Pokroky ve výzkumu ve složení antioxidantů botanických extraktů a jejich akčních mechanismů
Oct 12, 2024
Abstraktní:Oxidační poškozeníOrganismy způsobené volným radikálem mohou vést k výskytu mnoha nemocí, zatímco mnoho přírodních látek má schopnost uklidit volné radikály. Rostliny jsou nejdůležitějším zdrojem exogenních antioxidantů lidského těla. Tento článek shrnuje dříve hlášené studie o antioxidantovém složení botanických extraktů hlavně sestávajících z polyfenolů, vitamínů, alkaloidů, saponinů, polysacharidů, bioaktivních peptidů a jejich akčních mechanismů.
Klíčová slova:volný radikál;Botanický extrakt;Antioxidační složka;mechanismus

Antioxidant Herb Cistanche 100krát výkonná než VC v hroznu
Podpůrná služba Wecistanche
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950
Volné radikály odkazují na atomy, molekuly nebo skupiny s nepárovými elektrony ve svých vnějších drahách. Jsou to střední metabolity mnoha biochemických reakcí v životních činnostech aerobních organismů. Za normálních okolností jsou volné radikály v lidském těle v dynamické rovnováze nepřetržitého generování a odstraňování. Pokud se produkuje příliš mnoho volných radikálů nebo je odstraněno příliš málo, nadměrné volné radikály způsobí oxidační stres buněčnému stresu, což povede k oxidačnímu poškození těla a může vést k výskytu mnoha onemocnění, jako je ateroskleróza, diabetes, nádory, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu atd. Jako nejdůležitější zdroj exogenních antioxidačních látek v lidském těle se rostoucí pozornost věnovala antioxidační výzkum a vývoj rostlinných extraktů a dosáhla mnoha výsledků. Tento článek stručně shrnuje antioxidační složky extrahované z rostlin a jejich možných antioxidačních mechanismů.
1 výzkum antioxidačních složek rostlinných extraktů
V současné době je většina výzkumů rostlinných antioxidantů zaměřena na čínské bylinné léky, koření, zeleninu, ovoce, rostlinné nápoje a zrna. Antioxidační aktivní složky rostlinných extraktů zahrnují hlavně polyfenoly, vitamíny, alkaloidy, saponiny, polysacharidy, polypeptidy atd.
1.1 Polyfenoly
Rostlinné polyfenolové antioxidanty lze rozdělit do tří hlavních kategorií na základě jejich chemických struktur: flavonoidů, fenolových kyselin a taninů.
1.1.1 Flavonoidy
Flavonoidy, známé také jako flavonoidní sloučeniny, jsou nejrozsáhlejšími polyfenoly a nacházejí se téměř ve všech tkáních rostlin. Odkazuje na řadu sloučenin sestávajících ze dvou benzenových kroužků (A- a B-kroužků) spojených centrální vazbou na trojité uhlík. Lze to dále rozdělit na podložky, jako jsou flavonoidy, flavonoly, flavanony, dihydroflavonoly, flavan -3- ols (také známé jako katechiny), isoflavony, chalkony a anthokyanidiny.
Flavonoidy mají různé antioxidační aktivity a velikost jejich antioxidační aktivity úzce souvisí se strukturou sloučeniny. Pozice a počet fenolických hydroxylových skupin a jejich substituentů (jako je 4- karbonyl, hydroxyl glykosidy, hydroxymethylace a Δ2 (3) dvojné vazby) jsou důležitými faktory při určování jejich antioxidační aktivity [3-4]. Obecně se předpokládá, že orto-difenolická hydroxylová skupina na prstenu B hraje hlavní roli v antioxidační aktivitě flavonoidů; Skupina orto-dihydroxylu na jednom kruhu a para-dihydroxylová skupina na druhém kruhu vytvářejí velmi slibnou antioxidační aktivitu a přidání hydroxylových skupin v 5, 7 a 8 pozicích na A. A může zvýšit antioxidační kapacitu pro různé stupně [5].
Mnoho flavonoidních sloučenin vykazuje významné antioxidační vlastnosti, jejichž reprezentativní příklady zahrnují akaciatin, quercetin, naringenin, cypermethrin, čajové polyfenoly, sójové isoflavony, trihydroxychalcon, kyanidin atd.
1.1.2 látky kyseliny fenolové
Fenolová kyselina se týká třídy sloučenin s několika fenolovými hydroxylovými skupinami na stejném benzenovém kruhu. Fenolové látky s kyselinou kyselinou s antioxidačními vlastnostmi nalezenými v přírodních rostlinách lze rozdělit do tří kategorií: První kategorií je kyselina hydroxybenzoová a její deriváty, jako je kyselina protokatechu, kyselina gallová, kyselina stříkačka atd.; Druhou kategorií je kyselina ellagová a její deriváty, jako je 3- kyselina hydroxyfenylác; Třetí kategorií je kyselina hydroxycinnamová (kyselina hydroxyfenylakrylová) a její deriváty, jako je kyselina chlorogenová, kyselina feulická, kyselina kofeinová, kyselina rosmarinová, kyselina sinapinová atd.
Antioxidační kapacita látek kyseliny fenolické kyseliny sleduje stejná pravidla v chemické struktuře jako flavonoidy, tj. U těch, které mají sousední fenolické hydroxylové skupiny na benzenovém kruhu, jsou mnohem silnější než ty bez nich. Například kyselina galinová a její různé deriváty se strukturou pyrogallolu jsou silnější než kyseliny pouze s dvěma hydroxylovými skupinami. Antioxidační kapacita látek obsahujících katechol, jako je kyselina chlorogenová, kyselina kofeová a kyselina rosmarinová, je mnohem silnější než u kyseliny ferulové a kyseliny sinapové, které mají pouze jednu hydroxylovou skupinu [1].

Antioxidant Herb Cistanche 100krát výkonná než VC v hroznu
1.1.3 Tanniny
Tanniny, také známé jako taniny, jsou široce distribuovány v rostlinách a obvykle se odkazují na rostlinné polyfenoly s relativní molekulovou hmotou 500 až 3000. Podle jejich různých molekulárních struktur a obtížnosti v hydrolýze je lze rozdělit do tří kategorií: jako oligové a oligové a oligové a oligové a jako oligové a jako oligové a jako oligové a jako oligoty (jako jsou jako oligoty (jako jsou jako oligoty (jako oligoty a oligoty (jako jsou oligony (jako jsou galské taniny a elagitaniny). Proanthocyanidiny) a komplexní taniny tvořené uhlíkovými vazbami mezi kondenzovanými tříslovinami a glukózou v hydrolyzovaných taninech (jako jsou taniny Camellia a guava taniny). Existují tři faktory, které ovlivňují antioxidační aktivitu taninů [6-7]: režim lepení jednotek; Zda je hydroxylová skupina zdarma; Typ a počet skupin hexahydroxydibenzoyl (HHDP), galloyl (gall) a dehydrohexahydroxydibenzoyl (dhhdp). Když jsou vazebné jednotky taninu (jako jsou katechiny) vázány hydrolyzovatelnými esterovými vazbami nebo glykosidickými vazbami, antioxidační kapacita molekuly je zvýšena, zatímco když jsou vázány vazbami uhlíku za vytvoření kondenzované formy, a antioxidační kapacita molekuly; Když je fenolická hydroxylová skupina volná, vede ke zvýšení aktivity; Aktivita skupin HHDP, Gall a DHHDP je v pořadí HHDP> GLY> DHHDP. Ve vazebné jednotce, čím více jsou tyto tři skupiny, tím větší aktivita.
1,2 vitamíny
Vitaminy jsou nejen nepostradatelné potravinové živiny, ale také nejdůležitější antioxidační látky pro lidské tělo. Antioxidační vitaminy v rostlinách jsou hlavně VE, VC a karotenoidy, ale za určitých okolností se mohou také stát prooxidanty [8].
1.2.1 VE.
VE je obecný termín pro různé tokoferoly, mezi nimiž -tokoferol má největší biologickou aktivitu. Užívání -tokoferolu jako měřítka je fyziologické aktivity -tokoferol, -tokoferol a 5 -tokoferol 40%, 8% a 20% a aktivity ostatních jsou extrémně slabé [9]. Ve většině případů je antioxidační účinek VE reagovat s lipidovými kyslíkovými volnými radikály nebo lipidovými peroxylovými volnými radikály, poskytovat je vodíkové ionty a přerušit reakci peroxidace lipidů. Jedná se o nejdůležitější antioxidant rozpustný řetězec rozpustný [10].
1.2.2 VC
VC, také známá jako kyselina askorbová, je kyselá polyhydroxy sloučenina obsahující -ketolakton s 6 atomy uhlíku. Má hydroxylovou skupinu typu Enol, která může disociovat ionty vodíku a je nejdůležitějším zachycovacím antioxidantem rozpustným ve vodě. Může zachytit reaktivní kyslíkové volné radikály dodáváním elektronů krok za krokem; Může také chránit a podporovat regeneraci VE [1].
1.2.3 karotenoidy
Existuje více než 600 druhů karotenoidů, z nichž všechny mají isoprenoidní strukturu s 11 dvojitými vazbami. -Caroten je typický reprezentativní. Studie zjistily, že lykopen, astaxanthin, lutein a zeaxanthin mají také významné antioxidační vlastnosti.
-Caroten je předchůdcem VA. Skládá se ze čtyř isoprenových dvojitých vazeb připojených na konci. Na obou koncích molekuly je kroužek -iononu. Existují hlavně all-trans, 9- cis a l 3- Existují 4 formy: cis a l 5- cis. Má velmi dobré antioxidační vlastnosti a může inhibovat tvorbu reaktivních druhů kyslíku poskytováním elektronů.
K úklidu volných radikálů [11].
Lykopen je acyklický karotenoid s necyklickou lineární all-trans strukturou obsahující 11 konjugovaných dvojitých vazeb a 2 nekonjugované dvojité vazby. Může přijmout excitaci různých elektronů a generovat kyslík nebo triplet kyslík lykopen. Jeden trojnásobný kyslíkový lykopen může uhasit tisíce singletových kyslíkových volných radikálů a jeho antioxidační kapacita je 100krát vyšší než ve VE a VC. 1, 000 časy silnější a je nejsilnějším antioxidantem přírody, který zpožďuje stárnutí [12].
Astaxanthin je speciální oxidovaný karotenoid. Má nejen dlouhou konjugovanou dvojitou vazbu v molekule jako jiné karotenoidy, ale má také hydroxylovou skupinu na 3 a 4 pozicích svých dvou fialových prstenů. a nenasycené ketonové skupiny. Tato sousední skupina hydroxylové skupiny a ketone může představovat -hydroxyketon. Tyto uzly
Struktura má relativně aktivní elektronický efekt, který může poskytnout elektrony volným radikálům nebo přilákat nepárové elektrony volných radikálů a může snadno zachytit volné radikály. Proto má astaxanthin silnější antioxidační vlastnosti než obyčejné karotenoidy [13].
Existuje 8 izomerů luteinu, které se vyskytují hlavně v tmavě zelené zelenině, jako je zelí a špenát, a květiny, jako jsou měsíčky a měsíčky. Zeaxanthin se nachází především v potravinách, jako jsou bobule Goji, kukuřice, špenát a asijské tomel. Lutein a Zeaxanthin vždy existují společně a jejich funkce jsou velmi podobné.
Pokud jde o antioxidant, může snížit poškození oxidačního stresu na oči, tj. Má schopnost odolat oxidaci vyvolané světlem v makule sítnice a může zabránit stárnutí způsobené degradací vizuálního skvrny [{0}}]. Kromě toho může zabránit oxidaci proteinů a lipidů v čočce, čímž se snižuje výskyt senilních katarakty [15].

Antioxidant Herb Cistanche 100krát výkonná než VC v hroznu
1.2.2 VC
VC, také známá jako kyselina askorbová, je kyselá polyhydroxy sloučenina obsahující -ketolakton s 6 atomy uhlíku. Má hydroxylovou skupinu typu Enol, která může disociovat ionty vodíku a je nejdůležitějším zachycovacím antioxidantem rozpustným ve vodě. Může zachytit reaktivní kyslíkové volné radikály dodáváním elektronů krok za krokem; Může také chránit a podporovat regeneraci VE [1].
1.2.3 karotenoidy
Existuje více než 600 druhů karotenoidů, z nichž všechny mají isoprenoidní strukturu s 11 dvojitými vazbami. -Caroten je typický reprezentativní. Studie zjistily, že lykopen, astaxanthin, lutein a zeaxanthin mají také významné antioxidační vlastnosti.
-Caroten je předchůdcem VA. Skládá se ze čtyř isoprenových dvojitých vazeb připojených na konci. Na obou koncích molekuly je kroužek -iononu. Existují hlavně all-trans, 9- cis a l 3- Existují 4 formy: cis a l 5- cis. Má velmi dobré antioxidační vlastnosti a může inhibovat tvorbu reaktivních druhů kyslíku poskytováním elektronů.
K úklidu volných radikálů [11].
Lykopen je acyklický karotenoid s necyklickou lineární all-trans strukturou obsahující 11 konjugovaných dvojitých vazeb a 2 nekonjugované dvojité vazby. Může přijmout excitaci různých elektronů a generovat kyslík nebo triplet kyslík lykopen. Jeden trojnásobný kyslíkový lykopen může uhasit tisíce singletových kyslíkových volných radikálů a jeho antioxidační kapacita je 100krát vyšší než ve VE a VC. 1, 000 časy silnější a je nejsilnějším antioxidantem přírody, který zpožďuje stárnutí [12].
Astaxanthin je speciální oxidovaný karotenoid. Má nejen dlouhou konjugovanou dvojitou vazbu v molekule jako jiné karotenoidy, ale má také hydroxylovou skupinu na 3 a 4 pozicích svých dvou fialových prstenů. a nenasycené ketonové skupiny. Tato sousední skupina hydroxylové skupiny a ketone může představovat -hydroxyketon. Tyto uzly
Struktura má relativně aktivní elektronický efekt, který může poskytnout elektrony volným radikálům nebo přilákat nepárové elektrony volných radikálů a může snadno zachytit volné radikály. Proto má astaxanthin silnější antioxidační vlastnosti než obyčejné karotenoidy [13].
Existuje 8 izomerů luteinu, které se vyskytují hlavně v tmavě zelené zelenině, jako je zelí a špenát, a květiny, jako jsou měsíčky a měsíčky. Zeaxanthin se nachází především v potravinách, jako jsou bobule Goji, kukuřice, špenát a asijské tomel. Lutein a Zeaxanthin vždy existují společně a jejich funkce jsou velmi podobné.
Pokud jde o antioxidant, může snížit poškození oxidačního stresu na oči, tj. Má schopnost odolat oxidaci vyvolané světlem v makule sítnice a může zabránit stárnutí způsobené degradací vizuálního skvrny [{0}}]. Kromě toho může zabránit oxidaci proteinů a lipidů v čočce, čímž se snižuje výskyt senilních katarakty [15].
2 Výzkum antioxidačního mechanismu rostlinných extraktů
Vlastnosti a antioxidační mechanismy různých přírodních rostlinných extraktů nejsou stejné. Antioxidační mechanismy uvedené v současném výzkumu zahrnují hlavně následující aspekty:
2.1 Přímé úklidové nebo inhibice volných radikálů
Rostlinné extrakty mohou působit jako dárci vodíku nebo elektronů, přímo uhasit nebo inhibovat volné radikály, ukončit řetězovou reakci volných radikálů a vykonávat antioxidační funkci.
2.1.1 PŘIPOJENÍ PROTONŮ
Většina antioxidačních složek jsou kyslíkové volné radikální vychytávače, jako jsou polyfenoly, steroly, VE atd. Jedním z důvodů je, že mohou uvolňovat malé a vysoce afinitní vodíkové protony k zachycení vysoce aktivních volných radikálů s vysokou potenciální energií a převést je na neaktivní nebo relativně stabilní sloučeniny. Současně jsou sami přeměněni na látky, které jsou stabilnější než volné radikály generované reakcí oxidačního řetězu, čímž přerušují nebo zpožďují řetězovou reakci [29].

2.1.2 Poskytování elektronů
Dalším důvodem, proč rostlinné extrakty vyvíjejí antioxidační účinky, je to, že přímo darují elektrony prostřednictvím přenosu elektronů na vychytávání volných radikálů, jako jsou polyfenoly, rostlinné polysacharidy, vitamíny atd. -Karoten má vynikající antioxidační vlastnosti a může inhibovat generování reaktivních druhů kyslíku. VC se na druhé straně transformuje na semi-dehydroaskorbovou kyselinu a kyselinu dehydroaskorbovou tím, že postupně poskytuje elektrony k dosažení účelu úklidu reaktivních volných radikálů kyslíku [30].
2.2 působící na enzymy související s volnými radikály
Enzymy související s volnými radikály jsou rozděleny do dvou kategorií: oxidázy a antioxidační enzymy. Antioxidační účinek rostlinných extraktů se odráží při inhibici aktivity souvisejících oxidáz a zvyšování aktivity antioxidačních enzymů.
2.2.1 Inhibice aktivity oxidáz
Mnoho oxidáz v těle, jako je xanthin oxidáza (XOD), p -450 enzymy, myeloperoxidáza (MPO), lipoxygenáza a cyklooxygenáza, souvisí s generováním volných radikálů a mohou indukovat velký počet volných radikálů. Kromě toho se aktivita indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (INOS) zvyšuje během ischemické reperfúze, což způsobuje velké množství NO a způsobuje oxidační poškození. Studie ukázaly, že mnoho rostlinných extraktů má inhibiční účinky na výše uvedené oxidázy, což inhibuje generování volných radikálů ze zdroje. Quercetin a kurkumin ve flavonoidech mohou inhibovat aktivitu iNOS během poškození ischémie-reperfúze, čímž hrají antioxidační roli [31]. Saponiny Gynostetemma pentaphyllum mohou snížit abnormálně zvýšené aktivity XOD a MPO, zlepšit oxidační stres v ledvinách diabetických potkanů a zpoždění progrese poškození ledvin [32].
2.2.2 Zvyšte aktivitu antioxidačních enzymů
Tělo má antioxidační enzymy, které chrání, odstraňují a opravují nadměrné poškození volných radikálů, jako je superoxiddismutáza (SOD), glutathion peroxidáza (GSH-PX), kataláza (CAT) a peroxidáza.
SOD je hlavním vychytávačem superoxidových aniontů v těle a katalyzuje jejich rozklad na H2O2, ale H2O2 má také oxidační poškození a Cat jej převádí na O2 a H2O. Současně může H2O2 také generovat H2O prostřednictvím katalýzy GSH-PX a reakce se sníženým glutathionem (GSH) a zároveň generovat oxidovaný glutathion.
Mnoho studií ukázalo, že antioxidační složky extrahované rostlinami mohou nejen chránit antioxidační enzymy těla, ale také zvyšovat aktivitu antioxidačních enzymů v těle. Například quercetin ve flavonoidech může snížit oxidační poškození pankreatických buněk a zároveň obnovit aktivitu SOD, GSH-PX a CAT u zvířat s Fe 2+- vyvolaným poškozením ledvin [33]. Saponiny mají malý účinek na samotné kyslíkové volné radikály, ale většina z nich může zvýšit aktivitu antioxidačních enzymů, jako je SOD a CAT v těle, čímž se zvyšuje funkci antioxidačního systému těla [34].
Kromě toho některé přirozené látky mohou vyvolat expresi antioxidačních enzymů, jako je SOD v těle na genu a transkripční úrovně, vyvíjet jejich antioxidační účinky [35].
2.3 Chelatační a pasivační ionty přechodných kovů
Přechodové kovové ionty (například Fe 2+, Cu 2+ atd.) Jsou nezbytné v procesu generování volných radikálů kyslíku. Například Fe 2+ může zprostředkovat peroxidaci lipidů a je také katalyzátorem generování volných radikálů, jako je · OH. Flavonoidy v rostlinných extraktech mají molekulární strukturu 4- keto a 5- hydroxylu a vicinální hydroxylové skupiny v 3 'a 4' polohách B kruhu obsahují kovové ionty. Mezi další antioxidační složky, které mohou chelát a pasivaci prooxidačních kovových iontů koordinací elektronů, patří taniny, polysacharidy, aktivní peptidy [3 6], kyselina fytonová, kyselina citronová atd.
2.4 Komplementarita a synergie mezi antioxidačními komponenty
Antioxidační složky v rostlinných extraktech se doplňují a navzájem se koordinují. Společně vyvíjejí antioxidační účinky in vivo prostřednictvím přenosu elektronů a/nebo protonů, působí na oxidázy a antioxidační enzymy, chelating a pasivace přechodných kovových iontů a ovlivňující expresi genů. Studie zjistily, že různé koncentrace čajových polyfenolů a amerického ženšenu mají zjevné synergické účinky a synergický účinek se zvyšuje se zvýšením koncentrace [37]. VE a VC mají významný synergický účinek na redukční schopnost antioxidačních peptidů cizrny a synergický účinek VC s antioxidačními peptidy cizrny je silnější než VE. Všechny synergické účinky se zvyšují se zvýšením množství přidání a doba akce [38].
3 Závěr
Značná část současného výzkumu přírodních antioxidačních složek v mé zemi je stále na nepurifikovaných nebo částečně čištěných extraktech. Ve výzkumu se snažíme oddělit a shromažďovat řadu monomerních sloučenin, studovat vztah mezi jejich chemickou strukturou a antioxidační aktivitou a stabilitou, antioxidačním mechanismem, vícesložkovou synergií atd., Který má důležitou hodnotu aplikace a vedení význam pro vývoj nových, účinných a bezpečných antioxidantů. Může také poskytnout teoretický základ pro budoucí systematický výzkum na rostlinné antioxidační aktivitě, objevování olověných sloučenin a strukturální modifikaci a syntézu přírodních látek.
Data navíc ukazují, že většina současného antioxidačního výzkumu používá in vitro experimenty a existuje jen málo celkových nebo in vivo experimentálních dat, což ztěžuje systematicky a přesně odrážející úplný obraz antioxidačního účinku přírodních složek. Na základě celkových experimentů, doplněných in vitro experimenty a integrace multidisciplinárních znalostí, jako je enzymologie, imunologie a farmakologie, aby se vytvořil komplexní, objektivní, efektivní a rychlý experimentální model na zvířatech pro komplexní hodnocení antioxidační aktivity látek, je klíčovým problémem v budoucím výzkumu. S vyhlášením a prováděním „zákona o bezpečnosti potravin“ bude mít aplikaci antioxidantů na bezpečné rostliny v potravinářských přísadách také širší vyhlídku.
Reference:
[1] Ling Guanting. Antioxidační jídlo a zdraví [M]. Peking: Chemical Industry Press, 2004: 22.
[2] Pu Xianglan. Výzkum běžných přírodních antioxidantů [M]. Peking: Minzu University of China Press,
2008: 2.
[3] Feng Tao, Zhuang Haining. Vývoj výzkumu ve vztahu mezi strukturálními charakteristikami a antioxidační aktivitou flavonoidů [J].
Grain and Oils, 2008 (10): 8-11.
[4] Burda S, Oleszek W. Antioxidační a antiradikální aktivity
Flavonoidy [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49 (6):
2774-2779. [5] Zhang Guizhi, Geng Sha, Yang Haiyan, et al. Vývoj průzkumu antioxidačních složek rostlin [J]. Food Science, 2007, 28 (12): 551-553.
[6] Yang Zhiyun, Liu Zheng. Vývoj výzkumu na antioxidačních složkách a metodách hodnocení v přírodních lécích [J]. Chinese Medicine, 2005, 18 (3): 492-494.
[7] Gu Haifeng, Li Chunmei, Xu Yujuan, et al. Strukturální rysy a
Antioxidační aktivita taninu z Pulp Pulp [J]. Výzkum potravin
International, 2008, 41 (2): 208-217.
[8] Ge Yinghua, Zhong Xiaoming. Vývoj výzkumu na antioxidační mechanismus a aplikaci vitamínu C a vitamínu E [J]. Jilin Medicine, 2007, 28 (5): 707-708.
[9] Wang Jingyan, Zhu Shenggeng, Xu Changfa, et al. Biochemie [M]. Peking: Gaofeng Education Press, 2002: 423. [10] Li Shuguo, Zhao Wenhua, Chen Hui. Vývoj výzkumu antioxidantů a bezpečnost jedlých olejů a tuků [J]. Obilí a oleje, 2006 (5): 34-37. [11] Dong Jie. Krátká diskuse o karotenoidech [J]. Farmaceutické chemikálie, 2007 (10): 16-25. [12] Mao jako, Gao Yanxiang. Přehled výzkumu stability lykopenu [J]. China Food Aditives, 2008
(2): 57-61.






