protirakovinné. Drogy 2014, 25, 1175–1181. [CrossRef] [PubMed]

14. Nogales, V.; Reinhold, WC; Varma, S.; Martinez-Cardus, A.; Moutinho, C.; Moran, S.; Heyn, H.; Sebio, A.; Barnadas, A.; Pommier, Y.; a kol. Epigenetická inaktivace domnělé DNA/RNA helikázy SLFN11 u lidské rakoviny propůjčuje rezistenci vůči platinovým lékům. Oncotarget 2015, 7, 3084–3097. [CrossRef] [PubMed]

15. Stewart, CA; Tong, P.; Cardnell, RJ; Sen, T.; Li, L.; Gay, CM; Masrorpour, F.; Fan, Y.; Bára, RO; Feng, Y.; a kol. Dynamické variace v přechodu z epitelu na mezenchym (EMT), ATM a SLFN11 řídí odpověď na inhibitory PARP a cisplatinu u malobuněčného karcinomu plic. Oncotarget 2017, 8, 28575–28587. [CrossRef] [PubMed]

16. Shee, K.; Wells, JD; Jiang, A.; Miller, TW Integrovaná exprese genu pro pan-rakovinu a analýza citlivosti na léky odhaluje mRNA SLFN11 jako biomarker solidního nádoru, který předpovídá citlivost na chemoterapii poškozující DNA. PLoS One 2019, 14, e0224267. [CrossRef]

17. Winkler, C.; Arménie, J.; Jones, GN; Tobalina, L.; Prodej, MJ; Petreus, T.; Baird, T.; Serra, V.; Wang, AT; Lau, A.; a kol. SLFN11 informuje o standardu péče a nových léčebných postupech u široké řady modelů rakoviny. Br. J. Cancer 2021, 124, 951–962. [CrossRef]

18. Li, M.; Kao, E.; Gao, X.; Sandig, H.; Limmer, K.; Pavon-Eternod, M.; Jones, TE; Landry, S.; Pan, T.; Weitzman, MD; a kol. Inhibice syntézy proteinů HIV lidským schlafenem založená na použití kodonů 11. Nature 2012, 491, 125–128. [CrossRef]

19. Seong, R.-K.; Seo, S.; Kim, J.-A.; Fletcher, SJ; Morgan, NV; Kumar, M.; Choi, Y.-K.; Shin, OS Schlafen 14 (SLFN14) je nový antivirový faktor zapojený do kontroly virové replikace. Imunobiologie 2017, 222, 979–988. [CrossRef]

20. Kim, ET; Dybas, JM; Kulej, K.; Reyes, ED; Cena, AM; Akhtar, LN; Orr, A.; Garcia, BA; Boutell, C.; Weitzman, MD Komparativní proteomika identifikuje Schlafen 5 (SLFN5) jako restrikční faktor viru herpes simplex, který potlačuje virovou transkripci. Nat. Microbiol. 2021, 6, 234–245. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com