další informace:ali.ma@wecistanche.com

Část: II Renální a extrarenální projevy v modelu cystinózy dospělých zebřiček

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish má zvýšenou tloušťku rohovky

Cystinózapostihuje oči, což vede k akumulaci cystinu v několika tkáních, jako je duhovka, spojivka a retinální epitel, avšak rohovka je nejvíce postiženou částí kvůli akumulaci cystinu [19] a vykazuje zvýšenou tloušťku [20]. Pomocí H&E barvení jsme zaznamenali, že ctns-/-zebrafish vykazovala zvýšenou tloušťku stromální vrstvy rohovky ve srovnání s divokým typem (obrázek 10A, B, E) zebrafish. Nezjistili jsme však zjevné abnormality v retinálním epitelu ctns-/-zebrafish (obrázek 10C, D).

Obrázek 9. Průměrná rychlost plavání u volně žijících a ctns−/−zebrafish. Průměrná rychlost je snížena u ctns−/−zebrafish ve srovnání s divokým typem u obou pohlaví. Průměrná rychlost plavání se měří v pixelech za sekundu. Každá tečka představuje jednu zebřičku, celkem tedy n=6 divokého typu a n=6 ctns−/−18-měsíčních zebřiček. Dvoucestná ANOVA s Fisherovým testem nejmenšího signifikantního rozdílu (PLSD): ** p <>

Obrázek 10. Histologie oka u divokých a ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativní snímky rohovky divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-měsíční zebřičky. Stromální vrstva rohovky (černé šipky a černé čáry). H&E barvení. Stupnice měřítka představují 50 µm. (C,D) Reprezentativní snímky sítnice divokého typu (A) a zebřičky ctns−/− (B). H&E barvení. Stupnice měřítka představují 50 µm. (E) Relativní kvantifikace tloušťky stromální vrstvy rohovky. Každá tečka představuje jeden údaj o tloušťce stromální vrstvy rohovky. Nepárový t-test s Welchovou korekcí, dvoustranný: * p <>

2.3.6. Další Ctns−/− fenotypy zebrafish

Kromě výše uvedených fenotypů jsme provedli histologickou analýzu mozku a vaječníků bez zjištění rozdílů mezi zebřičkou divokou a divokou. Kromě toho jsme hodnotili tělesnou délku a hmotnost zebrafish ctns-/-a divokého typu ve věku 18 měsíců a zjistili jsme zvýšenou tělesnou hmotnost inctns-/-zebrafish, zatímco jsme zjistili zvýšenou délku těla u ctns-/-zebrafish obou pohlaví ve srovnání s divokým typem (doplňkový obrázek S1).

3. Diskuse

Během posledních desetiletí,cystinózase z smrtelného onemocnění dětského věku přeměnilo na léčitelnou metabolickou poruchu, se kterou mohou pacienti přežít do dospělosti a dosáhnout pokročilého věku [21,22]. Delší přežití pacientů odhalilo nové fenotypy onemocnění a vyvolalo nové otázky týkající se patogeneze a dlouhodobých účinků terapií. V tomto ohledu se studium dospělých zvířecích modelů cystinózy stává stále aktuálnějším.

V současné studii jsme zkoumali renální a extrarenální projevy cystinózy u modelu dospělého zebřice ve věku 18 měsíců, což odpovídá lidskému věku 40–50 let [23,24]. Nejprve jsme potvrdili, že model zebřiček ctns−/− dospělých představuje akumulaci cystinu v celém těle a v různých orgánech. Vledvinana histologické úrovni jsme pozorovali známky poškození PTEC odrážející se v přítomnosti četných eozinofilních kapének podobných hyalinům, cytoplazmatických vakuol a částečné ztráty kartáčkových lemů. Dále se u ctns−/−samců zebry vyvinula glomerulární hypertrofie. Nakonec jsme ukázali, že exprese štěpené kaspázy 3 byla zvýšena v renálním PTEC ctns-/-zebrafish, což naznačuje, že apoptóza se podílí na patogenezi nefropatické cystinózy u zebrafish. Od té dobycystinózapacienti jsou přítomni i extrarenálně V našem modelu zebry jsme zkoumali účinek mutace ctns−/− v jiných orgánech. Je zajímavé, že jsme zjistili, že mutace ctns−/− způsobila poškození anatomie kůže a ovlivnila plodnost, pohybovou aktivitu a oči.

Lysozomy jsou místa intracelulárního trávení a jsou považovány za životně důležité koordinátory buněčného metabolismu [25]. Klíčovým rysem je lysozomální střádavá nemoccystinózaje akumulace lysozomálního cystinu [26,27]. Zajímavé je, že jsme zjistili 54-násobný nárůst cystinu v celém těle18-měsíců cystinózy zebřičky ve srovnání s divokým typem, zatímco v naší předchozí studii [10] vykazovaly larvy zebřičky cystinózy 6 dní po oplodnění 13-násobný nárůst. Celkově tato data naznačují, že cystin se během života hromadí u zebřiček cystinózy. Kapalinová chromatografie a analýza hmotnostní spektrometrie potvrdily, že mezi všemi orgányledvinasare preferované místo pro akumulaci cystinu. Lysozomální otok a hyalinní eozinofilní kapénky uvnitř lysozomů byly popsány u cystinem nabitých PTEC [28,29] a v lidských biopsiích se cystinové krystaly jeví jako polymorfní tvarové prostory v intersticiálních makrofázích a cytoplazmě PTEC [27]. V lidské tkáni je akumulace cystinu a krystalizace kumulativní proces probíhající během života. Krystaly cystinu nebyly detekovány u ctns-/-zebrafish v larválním stádiu [10], zatímco v našich pilotních experimentech jsme zjistili, že polymorfní tvar krystalů cystinu se objevuje ve věku 3 a 6 měsíců a jsou jasně viditelné ve věku 18-měsíců, což naznačuje postupné zhoršování účinků cystinózy vledvina.

Klikněte naCistanche účinky na onemocnění ledvin

Abychom vyhodnotili histologické změny glomerulů, měřili jsme povrchové plochy Bowmanova pouzdra, glomerulární chomáče a Bowmanův prostor ctns-/-zebrafish na řezech obarvených PAS. Zjistili jsme, že u ctns-/-zebrafish se vyvinula glomerulární hypertrofie, což naznačuje hyperfiltraci. Mírné glomerulární poškození pozorované u zebřiček lze přičíst regenerační schopnosti zebřičkyledvina, možnost přidávat nové nefrony a také opravovat stávající nefrony [30].

Kromě histologického poškození bylo prokázáno, že akumulace cystinu aktivuje proteinkinázu spouštějící apoptózu v PTEC[12]. Hodnotili jsme tedy expresi štěpené kaspázy-3 v PTEC a zjistili jsme, že ctns−/−zebrafish vykazovaly zvýšenou kaspázu-3 a jadernou fragmentaci. Přítomnost štěpené kaspázy-3 byla nalezena hlavně v buňkách, které akumulovaly cytoplazmatické vakuoly, což naznačuje, že apoptóza probíhá v poraněné PTEC. Dalším mechanismem, který může vysvětlit zvýšenou apoptózu, by mohla být přítomnost reaktivních forem kyslíku v důsledku sníženého glutathionu spojeného s akumulací cystinu [31]. Jsou však nutné další studie, aby bylo možné vyhodnotit, zda se tento mechanismus vyskytuje také u ctns−/−zebrafish.

Ačkoliledvinyjsou prvním a nejvážněji postiženým orgánem,cystinózaje multisystémové onemocnění, při kterém jsou postiženy různé orgány, jako je kůže, pohlavní žlázy, oči a svaly. Z literatury je známo, že pacienti s cystinózou často vykazují předčasné stárnutí kůže, blond vlasy a světlou barvu pleti [13]. Posledně jmenovaný fenotyp je způsoben zapojením cysteinového transportéru do regulace syntézy melaninu[32]a udržováním tmavší pigmentace prostřednictvím nově objeveného cysteinového transportéru MFSD12 [33]. Vzrušující je, že náš dospělý model ctns-/-zebrafish vykazoval hypopigmentovanou a skvrnitou kůži a vykazoval zhoršenou distribuci melaninu, která nebyla pozorována v larválním stádiu [10].

navíccystinózazpůsobuje neplodnost u mužů, zatímco o ženách je známo, že jsou plodné [14]. Nedávné údaje naznačují, že neplodnost by mohla být způsobena progresivní testikulární degenerací vedoucí ke změně kvality spermatu nebo kvůli obstrukci v nedefinované části mužského vylučovacího systému. Ucpané struktury mohou ovlivnit kvalitu spermatu, zejména v oblastech, kde mají kanálky velmi malý průměr, například retetestis[16]. Inzebrafish, spermie pro genicprocessis jsou velmi podobné savcům; jedním z hlavních rozdílů je však to, že spermatogeneze probíhá v cystách [34]. V naší studii jsme ve spermatogenní cystě ctns−/−zebrafish nalezli zvýšené množství spermií, nenašli jsme však známky testikulární degenerace. Popsaný fenotyp by tedy mohl naznačovat obstrukci na úrovni varlat, která vede k menšímu uvolňování spermií do prostředí, avšak k potvrzení této hypotézy jsou nutné další studie. Na funkční úrovni se zdá, že snížený počet vajíček a snížený počet oplozených vajíček odrážejí zhoršení plodnosti ctns-/-zebrafish.

Dalším klinickým projevemcystinóza, obecně postihující pacienty počínaje druhou dekádou života, je myopatie, charakterizovaná úbytkem svalů a slabostí [1]. Je zajímavé, že jsme zjistili, že ctns-/-dospělé zebřičky vykazují sníženou lokomotorickou aktivitu ve srovnání s kontrolou, což naznačuje zhoršenou svalovou funkci. Je třeba poznamenat, že tento fenotyp nebyl přítomen u larev [10], což naznačuje, že ovlivňuje ctns-/-zebrafish v pozdější fázi onemocnění. Navzdory tomu nebyly ve svalech detekovány žádné viditelné histologické rozdíly. Snížená lokomotorická aktivita může být způsobena mitochondriální dysfunkcí, kterou nebylo možné detekovat rutinními histologickými studiemi [35–37]. Komplexní charakterizace mitochondrií u zebřiček cystinózy proto vyžaduje další hodnocení.

Kromě výše uvedených fenotypů několik studií ukázalo, že pacienti s cystinózou také vykazují oční symptomy, jako je fotofobie a blefarospazmus [1], přičemž rohovka je jednou z nejvíce postižených částí oka, což má za následek akumulaci cystinových krystalů a jejich zvětšenou tloušťku [20]. O příčinách zvýšené tloušťky rohovky se však ví jen málo. Například bylo navrženo, že popsaný fenotyp je způsoben subklinickou dysfunkcí epiteliálních a/nebo endoteliálních buněk vedoucí kestromaledému[20]. V naší studii jsme zjistili, že zobrazení ctns-/-dospělých zebřiček je zvýšena tloušťka stromální vrstvy rohovky, což naznačuje, že náš model vykazuje známky dysfunkce rohovkycystinóza.

Cistanche proledvinafunkce

Jedna z hlavních mezer, kterou je třeba vyplnit pro komplexní pochopenícystinózaje nedostatek zvířecího modelu, který by plně rekapituloval lidskou nemoc. Bylo vyvinuto několik myších modelů, které vykazují akumulaci cystinu, ale nereprodukují kompletníledvinovéfenotyp [8,26]. Konkrétně myš C57BL/6 vykazovala akumulaci cystinu v několika orgánech, která se zvyšuje s věkem [8]. Navíc myší model C57BL/6 vykazuje proximální tubulární léze začínající ve věku 6 měsíců. Podobně se v našem modelu postupem času zhoršují proximální tubulární léze. Na glomerulární úrovni však myší model C57BL/6 vykazoval normální fenotyp, zatímco náš model dospělého zebrafish vykazuje glomerulární hypertrofii. Kromě toho myší model C57BL/6 nenapodobuje zhoršenou plodnost pozorovanou u lidí, zatímco model ctns-/-zebrafish představuje spermatogenní cysty obohacené o spermie a sníženou produkci vajíček. Na úrovni oka představuje jak myší[38], tak model ctns-/-zebrafish oční abnormality. Naopak na úrovni kůže tento myší model nevykazuje zhoršenou produkci melatoninu [8], která se u modelu dospělých zebřiček objevuje jako hypopigmentovaný kožní vzor. A konečně, na úrovni chování náš model ctns−/− zebrafish vykazuje sníženou lokomotorickou aktivitu, která může být způsobena poruchou mitochondriální funkce nebo může být způsobena sekundárním účinkem zvýšené hmotnosticystinózazebrafish. Celkově se zdá, že náš model ctns−/− zebrafish lépe rekapituluje lidskou nemoc. Nedávno Shimizu et al. vytvořil novou kongenní mutaci Ctnsugl u kmene potkanů, který se prezentovalledvinovélézí a cystinových krystalů v lysozomechledvinakůra [7]. Bližší charakteristika modelu však zatím chybí. Proto existuje naléhavá potřeba vyvinout a charakterizovat nové funkční modely, které rekapitulují lidská onemocnění.

Na závěr jsme prokázali, že náš dospělý model zebrafish ctns-/- reprodukuje několik lidských fenotypů cystinové pískovny, což může být užitečné pro studium patogeneze onemocnění u dospělých a pro testování dlouhodobých účinků nových léků na úpravu ledvin a extra-ledvinovéprojevy.

4. Materiály a metody

4.1. Údržba a chov zebrafish

Se Zebrafish bylo manipulováno a udržováno v souladu s předpisy KU Leuven o dobrých životních podmínkách zvířat (etické schválení č. 142/2019). Pro tuto studii jsme zahrnuli ctns-/-zebrafish ve věku 18 měsíců a divokou kontrolu zebrafish u obou pohlaví. Podrobnosti o generování ctns−/−zebrafish byly popsány v naší předchozí studii [10].

4.2. Měření cystinu

Hladiny cystinu byly měřeny u zebřičky (samec divokého typu, n=3 a ctns−/−samci, n=3) a množství bylo vyjádřeno jako nmol/mg proteinů. Nejprve byly zebřičky obětovány ponořením do trikain methansulfonátu MS-222 (300 mg/l), poté byly vzorky tkáně sonikovány v přítomnosti 200 ul 5 mM N-ethylmaleimidu (NEM, Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) v Dulbeccově fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), pro maximálně 200 mg tkáně na každý lyzát. Následně bylo ke každému homogenátu přidáno 100 ul 12% kyseliny sulfosalicylové (SSA) a vzorky byly centrifugovány při 12,000g po dobu 10 minut, 4°C. Supernatanty obsahující cystin byly skladovány při -80 °C až do doby analýzy, zatímco pelety byly rozpuštěny přes noc při 4 °C v 300 ul 0,1 M NaOH a udržovány při -80 °C, dokud nebyl změřen protein pomocí soupravy Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Následně bylo množství (nmol) cystinu normalizováno na množství (mg) proteinu z každého vzorku. Dále se 50 µL supernatantu obsahujícího cystín naočkovalo 50 µL roztoku vnitřního standardu (Cystine d6) a vířilo po dobu 5 sekund; poté byla směs extrahována 200 ul acetonitrilu, vortexována po dobu 30 s a poté centrifugována při 16,000 g po dobu 9 minut. Kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrická analýza byly provedeny pomocí UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) vybaveného zdrojem ESI-JET-STREAM pracujícím v režimu kladných iontů (ESI plus). Software použitý pro ovládání tohoto zařízení a analýzu dat byl MassHunter (Work station Agilent Technologies, Barcelona, ​​Španělsko). Použitá separační kolona byla InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 um 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoxylin a eosin a barvení kyselinou periodickou-shiff

Zebřička (samice divokého typu, n=3; samci divokého typu, n=3; ctns−/−samice, n=3; ctns−/−samci, n=3) byly obětovány ponořením do trikain-methansulfonátu MS{6}} (300 mg/l), poté byla celá zebřička fixována ve 4% pufrovaném paraformaldehydu (4% PFA) při 4 °C po dobu 1 týdne . Po dvojnásobném promytí PBS byly zebřičky přeneseny do roztoku EDTA (100 mM, pH=8) pro odvápnění po dobu dalšího 1 týdne, po čemž následovalo zalití do parafínu. Tkáň zebry zalité v parafínu byla vyříznuta (tloušťka 4-µm) na Leicamikrotomu (LeicaBiosystems, Wetzlar, Německo). Řezy byly obarveny H&E a PAS podle standardních protokolů.

Pro histologické studie zebřiček (samice divokého typu, n=3actns−/−samice ryb, n=3) byly oči enukleovány a fixovány ve 4% PFA při pokojové teplotě po dobu 4 hodin. Následující zalití do média s optimální teplotou řezání (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japonsko) byly provedeny 10-µm kryosekce (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokio, Japonsko). Řezy byly obarveny H&E podle standardních protokolů. Snímky byly pořízeny mikroskopem Leica s jasným polem (Leica DM6, Wetzlar, Německo).

4.4. Imunohistochemie (barvení štěpenou kaspázou{2}})

Řezy s čerstvě nařezanou tkání zebry byly zbaveny parafinů a rehydratovány. Řezy byly podrobeny získání antigenu indukovaného teplem za použití 10 mM citrátového pufru (pH=6). Po zablokování 5% normálním kozím sérem (NGS) v dPBS byly řezy inkubovány s králičí anti-štěpenou kaspázou-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, ředění 1:200) a následně antikráličím -Envision, sekundární protilátka značená HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Jako negativní kontrola bylo použito normální králičí sérum. Jako chromogen byl použit diaminobenzidin (DAB, DAKO, Glostrup, Dánsko). Následně byly řezy kontrastně obarveny H&E, dehydratovány a upevněny.

Léčba onemocnění ledvin: Cistanche

4.5. Barvení toluidinovou modří a TEM

Zebrafishledvinovétkáně (samci zebrafish divokého typu, n=3 a ctns-/-samci zebrafish, n=3) byly sklizeny a fixovány v EM fixačním pufru (1,5 procenta glutaraldehydu/1 procenta paraformaldehydu) po dobu 24 hodin . Následně byly ledvinové tkáně dodatečně fixovány 2,5 % glutaraldehydem/1,2 % akroleinem ve fixačním pufru (0,1 mol/l kakodylátů, 0,1 mol/l sacharózy, pH 7,4) a 1 oxidu osmičelého a zalité do pryskyřice. Polotenké řezy (tloušťka 0.5-µm) byly obarveny toluidinovou modří. Ultratenké řezy byly obarveny uranylacetátem. Snímky byly shromážděny pomocí transmisní elektronové mikroskopie JEM-1200 EX (JEOL Ltd, Tokio, Japonsko) s různým zvětšením.

4.6. Digitální analýza obrazu

Obarvená sklíčka byla digitalizována pomocí Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Nizozemsko)

4.6.1. Analýza glomerulární hypertrofie

Pro analýzu glomerulární hypertrofie u zebřiček byly měřeny povrchové plochy (µm2) Bowmanova pouzdra, Bowmanova prostoru a glomerulárních chomáčů na sklíčkách barvených PAS. Všechny dostupné glomeruly na řez byly zahrnuty a měřeny pomocí softwaru ImageJ. Pro statistickou analýzu byl použit průměr měření z každé zebřičky.

4.6.2. Analýza výrazů štěpené kaspázy-3

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 procent pozitivního zbarvení). Pro statistickou analýzu byl použit průměr skóre z každé zebřičky.

4.6.3. Analýza tloušťky stroma rohovky

Tloušťka stromatu rohovky zebrafish (10x zvětšení) byla měřena ve stejných vzdálenostech od středu oka pomocí softwaru ImageJ na zebrafish. Pro každý snímek bylo provedeno n=7 měření na různých místech v očním řezu (centrální, střední, periferní) podél rohovky v intervalech 100 uM. Průměr měření byl použit pro statistickou analýzu.

4.7. Fertility Study

Plodnost byla hodnocena pářením samiček a samců zebřiček (samci divokého typu, n=4 a samice divokého typu, n=6 a ctns−/−samci ryb, n=4 a ctns−/−samice ryb, n=6) na třecím podnosu. Následujícího rána, hodinu po světle, byla odebrána embrya a byl zaznamenán celkový počet vyprodukovaných vajíček. Oplodněná vajíčka byla testována a spočítána od nefertilních pomocí světelné mikroskopie. Šlechtění bylo prováděno n=7krát jednou týdně po sobě. Dva experimenty, které vedly k žádné produkci vajec současně jak u divokého typu, tak u ctns-/-zebrafish byly vyloučeny.

4.8. Pohybová činnost

Zebřička (samice divokého typu, n=6; samci divokého typu, n=6; ctns−/−samice, n=6; ctns−/−samci, n=6) byly umístěny do běžných bytových jednotek a po adaptační době 5 minut byly filmovány po dobu 5 minut. Nahrávání videa bylo prováděno pomocí GoPro® HERO 7 umístěného na horní části nádrže, což nabízí pohled shora na plavající se ryby. Rozlišení a snímková frekvence byly nastaveny na 1080 p (1920 × 1080) a 30 snímků za sekundu. Videa byla analyzována pomocí idTracker.ai sledováním trajektorie, aby se během experimentu našly jednotlivé rybičky. Trajektorie byly následně analyzovány pomocí vlastního python kódu pro odvození průměrné lokomotorické rychlosti (pixel/s) v každé skupině [39].

Cistanche-renal

4.9. Měření tělesné hmotnosti a délky

Zebřičky byly usmrceny ponořením do 300 mg/Loftricainmethansulfonátu MS-222. Po zjištění nepřítomnosti odezvy na vnější podněty byly usmrcené zebřičky umístěny na papírový kapesník a vysušeny. Délka usmrcených zebřiček byla hodnocena pomocí posuvného měřítka, měřeného od špičky tlamy po ocasní stopku. Hmotnost usmrcených zebřiček byla hodnocena pomocí analytické váhy.

4.10. Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS (IBM, New York, NY, USA) a GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Data ze dvou skupin byla analyzována pomocí nepárového t-testu s Welchovou korekcí, dvoustranná. Data dvou kategoriálně nezávislých proměnných byla analyzována pomocí dvoucestné ANOVA s Fisherovým testem nejmenšího signifikantního rozdílu (PLSD). Rozdíly s p < 0,05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="">

4.11. Fertility Study

Pro srovnání rychlostí produkce jiker mezi divokým typem a ctns−/−zebrafish byla provedena Poissonova regresní analýza pomocí Generalized Estimating Equations s robustními standardními chybami, aby se vzala v úvahu korelace rychlostí s experimenty. Pro srovnání nabídky šancí byla použita vejce mezi divokým typem a ctns−/−zebrafish. Byla provedena logistická regresní analýza pomocí zobecněných odhadních rovnic s robustními standardními chybami, aby se zohlednila korelace šancí v rámci experimentů.

Doplňkové materiály: Následující materiály jsou k dispozici online na https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Autorské příspěvky: Konceptualizace, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodika, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; software SPB, JH, LDG, HT, TN; validace, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB a EL; formální analýza, SPB, JH, LDG, HT, TN; vyšetřování, LvdH, HJB, EL; zdroje, HJB a EL; správa dat, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; psaní—originální příprava návrhu SPB, JH; psaní – recenze a úpravy, LvdH, HJB, EL; vizualizace, LvdH, HJB, EL; dozor, PdW, LvdH, HJB, EL; administrace projektu, LvdH, HJB, EL; získání finančních prostředků, HJB, EL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování: Autoři by rádi uznali vnitřní fond od KULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), grant China Scholarship Council Grant pro JH (CSC n◦ 201508500109) a postdoktorské stipendium FWO pro LDG (12I3820N).

Prohlášení Institutional Review Board: Studie byla provedena v souladu s pokyny Helsinské deklarace a schválena Etickou komisí KU Leuven č. 142/2019. Poděkování: Rádi bychom poděkovali: Didieru Cagninimu za vyhodnocení histologie mozku jak u ctns-/-, tak u divokého typu zebrafish, KathleeenLambaerts, Frédéric Hendrickx a KimvanKelst za jejich neustálou podporu a pomoc ve vodním zařízení KU Leuven, Peter Neeskens za technickou podporu z TEM a Ron Wolterbeek pro statistickou analýzu.

Konflikty zájmů: Autoři prohlašují, že nejsou konflikty zájmů. Investoři neměli roli v návrhu studie; při shromažďování, analýzách nebo interpretaci dat; v psaní rukopisu, nebo v rozhodnutí o zveřejnění výsledků.

Reference

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinóza: Přehled. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; a kol. Heptahelický protein PQLC2 je lysozomální exportér kationtových aminokyselin, který je základem působení cysteaminu vcystinózaterapie. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Zlepšení prognózy nefropatické cystinózy. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Host, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; a kol. Léčba cysteaminem oddaluje progresi nefropatické cystinózy u pozdních adolescentů a dospělých. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Cysteamine therapy: Léčba cystinózy, nikoli léčba. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Prince Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. Molekulární základ cystinózy: Geografické rozložení, funkční důsledky mutací v genu CTNS a potenciál pro opravu. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Delece v genu Ctns způsobuje renální tubulární dysfunkci a akumulaci cystinu u LEA/Tohm potkanů. Mamm. Genom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Renální fenotypcystinózamyší model závisí na genetickém pozadí. Nephrol. Vytáčení. Transplantace 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GenetickýRenálníNemoci: Vznikající role modelů zebřiček. Buňky 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Cystinóza (ctns)zebrafish mutanty vykazují pronefrické glomerulární a tubulární dysfunkce. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco,MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAtlas of RenalPathology:Cystinóza. Dopoledne. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovič, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Zvýšená apoptóza v cystinotických fibroblastech aledvinovéepiteliální buňky proximálního tubulu jsou výsledkem cysteinylace proteinkinázy C delta. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; a kol. Zvýšené přirozené stárnutí kůže u nefropatické cystinózy hodnocené optickou koherentní tomografií s vysokým rozlišením. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Stav plodnosti u mužů s cystinózou léčených cysteaminem. Fertil. Sterilní. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN První úspěšné početí vyvolané mužským pacientem s cystinózou. JIMD rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Hus, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Testikulární funkce u mužů s infantilní nefropatickou cystinózou. Hučení. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Těhotenství u žen s cystinózou. Clin. Ledviny J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopatická intrakraniální hypertenze u cystinózy. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Potenciální role stromálního kolagenu při krystalizaci cystinu u pacientů s cystinózou. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Tloušťka rohovky u nefropatické cystinózy. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665-668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterová, G.; Gahl, WA Cystinóza: Vývoj léčitelného onemocnění. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Účinky dlouhodobé léčby cysteaminem u pacientů scystinóza. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) jako model pro studium stárnutí a cvičení: Fyzické schopnosti a trénovatelnost se s věkem snižují. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Délka života a senescentní fenotypy u dvou kmenů zebrafish (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Biogeneze lysozomů a proteiny lysozomální membrány: Obchodování se snoubí s funkcí. Nat. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogát, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; a kol. Intralysozomální akumulace cystinu u myší postrádajících cystinózu, protein defektní u cystinózy. Mol. Buňka. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dediferenciace a aberace endolysozomálního kompartmentu charakterizují časné stadium nefropatické cystinózy. Hučení. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Některé napomáhají histologickému rozpoznání hyalinní kapénkové nefropatie v devadesátidenních studiích toxicity. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Intracelulární distribuce cystinu v cystinem naplněných proximálních tubulech. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Použití zebrafish ke studiu geneze podocytů během vývoje a regenerace ledvin. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Akumulace lysozomálního cystinu podporuje mitochondriální depolarizaci a indukci redox-senzitivních genů v buňkách proximálních tubulárních lidských ledvin. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; a kol. Cystinosin je melanosomální protein, který reguluje syntézu melaninu. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12 zprostředkovává import cysteinu do melanosomů a lysozomů. Příroda 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Histologické a stereologické hodnocení spermatogeneze zebrafish (Danio rerio) s důrazem na spermatogoniální generace. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Abnormální mitochondriální autofagie u nefropatiecystinóza. Autofagie 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Vliv atypické mitochondriální hladiny cyklického AMP u nefropatické cystinózy. Buňka. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Mitochondriální dynamika proximálních tubulárních epiteliálních buněk v nefropatické cystinóze. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; a kol. Oční anomálie ve zvířecím modelu cystinózy napodobují patogenezi onemocnění. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Sledování všech jedinců v malých nebo velkých kolektivech neoznačených zvířat. Nat. Metody 2019, 16, 179–182. [CrossRef]