další informace:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomáš Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²a Elena Levtchenko^1,*

^{Část I: Renální a extrarenální projevy v modelu cystinózy dospělých zebřiček}

¹Laboratoř dětské nefrologie, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgie; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Ústav patologie, Leiden University Medical Center, 2300 RC Leiden, Nizozemsko; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Výzkumná skupina pro vývoj a regeneraci neuronových obvodů, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgie; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, Division of Animal and Human Health Engineering, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgie; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Molecular Neurobiology, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Belgie; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Klinika dětského lékařství, Laboratoř oddělení metabolické biochemie, Dětská nemocnice Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Řím, Itálie; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgie; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Klinika dětské nefrologie, Radboud University Medical Center, 6525 GA Nijmegen, Nizozemsko

^*Korespondence: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: plus 32-16-34-38-22

^† Tito autoři se na této práci podíleli stejnou měrou.

Abstraktní:Cystinózaje vzácné, nevyléčitelné, autozomálně recesivní onemocnění způsobené mutacemi v genu CTNS. Tento gen kóduje cystinózu lysozomálního cystinového transportéru, což vede k akumulaci lysozomálního cystinu ve všech buňkách těla, přičemž ledviny jsou prvními postiženými orgány. Současná léčba cysteaminem snižuje akumulaci cystinu, ale nevrací dysfunkci proximálních tubulů, glomerulární poškození nebo ztrátuledvinovéfunkce. V naší předchozí studii jsme vyvinuli model cystinózy zebrafish prostřednictvím nesmyslné mutace v genu CTNS a ukázali jsme, že larvy zebřiček rekapitulujíledvinafenotyp popsaný u lidí. V současné studii jsme charakterizovali dospěléhocystinózamodel zebrafish a vyhodnotil dlouhodobé účinky nemoci naledvinaa extrarenální orgánů prostřednictvím biochemických, histologických studií, studií fertility a lokomotorické aktivity. Zjistili jsme, že dospělýcystinózaZebřička má hromadění cystinu v různých orgánech, změněnou morfologii ledvin, zhoršenou pigmentaci kůže, sníženou plodnost, změněnou pohybovou aktivitu a oční anomálie. Celkově naše data naznačují, že dospělícystinózamodel zebrafish reprodukuje několik lidských fenotypů cystinózy a může být užitečný pro studium patofyziologie a dlouhodobých účinků nových terapií.

klíčová slova:ledvinachoroba;cystinóza; model zebrafish;ledvinovéa extrarenální manifestace; fenotypové rysy dospělých

1. Úvod

Cystinózaje autozomálně recesivní střádací porucha způsobená mutacemi v genu CTNS, který kóduje cystinózu lysozomálního cystinového kotransportéru protonu, přenášejícího cystin z lysozomálního lumen do cytosolu. Na onemocnění se podílí několik orgánů, jako jsou svaly, varlata, oči a mozek a mezi všemiledvinyjsou prvním a nejvážněji postiženým orgánem [1]. Nejčastější a nejzávažnější klinickou variantou je infantilní nefropatickácystinóza, ve kterém je prvním klinickým projevemledvinovéFanconiho syndrom, charakterizovaný poruchou proximálních tubulárních epiteliálních buněk

(PTE) reabsorpce vedoucí ke ztrátě aminokyselin, glukózy, nízkomolekulárních až středněmolekulárních proteinů a dalších metabolitů močí. Po poškození PTEC následuje progresivní glomerulární dysfunkce, a pokud se neléčí, vede ke konečnému stádiuledvinanemoc [1]. Současný terapeutický přístup sestává z cysteaminu, což je aminothiol poškozující cystin, který přerušuje disulfidický můstek cysteinu, což vede k tvorbě aminokyseliny cysteinu a smíšeného disulfidu cysteamin-cystein. Tato druhá molekula může přes transportér aminokyselin PQLC2[2] opustit sosomy. Nicméně léčba cysteaminem, přestože snižuje akumulaci cystinu v lysozomech, pouze oddaluje progresi onemocnění [3–5]. Proto další pochopení patogenezecystinózaa vývoj nových rapeuticoption jsou stále na programu výzkumu. Bylo vyvinuto několik zvířecích modelů za účelem rekapitulace fenotypu cystinózy [6,7]. Jedním z nejpoužívanějších modelů je myš Ctns−/− C57BL/6, u které se rozvine akumulace cystinu a mírná proximální tubulopatie. Nevykazuje však glomerulární poškození a byl zjištěn fenotyp závislý na genetickém pozadí [8].

K dnešnímu dni se modely zebrafish staly atraktivním nástrojem pro vyšetřování lidských nemocí díky několika výhodám, jako je jejich rychlý vývoj, vysoká plodnost, nižší náklady na údržbu a dostupnost snadno použitelných technologií pro úpravu genů [9]. V předchozí studii jsme prezentovali kongenní model larev zebřiček s homozygotní nesmyslnou mutací v exonu 8 genu ctns−/−, která vedla k funkční ztrátě cystinózy [10], vedoucí k akumulaci cystinu v celém těle, zvýšené deformace larev, opožděný vývoj aledvinapoškození. Dlouhodobé následky onemocnění u dospělých zebřiček však dosud nebyly studovány. V této studii jsme se snažili charakterizovatledvinovéa extrarenální projevy u modelu dospělých zebřičekcystinóza.

Klikněte na organickéCistanche pro onemocnění ledvin

2. Výsledky

2.1. Cystin se hromadí v Ctns−/− Zebrafish

Cystinózaje považována za multisystémovou poruchu vedoucí k akumulaci cystinu ve všech buňkách těla. V naší předchozí práci jsme zjistili, že cystinóza (ctns−/−) zebrafish vykazuje akumulaci cystinu počínaje larvální fází vývoje a v několika orgánech až do věku 8 měsíců [9]. Abychom vyhodnotili, zda náš model udržuje akumulaci cystinu v pozdějších fázích onemocnění, měřili jsme hladiny cystinu v celém těle,ledvina, varlata, oči, svaly a mozek u 18-měsíčních zebřiček ctns−/− ve srovnání se samci zebřiček divokého typu stejného věku. Zjistili jsme 54-násobné zvýšení obsahu cystinu v celém těle (obrázek 1A) a 146-násobné zvýšení v ledvinách (obrázek 1B) u zebřiček ctns−/− ve srovnání s divokými zebřičkami. Kromě toho jsme pozorovali rozsáhlou akumulaci cystinu ve varlatech, očích, svalech a mozku (obrázek 1C–F) u zebry ctns−/−.

2.2. Renální manifestace

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish Present PTEC Damage

Vzhledem k tomu,ledvinaje nejvážněji postiženým orgánem, vyšetřili jsme histologické charakteristiky ledvin pomocí barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) a periodickou kyselinou-Shiff (PAS). Zaznamenali jsme přítomnost zakaleného otoku, eozinofilních kapiček podobných hyalinům a cytoplazmatických vakuol v PTEC ctns-/- zebrafish (obrázek 2B, D), ale ne u divokého typu zebrafish (obrázek 2A, C). Je třeba poznamenat, že nebylo nalezeno žádné distální tubulární poškození. Krystaly cystinu byly dříve v PTEC pozorovány jako cytoplazmatické vakuoly pravoúhlého nebo polymorfního tvaru [11]. Proto jsme zkoumali, zda se tyto struktury vyskytují také v tubulech zebry. Našli jsme četné cytoplazmatické vakuoly v PTEC ctns-/- zebrafish pomocí barvení toluidinovou modří (obrázek 3B, D, označeno hvězdičkami). Kromě toho jsme našli vakuolární prostor s pravoúhlými nebo polymorfními tvary (obrázek 3B, D, označeno šipkami). Toto zjištění jsme potvrdili transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) (obrázek 3F). Tyto struktury nebyly přítomny v PTEC divokého typu zebrafish (obrázek 3A, C, E). Je zajímavé, že kromě přítomnosti vakuol polymorfního tvaru jsme pozorovali částečnou ztrátu kartáčového lemu v ultrastruktuře PTEC (obrázek 3F).

Obrázek 1. Obsah cystinu v homogenátech divokého typu a zebřiček ctns−/−. (A–F) Obsah cystinu v celém těle (A),ledvina(B), varlata (C), oči (D), sval (E) a mozek (F) u divokých a ctns−/− 18-měsíčních samců zebřičky. Koncentrace cystinu je vyjádřena jako nmol/mg proteinu. Každá tečka představuje jednu zebřičku, celkem tedy n=3 divokého typu a n=3 centů−/− 18-měsíčních samců zebřičky; nepárový t-test s Welchovou korekcí, dvoustranný: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Obrázek 2ledvinyhistologie u divokého typu a zebry ctns−/−. (A, B) Reprezentativní obrázkyledvinovétubuly divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíční zebřičky. Podrobnosti o proximálních tubulech s eozinofilními kapičkami podobnými hyalinům (černé šipky) a cytoplazmatickými vakuolami (*). H&E barvení. Stupnice měřítka představují 50 µm. (C,D) Reprezentativní snímky PAS barvení ledvinových tubulů divokého typu (C) a ctns−/− (D) 18-měsíčních zebřiček. Podrobnosti o proximálních tubulech s hyalinními kapičkami (černé šipky) a cytoplazmatickými vakuolami (*). PAS barvení. Stupnice měřítka představují 50 µm. PT: proximální tubulus; DT: distální tubulus.

Obrázek 3ledvinycystinové krystaly v PTEC divokého typu a ctns−/− zebrafish PTEC. (A,B) Reprezentativní snímky obarvené toluidinou modříledvinovéproximální tubuly u divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíčních zebřiček. Stupnice měřítka představují 50 µm. (C,D) Obrázky 3C, D ukazují větší zvětšení obrázku 3A,B. Podrobnosti o renálních proximálních tubulech s cytoplazmatickými vakuolami ((D); *), pravoúhlými a polymorfními vakuolárními prostory ((D); černé šipky). (E, F) Reprezentativní TEM snímky renálního proximálního tubulu divokého typu (E) a ctns−/− 18-měsíční zebřičky (F). (F) V renálním proximálním tubulu zebrafish ctns−/− byla pozorována částečná ztráta proximálních tubulů kartáčových bordů (PB) a akumulace pravoúhlých a polymorfních vakuol (*). Pohled s velkým zvětšením na obdélník v pravém dolním rohu ukazuje polymorfní vakuoly a velkou vakuolu s rovnými segmenty okraje membrány (přímka). Stupnice měřítka představují 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish Show Glomerulární hypertrofie

Vzhledem k tomu, že glomerulární poškození obvykle následuje po PTEC lézích, hodnotili jsme glomerulární histologii ctns-/- zebrafish a pozorovali jsme, že ctns-/- samci zebřiček vykazovali významné zvětšení Bowmanova pouzdra (obrázek 4B, E) a glomerulárních chomáčů (obrázek 4B, F4B), ale ne Bowmanův prostor , G) ve srovnání se samcem zebřice divokého typu (obrázek 4A, E–G). Totéž bylo potvrzeno pro glomerulární rtuť u lebek nesoucích mutaci ctns-/- (obrázek 4F) a podobný trend byl pozorován při měření Bowmanova prostoru a Bowmanovy kapsle (obrázek 4E, G). Nebyla pozorována žádná proliferace mesangiálních buněk nebo glomeruloskleróza. Na snímcích TEM jsme nepozorovali změny na glomerulární bazální membráně, vymazání výběžku podocytů nebo abnormálně fenestrované endoteliální buňky v glomerulech ctns-/- zebrafish (obrázek 4D) ve srovnání s divokým typem zebřice (obrázek 4C).

Obrázek 4. Glomerulární morfologie u divokého typu a u zebřiček ctns−/−. (A, B) Reprezentativní snímky glomerulu divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíční zebřičky. PAS barvení. Stupnice měřítka představují 50 µm. (C,D) Reprezentativní TEM snímky glomerulu divokého typu (ctns−/− (D) zebrafish. Stupnice představují 1 µm. (E–G) Kvantifikace povrchových ploch Bowmanova pouzdra (E), glomerulární chomáč (F) a Bowmanův prostor (G) divokého typu a zebřičky u obou pohlaví.

2.2.3. Ctns−/− Zebrafish zobrazuje zvýšenou apoptózu na úrovni PTEC

Dále jsme zjišťovali, zdacystinózaspustil buněčnou smrt v našem modelu zebrafish [10,12]. Provedli jsme imunobarvení štěpenou kaspázou-3 vledvinovétkání divokého typu a zebřiček ctns-/- a pozorovali jsme signifikantní zvýšení hladin štěpeného proteinu kaspázy3 v PTEC zebřiček ctns-/- (obrázek 5B, D, G) ve srovnání s divokým typem zebry (obrázek 5A, C, G) u obou pohlaví. Exprese štěpené kaspázy-3 byla přítomna hlavně v buňkách vykazujících polymorfní cytoplazmatické vakuoly (obrázek 5B, D). Žádná exprese štěpené kaspázy-3 nebyla přítomna v glomerulech, a to jak u divokého typu, tak u zebra ctns−/− (obrázek 5E, F).

Obrázek 5. Zvýšená apoptóza u PTEC s vakuolami u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativní snímky štěpené kaspázy-3 imunobarvení tubulů divokého typu (A) a ctns− staré zebřičky. Úsečky měřítka představují 50 µm. (C,D) Spodní panely ukazují větší zvětšení orámovaných oblastí v horních panelech. Podrobnosti o PTEC s cytoplazmatickými vakuolami (*). Úsečky měřítka představují 50 µm. (E, F) Reprezentativní snímky imunobarvení štěpené kaspázy-3 glomerulu divokého typu (E) a ctns−/− (F) 18-měsíční zebřičky. Stupnice měřítka představují 50 µm. (G) Kvantifikace oblasti pozitivní na tubulární kaspázu{10}} u divokého typu a zebřičky u obou pohlaví. Každá tečka představuje jednu zebřičku, celkem tedy n=3 divokých a ctns−/− 18-měsíčních zebřiček. Dvoucestná ANOVA s Fisherovým testem nejmenšího významného rozdílu (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" p=""><>

2.3. Extra renální projevy

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish vykazují charakteristický hypopigmentovaný tečkovaný vzor kůže

Cystinózapacienti často vykazují předčasné stárnutí kůže, hypopigmentaci a blond vlasy [1,13]. Zajímavé je, že jsme pozorovali hypopigmentovaný tečkovaný vzor kůže zebry ctns-/-, zatímco ryby divokého typu vykazovaly typický černý pruhovaný vzor. Fenotyp je přítomen u obou pohlaví během celého jejich života (obrázek 6A, B). Abychom prozkoumali rozdíl v pigmentaci, provedli jsme barvení PAS na kůži zebry a zjistili jsme, že ctns-/- zebrafish vykazují změněnou distribuci vrstvy melaninu v epidermis, což způsobilo vzor světlých skvrn (obrázek 6C, D).

Obrázek 6. Hypopigmentovaná skvrnitá kůže u zebřiček ctns−/−. (A, B) Reprezentativní obrázky divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíční zebřičky. Lišty měřítka představují 0,5 cm. Černé šipky označují různé pruhované vzory kůže. (C,D) PAS-obarvené obrázky epidermis divokého typu (C) a ctns−/− (D) 18-měsíčních zebrafish. Černé šipky zvýrazňují vrstvu melaninu. Přerušení v melaninové vrstvě je přítomno u ctns−/− (D), zatímco u divokého typu zebrafish (C) chybí. Stupnice měřítka představují 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Zebřička ukazuje spermatogenní cysty obohacené o spermie

Cystinózaje známo, že ovlivňuje funkce varlat, což vede k azoospermii a neplodnosti u mužských pacientů [14–16]. Původ azoospermie je stále nejasný, ačkoli se ukázalo, že spermatogeneze je na úrovni varlat intaktní. Na rozdíl od mužských pacientů jsou ženy s cystinózou fertilní [17]. V našem modelu zebrafish jsou samice i samci zebřiček ctns−/− plodní. Abychom zjistili, zda mutace ctns−/− ovlivňuje anatomii varlete, provedli jsme barvení PAS a zjistili jsme zvýšenou akumulaci spermií ve spermatogenních cystách u ctns−/− zebrafish

Obrázek 7. Spermatogenní cysty obohacené o spermie u zebřiček ctns−/−. (A, B) Reprezentativní H&E barvené obrázky varlat divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíčních zebřiček. Tmavě modré a zaoblené zbarvení představuje spermie nahromaděné ve spermatogenních cystách (označeno hvězdičkami). Stupnice měřítka představují 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Samice zebřičky ukazují sníženou produkci vajíček

Abychom prozkoumali funkčnost reprodukčního systému, měřili jsme produkci vajíček a procento oplozených vajíček jak u divokých zebřiček, tak u zebřiček ctns−/−. Zjistili jsme, že samice ctns−/− vykazují sníženou produkci vajíček (obrázek 8A) a snížené procento oplodněných vajíček (obrázek 8B) ve srovnání se samicemi divokého typu.

Obrázek 8. Produkce vajíček a procento oplozených vajíček u zebřiček divokého typu a ctns−/−. (A) Produkce vajec byla měřena jako celkový počet jiker u divokého typu a ctns−/− zebřičky 18-měsíční zebřičky. Míra produkce jiker je 1,941 vysoká u divokých zebřiček ve srovnání s ctns−/− 18měsíčními zebřičkami (poměr míry=1,941); 95 procent CI (dolní hranice=1.165, horní hranice=3.234); Poissonova regresní analýza; p=0.011. (B) Procento oplozených vajíček bylo měřeno na celkovém počtu vajíček. Pravděpodobnost oplodněných vajíček je u zebřiček divokého typu 3,504 vysoká ve srovnání s ctns−/− 18-měsíců starých zebřiček (poměr šancí=3 0,504); 95 procent CI (dolní hranice=2.005, horní hranice=6.124); Logistická regresní analýza; p < 0,001;="" n/a:="" nepoužije="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish zobrazuje sníženou pohybovou aktivitu

Vzhledem k tomu, že úbytek svalů a slabost byly diagnostikovány vcystinózapacientů, obecně od druhé dekády života [1,18], jsme hodnotili lokomotorickou aktivitu v našem modelu zebřičky. Zjistili jsme, že zebřičky ctns−/− obou pohlaví vykazovaly sníženou lokomotorickou aktivitu ve srovnání s divokými zebřičkami, což naznačuje zhoršenou svalovou funkci (obrázek 9). Histologická analýza tkáně kosterního svalstva však neodhalila zjevné abnormality u zebřiček ctns−/−.