Renoprotektivní účinek isoliquiritigeninu na akutní poškození ledvin vyvolané cisplatinou prostřednictvím inhibice FPR2 v makrofágu

Pro více informací prosím kontaktujte: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi a kol

Klikněte na Cistanche pro léčbu onemocnění ledvin

Abstraktní

Akutní poškození ledvin (AKI) je závažnou komplikací u kriticky nemocných pacientů. Hromadné důkazy ukázaly, že makrofágy hrají důležitou prozánětlivou roliAkutní poškození ledvina isoliquiritigenin (ISL) mohou inhibovat makrofagický zánět, ale jeho role vAkutní poškození ledvina základní mechanismus není znám. Cílem této studie je prozkoumat renoprotektivní účinek ISL na AKI a roli formylpeptidových receptorů 2 (FPR2) v tomto procesu. V této studii byly k provedení experimentů in vivo a in vitro použity model AKI indukovaný cisplatinou a model zánětu makrofágů indukovaný lipopolysacharidy. Výsledky ukázaly, že ISL silně uleviloporanění ledvina inhibovaly zánět ledvin in vivo a potlačovaly makrofagickou zánětlivou odpověď in vitro. Důležité je, že bylo zjištěno, že FPR2 byla významně upregulována ve srovnání s kontrolní skupinou u AKI a LPS-indukovaných makrofágů, zatímco byla silně potlačena ISL. Je zajímavé, že nadměrná exprese FPR2 s transfekcí pcDNA3.{4}}FPR2 účinně zvrátila protizánětlivý účinek ISL v makrofágu, což naznačuje, že FPR2 může být potenciálním cílem ISL k prevenci zánětu a zlepšeníporanění ledvinzAkutní poškození ledvin. Celkově tato zjištění naznačují, že ISL zlepšila indukci cisplatinouporanění ledvininhibicí FPR2 zahrnutého makrofágového zánětu, který může poskytnout potenciální terapeutickou možnost pro AKI.

1. Úvod

Akutníledvinazranění (AKI) je běžný těžký typledvinaonemocnění s vysokou mortalitou.1 Je charakterizováno rychlým poklesem renálních funkcí, ke kterému dochází do 7 dnů nebo méně. Nedávné publikace uvádějí, že výskyt AKI je až 5 procent hospitalizovaných a 30 procent těžkých pacientů aAKIzpůsobuje každoročně 2 miliony úmrtí na celém světě, což se stalo celosvětovým zdravotním problémem. Ačkoli je definice běžná a jednotná, AKI může být způsobena řadou důvodů, včetně příjmu nefrotoxických léků, ischemicko-reperfuzního poškození (Ischemia-reperfuzní poškození, IRI), sepse, kardiovaskulární chirurgie, hypertenze a cukrovky.2,3 Starší věk, cukrovka a srdeční selhání zvyšují riziko AKI, což u některých pacientů obvykle vede k ireverzibilnímu chronickému onemocnění ledvin (CKD) a konečnému stadiu onemocnění ledvin (ESRD).4 Studie ukázaly, že se účastní téměř všechny imunitní buňky. při imunitním zánětu ledvin u AKI.5 Mezi nimi bylo prokázáno, že makrofágy hrají důležitou roli při podpoře zánětu ledvin.6 Vymazání makrofágů zlepšuje poškození a zánět ledvin AKI.7 Proto může být účinná inhibice makrofágového zánětu prospěšná zlepšení současných terapeutických přístupů k léčbě AKI.

Isoliquiritigenin (ISL) je flavonoid s chalkonovou strukturou, který má kořeny ve slavné tradiční čínské bylinné medicíně.8 V posledních letech přitahuje širokou pozornost vědců díky svému antioxidačnímu, protizánětlivému účinku, proti shlukování krevních destiček, antibakteriálnímu , antivirové, protinádorové, hepatoprotektivní, neuroprotektivní, srdeční ochranné a detoxikační vlastnosti.9 Bylo prokázáno, že ISL inhibuje buněčnou proliferaci, snižuje ROS a v různé míře indukuje apoptózu, nekrotiku a smrt rakovinných buněk.10 zprávy ukázaly, že isoliquiritigenin může inhibovat produkci IL-6 a TNF-a indukovanou lipidovou A částí LPS v makrofázích RAW264.7 a zmírnit tvorbu komplexu LPS-TLR4/MD-2. Kromě toho může ISL indukovat apoptózu buněk HepG2 prostřednictvím signálních drah MAPK, STAT3 a NF-kB zprostředkovaných ROS.11 Experimentální důkazy také ukázaly, že ISL indukuje vnitřní aktivaci zprostředkovanou ROS a aktivuje mechanismus mitochondriální-cytochrom c-cystein proteázy apoptózy PC-12 buněk. Stojí za zmínku, že ISL se často používá jako doplněk stravy pro ženy.12 Nedávné studie ukázaly, že ISL má významný protizánětlivý účinek na AKI, ale konkrétní mechanismus účinku je stále nejasný.

Předchozí výzkum našeho týmu zjistil, že Mincle, makrofágy indukovaný lektin typu C, je transmembránový receptor pro rozpoznávání vzorců zapojený do zánětu ledvin,13 jehož prostřednictvím jsme testovali formylpeptidové receptory 2 (FPR2), které mají určitý vztah s Minclem. databáze GEO. Jeho role u akutního onemocnění ledvin však nebyla ověřena. FPR2 je protein kódující gen, který patří do rodiny receptorů spřažených s G proteinem a obsahuje 351 aminokyselinových zbytků.14,15 Jsou to 7- transmembránové receptory spřažené s G proteinem, které mohou zprostředkovat imunitní regulaci, sekreci zánětlivých faktorů, buněčná chemotaxe a buněčná adheze, které úzce souvisejí s výskytem a rozvojem různých onemocnění.16 Jeho homologie s FPR1 a FPR3 je až 69 procent a 83 procent. Subbuňky FPR2 jsou lokalizovány v buněčné membráně a jsou to víceprůchodové membránové proteiny. Jsou exprimovány hlavně v neutrofilech, eosinofilech, monocytech, epiteliálních buňkách, fibroblastech, gliových buňkách, mezangiálních buňkách atd., distribuovaných v různých orgánech, jako jsou plíce, slezina a játra. Je pozoruhodné, že FPR2 je hojně exprimován v renálním intersticiu,17 kde sídlí zánětlivé buňky. Hlavní funkcí FPR2 je kombinovat určitá specializovaná média podporující rozklad (SPM) ke zprostředkování aktivity těchto metabolitů při potlačování a odstraňování zánětu. Role FPR2 v zánětu AKI a zda může být použita jako cíl pro lékovou intervenci však stále není známa.

V této studii jsme použili myší model AKI indukovaný nefrotoxickým lékem a cisplatinou a model zánětlivých buněk indukovaný LPS, abychom prozkoumali zlepšení účinku ISL na poranění a zánět ledvin u AKI, stejně jako klíčovou roli FPR2 při zánětu ledvin. a ISL léčba AKI. Tato studie poskytne nové směry pro pochopení mechanismu zánětlivého poškození a léčebných strategií pro AKI.

2. Materiály a metody

2.1. Drogy

Isoliquiritigenin (purity>98 procent) je isoflavonová sloučenina extrahovaná z kořene lékořice. Jeho molekulový vzorec je C15H12O4. V této studii byl isoliquiritigenin zakoupen od Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), rozpuštěný v 10% DMSO (ST038, Beyotime, Čína) a myším indukovaným cisplatinou byla intragastricky podána dávka 7,5 mg/kg a 30 mg. /kg, resp.

2.2. Izolace BMDM

Samci myší C57BL/6 ve věku 6 až 8 týdnů byli vybráni k izolaci buněk BMDM. Opatrně oddělte kost zadní nohy od stehenní kosti a odstraňte připojené svaly. Kosti rozemlejte v PBS hmoždířem, dokud se barva kostí nezmění z červené na bílou. Následně se shromáždí supernatant a filtruje se přes síto 70, následuje centrifugace při 1500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Erytrocyty byly rozbity ve filtrované kapalině s 10 - PBS, která byla poté filtrována na 40 mm buněčném sítku. Inkubujte získané buňky v 10 cm kultivační misce a indukujte 30% L929 supernatantem po dobu 7 dnů. Buňky BMDM byly stimulovány 100 ng/ml LPS pro konstrukci modelu zánětlivých buněk.

2.3. Knock-down a nadměrná exprese FPR2 v BMDM

FPR2 byl down-regulován transfekcí pomocí transfekčního činidla Zeta LifeAdvanced (AD600050, Zeta life, USA) a FPR2 siRNA na BMDM (sekvence FPR2 siRNA: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, 5'-AUGUAGUACAAU CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, Čína). Podobně byl pcDNA3.{12}}plasmid FPR2 (vytvořen Fenghui Biotech, Čína) transfekován do BMDM pomocí ZETA, aby došlo k nadměrné expresi FPR2 v buňkách.

2.4. Pokusy na zvířatech

Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle pokynů Etického výboru Southwest MedicalUniversity. 32 samců myší C57BL/6 bylo zakoupeno od ChengduDaShuo Animal Co., Ltd, kteří byli náhodně rozděleni do 4 skupin: falešná skupina, modelová skupina (skupina AKI indukovaná cisplatinou), skupina s nízkou dávkou ISL (7,5 mg/kg, skupina L), a skupina s vysokou dávkou (30 mg/kg, skupina H). Modelové skupině bylo první den injikováno 20 mg/kg cisplatiny (P4394, Sigma-Aldrich, USA), zatímco skupině s nízkou dávkou bylo podáváno 7,5 mg/kg ISL a skupině s vysokou dávkou 30 mg/kg ISL po dobu 3 dnů. . Po 3 dnech bylo z usmrcených myší odebráno sérum a ledviny.

2.5. Test funkce ledvin

Po odběru séra každé skupiny myší přesně dodržujte pokyny souprav pro detekci hladin sérového kreatininu (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Čína) a močovinového dusíku (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Čína).

2.6. Patologické barvení

H&E barvení: rutinní odstranění vosku a rehydratace řezu, barvení hematoxylinem po dobu 5 minut, oplach RO vodou, separace alkoholu 1% kyselinou chlorovodíkovou po dobu 2 s, oplach vodou z vodovodu, ponoření do 75% etanolu po dobu 2 s, 1% eosin rozpustný v alkoholu po dobu 30 s , opláchnutí vodou z vodovodu, 100% etanol Dehydratujte 1 min, vysušte, xylen transparentní po dobu 10 min, vysušte, zalepte neutrálním balzámovým montážním médiem (36313ES60, Yepsen, Čína).

Barvení PAS: Řezy byly umístěny do roztoku kyseliny jodisté ​​při teplotě místnosti na 5 až 8 minut, poté následovalo dvakrát opláchnutí RO vodou. Poté vložte tyto plátky do Schiffova činidla na 10 až 20 minut, oplachujte vodou z vodovodu po dobu 10 minut, obarvte hematoxylinem po dobu 1 až 2 minuty, dehydratujte a zprůhledněte ve 100% alkoholu, osušte, zalepte neutrálním balzámovým montážním médiem.

2.7. Imunoflfluorescence

Umístěte zmrazené tkáňové řezy do PBS, dvakrát promyjte, fixujte 10% formaldehydem po dobu 10 minut. Tkáň na řezech byla blokována 5% kozím sérem po dobu 30 minut, následovala inkubace s primární myší anti-myší FPR2 (1:200, sc-57141, Santa Cruz, USA) a potkaním anti-myším F4/80 protilátky (1:200, sc-52664, Santa Cruz, USA) při4 - C přes noc. Následující den řezy dvakrát promyjte PBS, inkubujte se sekundární protilátkou (1:200) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a obarvěte jádro pomocí DAPI. Snímky byly pořízeny systémem EVOS.

2.8. Elisa

Koncentrace IL-1b, IL-6, TNF-a v séru a buněčném supernatantu byly analyzovány pomocí souprav ELISA (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Čína) podle pokynů k soupravě.

2.9. RealTime-PCR

Celková RNA byla extrahována pomocí soupravy pro extrakci RNA (Tiangen, Čína) podle pokynů výrobce. Po reverzní transkripci extrahované RNA do cDNA, jejím přidání do 10ml reakčního systému k provedení PCR v reálném čase systémem Roche LightCycler 480 a reakční systém je následující: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 ml; cDNA templát, 1 ml; upstream primer (10 mM), 0,5 ml; downstream primer (10 mM), 0,5 ml; Voda bez nukleázy, 3 ml. Primery použité v tomto experimentu byly syntetizovány společností Sangon (Shanghai, Čína) a sekvence všech primerů jsou uvedeny v tabulce 1.

2.10. Western blot

RIPA lyzační pufr byl použit k extrakci proteinu z ledvinových tkání a BMDM buněk. Po rozpuštění proteinu v 10% SDS-PAGEgelu a přenesení na PVDF membránu, blokování membrány v 5% BSA po dobu 1 hodiny a promytí TBST 3x, následuje inkubace membrány s primárními protilátkami při 4 - C přes noc (připravená s 5 procenty BSA, 1:1000). Poté byly membrány inkubovány se sekundární protilátkou (peroxidázou konjugovaný kozí anti-myší IgG (ZB-2305, 1:3000), kozí anti-králičí IgG (ZB-2301, 1:3000)) při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Snímky byly zachyceny gelovým zobrazovacím systémem (BIORAD, USA). Intenzita šedé proužků byla vypočtena pomocí softwaru Image J.

2.11. Statistická analýza

Výsledky byly uvedeny jako průměr ± standardní odchylka. Analýza dat byla provedena jednosměrným testem ANOVA následovaným vícenásobným srovnáním s testem LSD pomocí softwaru SPSS 21.0. P < 0,05="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="" významné.="" každá="" skupina="" experimentů="" se="" opakuje="">

3. Výsledky

3.1. Isoliquiritigenin zlepšil poškození ledvin vyvolané cisplatinou a inhiboval zánět ledvin

Abychom prozkoumali renoprotektivní a protizánětlivé účinky isoliquiritigeninu u AKI, detekovali jsme hladiny sérového Cre a BUN každé skupiny, stejně jako expresi a sekreci zánětlivých cytokinů pomocí PCR a ELISA v reálném čase. Kromě toho byla renální patologie měřena barvením H&E a PAS. Výsledky ukázaly, že ve srovnání s normální skupinou byly hladiny sérového Cre a BUN v modelu AKI zvýšené, zatímco léčba 7,5 mg/kg nebo 30 mg/kg ISL významně snížila hladiny sérového Cre a BUN, mezi nimi , dávka 30 mg/kg má nejlepší terapeutický účinek (obr. 1A a B). Zejména 30 mg/kg ISL může zlepšit renální tubulární poškození podle hodnoceného procenta tubulární nekrózy (obr. 1C). Výsledky ELISA a PCR ukázaly, že sekrece IL-1b, IL-6 a TNF-a se po intervenci ISL (7,5 mg/kg a 30 mg/kg) snížila a exprese mRNA IL-1b, IL-6 a TNF-a byly také pozoruhodně sníženy podáním 30 mg/kg ISL (obr. 1DeI). Na druhé straně výsledky barvení H&E a PAS prokázaly, že ledviny ve skupině AKI vykazovaly těžké renální tubulární poškození, vylučování renálního epitelu, mezangiální buňky a mezangiální intersticiální hyperplazii a infiltraci zánětlivých buněk, překvapivě 30 mg/kg ISL může účinně zvrátit poškození ledvin u AKI (obr. 1J). Všechny výsledky ukázaly, že podávání 7,5 mg/kg a 30 mg/kg ISL může zlepšit poškození ledvin vyvolané cisplatinou a inhibovat zánět ledvin, přičemž nejlepší účinek má 30 mg/kg ISL.

3.2. Isoliquiritigenin snižoval expresi FPR2 v makrofázích myší AKI

Mnoho předchozích zpráv naznačovalo, že FPR2 hraje zásadní roli v imunitní odpovědi a onemocněních souvisejících se zánětem. Potenciální účinek FPR2 v ledvinách AKI však není definován. V této studii jsme provedli imunofluorescenci ke společnému umístění FPR2 a makrofágů (F4/80, výrobce makrofágů). Výsledky ukázaly, že makrofágy (zelené skvrny) byly objemově infiltrovány v ledvinách myší AKI, mezitím FPR2 (červené skvrny) byly umístěny společně s F4/80, což ilustruje, že FPR2 byl exprimován hlavně na makrofázích a hladina FPR2 byla významně zvýšená v ledvinách myší AKI (obr. 2A). Dále jsme detekovali expresi FPR2 mRNA a proteinů souvisejících se zánětem pomocí PCR v reálném čase a Western blotting v ledvinách a výsledky ukázaly, že 30 mg/kg ISL může účinně snížit hladinu mRNA a proteinu FPR2 v ledvinách. ledvin AKI myší ve srovnání se 7,5 mg/kg skupiny ISL (obr. 2B, G, H). Důležité je, že výsledky Western blotting ukázaly, že 30 mg/kg ISL také inhibovalo aktivaci p-65 a snížilo hladiny proteinů TNF-a, IL-6 a IL{{28} }b v ledvinách myší AKI (obr. 2CeF). Všechna výše uvedená data naznačují, že ISL zmírněný zánět ledvin u AKI myší může souviset se snížením exprese FPR2 v makrofázích.

3.3. Isoliquiritigenin potlačil expresi a sekreci FPR2 a zánětlivých cytokinů v LPS-indukovaných BMDM buňkách

Abychom dále detekovali účinky ISL na buňky BMDM indukované LPS, zkoumali jsme hladinu mRNA FPR2, expresi a sekreci zánětlivých cytokinů v buňkách BMDM indukovaných LPS po podání ISL pomocí PCR v reálném čase a ELISA. Výsledky ukázaly, že ISL snížila hladinu mRNA FPR2, IL-1b, IL-6 a TNF-a (obr. 3AeD), stejně jako sekreci IL-1b , IL-6 a TNF-a v buněčném supernatantu v buňkách BMDM indukovaných LPS (obr. 3EeG). Výše uvedené výsledky naznačují, že léčba ISL s koncentrací 40 mM silně inhibovala zánět v buňkách BMDM indukovaných LPS.

3.4. Isoliquiritigenin downreguloval hladiny proteinů FPR2 a zánětlivých cytokinů v buňkách BMDM indukovaných LPS

Také jsme detekovali proteinové hladiny FPR2 a zánětlivých cytokinů v LPS-indukovaných BMDM buňkách po podání ISL pomocí western blotu. Data ukázala, že ve srovnání s kontrolní skupinou byly hladiny proteinů FPR2, p-p65, IL-6 a TNF-a významně zvýšeny v buňkách BMDM indukovaných LPS a silně sníženy při podávání 40 mM ISL ( Obr. 4AeE). Tyto výsledky dále ilustrují, že ISL může potlačit aktivaci NF-kB a snížit hladinu proteinů zánětlivých cytokinů v buňkách BMDM indukovaných LPS.

3.5. Inhibice FPR2 potlačila LPS-indukovaný zánět v BMDM buňkách

Abychom prozkoumali roli FPR2 při zánětu makrofágů, použili jsme siRNA ke snížení FPR2 v buňkách BMDM. Výsledky ukázaly, že transfekce siRNA může významně inhibovat expresi FPR2 v LPS-indukovaném makrofágu (obr. 5A) a účinně snížit expresi IL-1b a TNF-a (obr. 5B a C). Kromě toho výsledky western blotu prokázaly, že po transfekci siRNA byla hladina proteinu FPR2 významně inhibována, bez ohledu na to, zda byla stimulována LPS (obr. 5D a E). Je pozoruhodné, že snížení FPR2 významně snížilo hladiny proteinů zánětlivých cytokinů a inhibovalo aktivitu NF-kB signalizace (obr. 5FeK), což ukazuje, že FPR2 hraje důležitou roli při podpoře zánětlivé reakce v makrofázích. Také může být klíčovým cílem ISL inhibovat zánět makrofágů.

3.6. Nadměrná exprese FPR2 působila proti protizánětlivému účinku isoliquiritigeninu v buňkách BMDM indukovaných LPS

Abychom určili, že ISL potlačuje zánět v AKI prostřednictvím inhibice FPR2 v makrofágu, použili jsme plazmid s nadměrnou expresí FPR2 k up-regulaci exprese FPR2 v zánětlivých buňkách BMDM ošetřených ISL. Jak ukazuje obr. 6, hladina proteinu a mRNA FPR2 byla významně zvýšena v pcDNA3.1- Skupina transfekovaná FPR2 (obr. 6A, B, G) a nadměrná exprese FPR2 účinně zrušila inhibiční účinek 40 mM ISL na aktivaci p65 a hladiny proteinu IL-1b, IL-6 a TNF-a v buňkách BMDM indukovaných LPS (obr. 6CeF). Podobně zvýšená regulace FPR2 odstranila supresivní účinek 40 mM ISL na expresi a sekreci zánětlivých cytokinů v buňkách BMDM indukovaných LPS, jako jsou IL-1b, IL-6 a TNF-a (Obr. 6HeM), což naznačuje, že ISL snižuje zánět v buňkách BMDM indukovaných LPS inhibicí FPR2.

4. Diskuze

Akutní poškození ledvin je jedním z běžných klinických onemocnění. Obvykle vede v krátké době k narušení imunitních funkcí pacientů. V případech traumatických ztrát krve, poškození orgánů, šoku jsou ledviny nejcitlivějším orgánem a jsou náchylné k rozvoji akutního poranění.18e20 Četné studie potvrdily, že zánět hraje klíčovou roli ve vývoji AKI, což bylo považováno za jako potenciální intervenční cíl pro léčbu AKI. V posledních letech čínská medicína udělala obrovský pokrok v intervenci proti zánětu, včetně kurkuminu, kvercetinu, naringeninu a dalších monomerů. Iso-liquiritigenin je flavonoidní sloučenina, která má mnoho biologických aktivit, jako jsou protizánětlivé účinky, účinky proti volným radikálům, protinádorové a další účinky.21 Předchozí studie zjistily, že ISL inhibuje apoptózu, zánět a produkci extracelulární matrix u angiotensinu. II-indukované HK-2 buňky.22 Studie Wu Yangpinga ukázaly, že ISL může down-regulovat IL-6 a IL-8 inhibicí aktivity NF-kB v modelu psoriázy, což naznačuje ISL může být kandidátem na léčbu psoriázy a dalších autoimunitních zánětlivých onemocnění.23 Na druhé straně nedávná studie prokázala, že ISL by mohla zmírnit septické AKI potlačením translokace NF-kB p65 a inhibicí zánětlivých reakcí.24 V této studii jsme zjistili, že ISL může účinně zlepšit funkci ledvin u AKI myší indukovaných cisplatinou, snížit poškození ledvin a inhibovat zánět ledvin. Přesný mechanismus inhibice zánětu ISL však není jasný.

FPR2 patří do rodiny chemotaktických receptorů a je to receptor spřažený s G proteinem 7krát transmembránový. Předchozí studie zjistily, že FPR2 se podílí na řadě fyziologických a patologických procesů, včetně obranných reakcí, zánětu, neurodegenerativních onemocnění, nádorů, poruch souvisejících s metabolismem glukózy a lipidů.25,26 FPR2 může být upregulován lipopolysacharidy, různými zánětlivými faktory, a prostaglandin E2 v zánětlivém procesu, který může hrát protizánětlivou a prozánětlivou roli.27,28 Různé účinky FPR2 na zánět závisí na prostředí a ligandech, které aktivují různé signální dráhy.29 V této studii jsme zjistili, že FPR2 je exprimován hlavně v makrofázích v renálním intersticiu a je vysoce exprimován v ledvinách AKI myší indukovaných cisplatinou, což naznačuje, že FPR2 v makrofázích se může podílet na zánětlivé odpovědi makrofágů v ledvinách AKI. Stále více důkazů potvrdilo, že velké množství makrofágů infiltrovalo do ledvin během několika hodin po výskytu AKI a zhoršilo poškození ledvin reakcí na zánět. být důležitým směrem ke zlepšení AKI, a zda je FPR2 zapojen do tohoto procesu, není známo.

Naše experimentální výsledky ukázaly, že léčba nízkými a vysokými dávkami ISL u AKI myší indukovaných cisplatinou může nejen zlepšit renální strukturu a funkci, ale také snížit hladinu zánětlivých cytokinů. Kromě toho může ISL účinně snížit hladinu proteinu FPR2 a aktivitu p65. Protože FPR2 je exprimován hlavně v makrofázích, naznačuje to, že ISL může zlepšit zánět ledvin inhibicí FPR2 v makrofázích. Vzhledem k důležité roli infiltrovaného makrofágu při zánětu ledvin jsme poté extrahovali primární makrofágy odvozené z kostní dřeně pro in vitro detekci zlepšujícího účinku ISL na zánět makrofágů a potenciální mechanismus. Naše výsledky ukázaly, že ISL může významně inhibovat LPS-indukovaný zánět makrofágů a down-regulovat expresi a sekreci zánětlivých faktorů IL-1b, IL-6 a TNF-a. Současně může ISL také snížit hladinu proteinu zánětlivých molekul v makrofágu a inhibovat expresi mRNA a hladiny proteinu FPR2 stimulované LPS. Abychom ověřili klíčovou roli inhibice zánětu FPR2 pomocí ISL, použili jsme pcDNA3.{18}}plasmid FPR2 k nadměrné expresi FPR2 a zjistili jsme, že v zánětlivém makrofágu léčeném ISL nadměrná exprese FPR2 neutralizuje inhibiční účinek ISL na zánět, což ukazuje, že ISL down-regulovaný zánět makrofágů je způsoben hlavně inhibicí FPR2. Zejména jsme použili model AKI indukovaný cisplatinou in vivo a vybrali jsme model zánětlivých buněk indukovaných LPS in vitro. Ačkoli indukční činidla těchto dvou modelů nejsou konzistentní, tyto dvě metody jsou v současné době uznávány pro konstrukci modelů zánětu in vivo a in vitro, v daném pořadí. Vzhledem k tomu, že se tento výzkum zaměřuje na zánětlivé reakce, je možné použít tyto dvě metody v jedné studii.

Tato data prokázala, že ISL může účinně snižovat expresi zánětlivých faktorů in vivo a in vitro a lze jí dosáhnout inhibicí exprese FPR2. ISL tak může sloužit jako potenciální terapeutické léčivo pro AKI.

Poděkování

Tato práce byla podpořena společným projektem Luzhou – Southwest MedicalUniversity (2017LZXNYD-P01 a 2018LZXNYD-PT03), Southwest Medical University – Affiliated Traditional MedicineHospital Joint Project (2018XYLH-034), stavebním projektem klíčové laboratoře provincie Sichuan of Sichuan Medicine (2018#53), projekt vědy a technologie v Luzhou (2020-JYJ-56) a společný speciální grant Luzhou Municipal – Southwest Medical University pro zavádění talentů na vysoké úrovni (tým Lan Hui-Yao ).

Reference

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. Medikamentózní terapie a další faktory spojené s rozvojem akutního poškození ledvin u kriticky nemocných pacientů: průřezová studie.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub před tiskem 22. 8. 2018.

2. Sato Y, Yanagita M. Imunitní buňky a zánět u AKI do progrese CKD.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub před tiskem 30. 8. 2018.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangaswami J. Akutní poškození ledvin po transkatétrové náhradě aortální chlopně.Clin Cardiol. 2017;40(12):1357e1362. e-pub před tiskem 19. 12. 2017.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. Laktoferin přispívá k renoprotektivnímu účinku při akutním poškození ledvin a časné renální fibróze.Lékárnictví. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. Přehled role imunitních buněk při akutním poškození ledvin.Pediatr Nephrol. 2018;33(10):1629e1639. e-pub před tiskem 13.08.2017.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK a kol. Blokující inhibiční faktor migrace makrofágů chrání před akutním poškozením ledvin u myší vyvolaným cisplatinou.Mol Ther. 2018;26(10):2523e2532. e-pub před tiskem 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K, et al. Deplece makrofágů/monocytů klodronátem, ale nikoli difterický toxin, zlepšuje renální ischemické/reperfuzní poškození u myší.Kidney Int. 2012;82(8):928e933. e-pub před tiskem 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM a kol. Isoliquiritigenin inhibuje aterosklerózu blokováním exprese kanálu TRPC5.Kardiovaskulární terapeutika. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Isoliquiritigenin má antioxidační a protizánětlivé účinky prostřednictvím aktivace dráhy KEAP-1/Nrf2 a inhibice drah NF-kB a NLRP3 u pleurisy vyvolané karagenanem.Jídlo& funkce. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Isoliquiritigenin indukuje apoptózu T24 buněk lidského karcinomu močového měchýře prostřednictvím mechanismu nezávislého na cyklinu závislé kináze.Onkologické dopisy. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR, Luo YH, Piao XJ a kol. Mechanismy, které jsou základem apoptózy indukované isoliquiritigeninem a zastavením buněčného cyklu prostřednictvím drah MAPK/STAT3/NF- kappaB zprostředkovaných ROS v buňkách lidského hepatocelulárního karcinomu.Drug DevRes. 2019;80(4):461e470. e-pub před tiskem 31. 1. 2019.

12. AH, CS, YY, a kol. Hodnocení estrogenní aktivity druhů lékořice ve srovnání s chmelem používaným v rostlinách pro symptomy menopauzy.PLoSJeden. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L, et al. Receptor pro rozpoznávání vzorů, Mincle, je nezbytný pro udržení fenotypu makrofága M1 při akutním zánětu ledvin.Kidney Int. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA, et al. Inhibice receptorů formylpeptidu zlepšuje výsledek u myšího modelu Alzheimerovy choroby.JNeurozánět. 2020;17(1):131. e-pub před tiskem 26. 4. 2020.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V, et al. Aktivace signalizace annexinu A1 v renálních fibroblastech má antifibrotické účinky.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub před tiskem 2015/09/04.

16. FC, MP, RA. Odlišné signální kaskády vyvolané různými agonisty receptoru 2 formylového peptidu (FPR2).Int J Mol Sci. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG a kol. Sloučenina odvozená od Ganodermy-A má inhibiční účinek prostřednictvím receptoru formylpeptidu 2.Front Pharmacol. 2020;11:337.

18. Wang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. Mitofágie při akutním poškození ledvin a opravě ledvin.buňky. 2020; 9(2). e-pub před tiskem 2020/02/07.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. Patofyziologie AKI k progresi CKD.Semin Nephrol. 2020;40(2):206e215. e-pub před tiskem 19. 4. 2020.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akutní poškození ledvin.Lanceta. 2019;394(10212): 1949e1964. e-pub před tiskem 30. 11. 2019.

21. PZ, HM J, JW Z, et al. Ochranný účinek isoliquiritigeninu proti poškození mozku u septických myší prostřednictvím atenuace NF-kB.vflamofarmakologie. 2019;27(4): 809e816.

22. DX, WH, ST Y, YS T. Isoliquiritigenin zmírnil hypertenzní poškození ledvin vyvolané Ang II potlačením zánětlivých cytokinů a apoptózy indukované oxidačním stresem prostřednictvím drah Nrf2 a NF-kB.Biochem BiophysRes Commun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG a kol. Isoliquiritigenin zabraňuje progresi symptomů podobných psoriáze inhibicí NF-kB a prozánětlivých cytokinů.J MolMed(Berl). 2016;94(2):195e206.