Snížení renálního konzervačního/reperfuzního poškození řízenou hypertermií během ex vivo strojové perfuze

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Thomas Minor1,*,† a Charlotte von Horn1,†

Možný renoprotektivní účinek řízeného krátkého ošetření tepelným šokem během izolované ex vivo strojové perfuze dárcovských štěpů předreperfuzeby měly být zkoumány v primární studii in vitro.Prasečíledviny(n=14) byly získány po 20 minutách zastavení srdce dárce a vystaveny 20 hodinám statického chlazení v roztoku University of Wisconsin. Předreperfuze, ledvinybyli podrobeni 2 hodinové rekondiční strojové perfuzi s postupným zvyšováním perfuzní teploty až na 35 stupňů. V poloviněledviny(n=7), krátký hypertermický impuls (10 minut perfuze při 42 stupních) byl implementován v periodě strojové perfuze. Funkční zotavení štěpů bylo pozorováno po normotermické reperfuzi in vitro. Hypertermická léčba vedla k 50% zvýšení proteinu tepelného šoku (HSP) 70 a HSP 27 mRNA a byla doprovázena ~ 50% zlepšením tubulární reabsorpce sodíku a glukózy po reperfuzi ve srovnání s kontrolami. Kromě toho se renální ztráta aspartátaminotransferázy významně snížila na jednu třetinu kontrol, stejně jako ztráta proteinu močí, hodnocená poměrem albuminu ke kreatininu. Dospělo se k závěru, že léčba tepelným šokem ex vivo se zdá být snadno proveditelnou a slibnou možností, jak posílit mechanismy sebeobrany ledvin protireperfuzezraněnípo konzervaci, která si zaslouží další zkoumání v preklinických modelech.

Cistanche dr vita opcje velmi dobrý proledvinareperfuze

To nejlepší ze studia

JAKÉ JSOU AKTUÁLNÍ POZNATKY K TÉMATU?

✔ Indukce proteinů tepelného šoku (HSP) v místních tkáních je dobře známým obranným mechanismem v reakci na environmentální stresy. Upregulace těchto molekulárních chaperonů indukuje opravné mechanismy a toleranci vůči následným buněčnýmzranění. Klinickýledvinatransplantace stále více závisí na použití rozšířených kritérií dárcovských orgánů, které mají zvýšenou náchylnost k ischemii/reperfuzizranění. Ex vivo strojová perfuze štěpů okrajových orgánů poskytuje privilegovaný přístup ke štěpu a novou perspektivu pro snadnou a kontrolovanou aplikaci hypertermické stimulace na izolovaný orgán s cílem spustit reakce tepelného šoku a uvolnit signální dráhy, které příznivě ovlivňují následnou exacerbaci tkáně zranění a zlepšit seledvinovézotavení po transplantaci.

JAKOU OTÁZKU ZAMĚŘILA TATO STUDIE?

✔ Zkoumáme potenciální ochranný účinek krátkého hypertermického stimulu během ex vivo před transplantacíledvinaperfuzena funkční výsledek po postischemiireperfuze.

CO NÁM TATO STUDIE PŘIDÁVÁ K POZNÁNÍM?

✔ Tato studie naznačuje, že hypertermická léčba během ex vivo renální strojové perfuze působí jako možný nový nástroj pro zlepšení funkčních výsledků okrajově zachovanýchledvinypo postischemické reperfuzi. Data podporují relevantní roli HSP při redukci buněčné destrukce a zlepšení posttransplantační tubulární funkce ledvin.

JAK TO MŮŽE ZMĚNIT CLINICAL PHARMACOL

OGY NEBO TRANSLAČNÍ VĚDA?

✔ Přidání krátké řízené hypertermie k zavedenému normotermickému strojovému perfuznímu protokolu je snadno implementovatelná metoda pro klinické použití a může přispět ke zlepšení obnovy orgánů po transplantaci.

Klinická transplantace ledvin stále více spoléhá na použití rozšířených kritérií dárcovských orgánů, které byly před odběrem poškozeny nebo jsou pravděpodobně méně než optimální

kvalitní. Spolu se zvyšujícím se podílem těch orgánů, které po ischemickém uchování nesou zvýšenou náchylnost ke škodlivým spouštěčům,1,2 tkáňové změny

související s ischemickým/reperfuzním poškozením představují rostoucí hlavní problém při transplantaci ledvin, který spouští buněčnou dysfunkci po reperfuzi.

Indukce buněčných chaperonů a spouštění fenotypu ochranného signálu (např. podkritickým tepelným stresem) je dobře známým mechanismem ke snížení tkáňových změn souvisejících s pozdější stresovou situací a napadáním tkáňové homeostázy.3,4

Nástup izolované strojové perfuze jako alternativy nebo doplňku k ischemickému chladnému uchovávání štěpů od marginálního dárce otevřel novou perspektivu pro snadnou a kontrolovanou aplikaci hypertermické stimulace na izolovaný orgán za účelem spuštění reakce tepelného šoku a uvolnění signálu. dráhy, které příznivě ovlivňují následnou exacerbaci poškození tkáně a zlepšují rekonvalescenci ledvin po transplantaci.

Experimentálně bylo prokázáno, že předkondicionační účinek reakce tepelného šoku souvisí s dočasným supranormálním zvýšením cytorezistence5 a že působí prostřednictvím posílení sekundárních buněčných reparačních mechanismů.6 Nedávno bylo prokázáno, že indukce proteinů tepelného šoku (HSP) může poskytnout ochranu, i když je vyvolána brzy poté, co již došlo k původnímu poškození tkáně.7

Privilegovaný přístup k izolovanému orgánu vylučuje těžkopádné požadavky na zahřívání celého těla a způsobuje nepříznivé vedlejší účinky na organismus dárce nebo příjemce.

Proto byla tato studie zamýšlena jako pilotní výzkum pro zkoumání primárních důkazů hypertermické léčby během ex vivo renální strojové perfuze, aby působila jako možný nový nástroj pro zlepšení funkčního výsledku okrajově zachovaných ledvin po postischemické reperfuzi.

METODY

Všechny experimenty byly provedeny na ledvinách, které byly získány z mrtvých samic prasat German Landrace (věk: 10–12 týdnů, hmotnost: 25 a 30 kg). Byly dodržovány federální zákony týkající se ochrany zvířat a zásady péče o laboratorní zvířata (publikace National Institutes of Health (NIH) č. 85-23, revidovaná v roce 1985). Se zvířaty bylo zacházeno v souladu s pravidly a po schválení místními úřady.

Ledviny byly vyjmuty 20 minut po zastavení oběhu a proplachovány na zadním stole gravitací 100 cm studeným (4 stupně) roztokem University of Wisconsin, dokud se výtok nevyčeřil. Žádný heparin nebyl podáván.

Štěpy byly následně uloženy po dobu 18 hodin v kádince naplněné roztokem University of Wisconsin a teplota regulovaná na 4 stupně pomocí kryotermostatu.

V kontrolní skupině pak byly ledviny podrobeny 2 hodinám okysličené (95 procent O2; 5 procent CO2) normotermické strojové perfuzi roztokem Aqix RS I doplněným 40 g/l hovězího sérového albuminu. Jak bylo navrženo dříve, perfuze 8,9 byla zahájena v hypotermii, po které následovalo postupné zvýšení až na 35 stupňů během prvních 60 minut, řízené programovatelným cirkulujícím kryotermostatem.

V experimentální skupině bylo do izolované perfuze zahrnuto krátké období řízené hypertermie (CH).

Ex vivo léčba tepelným šokem malých orgánových štěpů a von Horn protokol. Po dosažení 35 stupňů byla teplota perfuzátu dočasně dále zvýšena na 43 stupňů po dobu 10 minut (obrázek 1), než pokračovala perfuze při 35 stupních po zbytek 2-hodinového období. Čas a výška nárůstu teploty byly odvozeny z předchozích experimentů inkrementálního screeningu, jejichž cílem bylo dosáhnout konzistentního účinku.

Ve třech experimentech byl parciální tlak kyslíku v tkáni řízen použitím optického kyslíkového senzoru jehlového typu z mikrovlákna, připojeného k teplotně kompenzovanému optickému kyslíkoměru (Microx 4, PreSens precision sensing, Regensburg, Německo), který současně zaznamenával odpovídající teplotu pomocí termistorové sondy.

Jehla byla umístěna do vnitřní kortikální oblasti ledviny, aby se dokumentovalo adekvátní okysličení tkáně i během hypertermických období perfuze.

Model izolované reperfuze ledvin

Renální zotavení z konzervačního/reperfuzního poškození bylo hodnoceno pomocí zavedeného in vitro reperfuzního modelu, jak bylo popsáno dříve.10

Stručně řečeno, ledviny byly na konci období rekondice stroje za studena propláchnuty 100 ml fyziologického roztoku a poté udržovány při teplotě místnosti po dobu 20 minut, aby se simulovala druhá teplá ischemická perioda během chirurgické implantace in vivo. Tento čas byl také použit pro kanylaci močovodu pomocí velké hadičky, aby se umožnil sběr moči po reperfuzi.

Ledviny byly umístěny do termostaticky řízené komory z plexiskla a perfundovány přes renální tepnu při středním pulzačním tlaku 90 mmHg. Venózní efluent odtékal volně do rezervoáru. Okysličení perfuzátu se provádělo s 95 procenty O2/5 procenty C02 za použití tepelně řízeného oxygenátoru z dutých vláken. Arteriální tlak byl udržován pomocí servořízeného válečkového čerpadla ve spojení s tlakovým převodníkem připojeným k arteriální perfuzní kanyle. Moč byla odebírána z PE hadičky zavedené do močovodu, který byl veden ven z rezervoáru. Každých 100 ml odebrané moči bylo přefiltrováno a znovu napuštěno do zásobníku v pořadí

Obrázek 1RenálnípO2 kortikální tkáně (tečkovaná čára) během ex vivo strojové perfuze ve vztahu k příslušné teplotě perfuzátu (plná čára).

k udržení konstantního složení elektrolytu perfuzátu v průběhu času.

Analytické postupy

Parciální tlak kyslíku a koncentrace glukózy a elektrolytů v perfuzátu byly měřeny v pH analyzátoru krevních plynů (ABL 815flex acidobazická laboratoř, Radiometer, Copenhagen).

Enzymové aktivity aspartátaminotransferázy (AST) a koncentrace kreatininu byly stanoveny rutinním způsobem pomocí reflexní fotometrie na jednotce péče Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo).

Renálníclearance byla vypočtena pro příslušné intervaly jako kreatinin v moči × průtok moči/kreatinin v perfuzátu.

Koncentrace albuminu ve frakci moči na konci experimentu byla měřena fotometricky pomocí testu vázání barviva s bromokresolovou zelení v laboratorním centru fakultní nemocnice a množství proteinu bylo normalizováno proti odpovídajícím koncentracím kreatininu jako albuminu v moči na poměr kreatininu.

Filtrovaná náplň sodíku (FL Na) byla vypočtena jako

FL=GFR × Na

FRNa=(FLNa − Na(moč) ×průtok moči)∕FLNa

Podle toho byly vypočteny filtrované zatížení a frakční reabsorpce glukózy.

Reverzní transkripce a následná polymerázová řetězová reakce

Celková RNA byla izolována z rychle zmrazených vzorků tkáně z vnější kůry a analyzována, jak bylo popsáno dříve.8

Výchozí hodnoty byly vypočteny ze vzorků tkáně, které byly odebrány z vitální tkáněledvinyex vivo. Výsledky byly kvantifikovány pomocí metody ACt. Cílové geny byly normalizovány na glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázu jako vnitřní standard. Hodnoty složené genové exprese byly vypočteny pro každý jednotlivý vzorek jako normalizované proti výchozím hodnotám.

Ve studii byly použity následující primery (zakoupené od Qiagen GmbH, Hilden, Německo): glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (č. PPS00192A), HSP72 (č. PPS00074A), HSP27 (č. PPS01262) a HO{ {6}} (č. PPS01191A).

Western Blot

Proteinový imunoblotting byl proveden z celobuněčných lyzátů z vnějškuledvinovékortexu elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným a elektroforetickým přenosem na nitrocelulózovou membránu, jak bylo popsáno dříve.8 Barvení bylo provedeno pomocí Ponceau S ověřenou uniformitou nanášení a přenosu proteinu.

Inkubace s primárními protilátkami byla provedena přes noc při 4 stupních (králičí anti-fosfo extracelulární signálem regulovaná kináza (ERK, Thermo Fisher, #MA5-15174—1:500) nebo anti HSP 72 (StressMarq Bioscience, #SCM -100—1:300). Po inkubaci s křenovou peroxidázou spojenou sekundární protilátkou (1:1,000) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byl protein detekován zesílenou chemiluminiscencí pomocí C-Digit Blot Skener (Li-COR).

Kvantifikace obsahu proteinu byla provedena denzitometricky pomocí gelu UN-SCAN-IT verze 6.1 (Silk Scientific, Orem UT) jako normalizovaného vůči expresi celkového ERK (Thermo Fisher, #MA5-15174) nebo ß-aktinu (Thermo Fisher , #PA1-46296).

Statistika

Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry ± SD pro n {{0}} zvířat na skupinu a rozdíly mezi skupinami byly testovány nepárovým, oboustranným t-testem s použitím Welchovy korekce pro nestejné odchylky, pokud není uvedeno jinak. Statistická významnost byla stanovena na P <>

VÝSLEDEK

Strojová perfuze

Během řízeného okysličeného zahřívání strojově perfundovaných štěpů vedla dočasná hypertermie k viditelnému přechodnému poklesuledvinovékortikální tkáň pO2 (obr. 1), která však vždy zůstávala nad 200 mmHg a jednoznačně tak vyhovovala fyziologickým požadavkům při normotermní perfuzi, které byly uváděny jako 30–50 mmHg.11,12

Renálníuvolňování AST do cirkulujícího perfuzátu bylo dokonce mírně nižší ve skupině s hypertermií než za kontrolních podmínek (19,8 ± 12,1 vs. 33,3 ± 25,9 U/l; CH vs. kontrola, nevýznamné).

Molekulární odečet přechodné hypertermie během ex vivo strojové perfuze

Konzervace a reperfuze vedou k významné indukci HSP i za kontrolních podmínek s ~ 2-násobným, 8-násobným a dokonce 100-násobným zvýšením mRNA transkriptů hemooxygenázy 1, HSP 27 a HSP 72, v tomto pořadí.

Nicméně kontrolovaná přechodná hypertermie během strojové perfuze účinně zvýšila toto zvýšení indukce genu ve všech případech asi o 50 procent. Bylo zjištěno, že účinek je vysoce významný pro HSP 27 stejně jako HSP 72, zatímco statistická významnost nebyla prokázána ohledně indukce hemoxygenázy 1 (obrázek 2).

Fosforylace ERK představuje rychlý, citlivý ochranný signál, který může také podporovat expresi HSP 72.13

Byl zkoumán jako časná odezva tepelného stresu na proteinovou hladinu. Analýza Western blot odhalila, že přechodná hypertermie během strojové perfuze významně zvýšila množství fosforylace ERK ve tkáni ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3). V souladu s tím bylo také zjištěno, že exprese proteinu HSP 72 je významně zvýšená nad kontrolní hodnoty po kontrolované hypertermii během strojní perfuze.

Přechodná hypertermie se zlepšujeledvinovézotavení po konzervaci

Průtok perfuzátu během reperfuze byl v průměru mezi 300 a 400 ml/min bez rozdílů mezi těmito dvěma

skupiny. Produkce moči byla také podobná v obou skupinách s 897 ± 354 vs. 601 ± 280 ml/90 minut (kontrola vs. CH).

Renálníuvolňování AST bylo vzato jako parametr globálního buněčného poškození a bylo sledováno během reperfuze (obrázek 4). Je vidět, že hypertermická léčba vedla k zpočátku nižším hodnotám na začátku reperfuze a dále zmírňovala progresivní vzestup během pokračující perfuze.

Renálnífunkce tubulárních buněk byla hodnocena analýzou reabsorpce sodíku a glukózy z ultrafiltrátu (obrázek 5). Bylo zjištěno, že frakční míry reabsorpce zledviny, dříve vystavené řízené hypertermii během strojové perfuze, významně překonaly kontrolní skupinu o ~ 40 procent.

Aby se vyloučila možnost, že kontrolaledvinymohly být nabity absolutně vyššími náložemi sodíku nebo glukózy v ultrafiltrátu, stanovili jsme také celkovou filtrační nálož obou látek, která se však mezi oběma skupinami nelišila s FL Na ve výši 2,7 ± {{3 }},7 a 2,5 ± 0,8 mmol/min a FL glu na 24,8 ± 12,1 a 28,6 ± 9,4 mg/min (kontrola vs. CH).

Rychlosti glomerulární filtrace byly také v obou skupinách nejednoznačné; hodnoty clearance kreatininu činily {{0}},25 ± 0.06 ml/g/min v kontrolní skupině a 0,24 ± 0,08 ml/g/min po CH.

Naproti tomu únik bílkovin močí byl významně snížen vledvinykteré byly podrobeny CH (obrázek 6).

DISKUSE

Použití ex vivo strojové perfuze představuje vyvíjející se trend v managementu konzervace štěpu před transplantací orgánů.

V posledním desetiletí se hypotermická strojová perfuze prosadila jako lepší způsob konzervace ve srovnání s jednoduchým statickým chladírenským skladováním14,15 a stala se populární pro uchování orgánů s vyšším rizikem a také rozšířených kritérií.14–16

Bylo prokázáno, že pulzující stimulace vaskulatury během mimotělního období17 stejně jako přítomnost kyslíku18 udržujíledvinovéhomeostázu a zlepšitfunkčnívýsledky po transplantaci.

Nedávné technické pokroky podpořily nový trend směrem k normotermické strojové perfuzi jako fyziologickější alternativě k technologiím hypotermické perfuze, která kompenzuje vyšší výdaje lepším udržováním metabolické homeostázy a autentičtější možností vyhodnotit uchovaný štěp. před transplantací.19,20

Kromě toho normotermická strojová perfuze představuje ideální platformu pro terapeutické zásahy do izolovaného orgánu, které mohou sloužit kondicionačním účelům s cílem zmírnit následky předchozího vychytávacího/konzervačního poranění nebo předpřipravit proti pozdějšímu reperfuznímu poškození po druhé teplé ischemii a reperfuzi po transplantaci.

cistanche ledvin wirkung

Bylo zjištěno, že léčba tepelným šokem jako terapeutický přístup podporuje velmi účinné ochranné mechanismy v ledvinách a navozuje toleranci ke specifickým poškozením stabilizací proteinové struktury a buněčné integrity. Tento účinek je založen hlavně na syntéze specifických HSP, které jsou konstitutivně exprimovány v ledvinách a mohou být vysoce regulovány v reakci na různé stresové podmínky.4

Tato studie ukazuje, že krátká hypertermická výzva během izolované perfuze ledvin účinně vyvolává reakci molekulárního tepelného šoku, jak dokazuje pre-transkripční a na proteinové úrovni, a aktivuje signalizaci přežití prostřednictvím dráhy ERK. Popsaný postup tedy nebyl spojen se zjevnou tkáňovou hypoxií, i přes izolovanou perfuzi bez dalších nosičů kyslíku.

Již dříve bylo zjištěno, že indukce HSP může začít během < 1 hodiny21 a že exprese HSP 72 se zvyšuje na velké množství již po 3 hodinách.22 HSP 70 je nejvýznamnější chaperon reagující na hypertermický stres a hraje klíčovou roli. role v ochraně tkání pomocí augmentace mechanismu buněčné sebeobrany.5

HSP 72 zabraňuje chybnému skládání proteinů,5 usnadňuje odstranění poškozených proteinů6 a podílí se na opětovném skládání a opravě proteinů. Při podpoře buněčných opravných procesů, které jsou mnohem levnější než de novo syntéza. HSP 72 tak snižuje metabolické potřeby během kritické situace po reperfuzi po poškození buněk21 a tím pomáhábuněčná obnovaz urážky.

Stabilizace lysozomálních membrán23 snižuje poškození buněk kyselými hydrolázami a následnou indukci buněčné smrti. Na molekulární úrovni dřívější studie naznačují, že HSP 72 aktivuje dráhu MEK/Erk a příslušný ochranný účinek souvisí s fosforylací Raf, MEK a Erk a přežitím buněk.24,25 V souladu s tím v našem modelu vedla CH k významné snížení celkového uvolňování AST, které bylo považováno za parametr obecného buněčného poškození. Navíc progresivní vzestup AST během pokračující reperfuze byl také výrazně zmírněn léčbou.

Spolu s tím došlo k výraznému zmírněnírenální dysfunkceprotože bylo zjištěno, že reabsorpční kapacita tubulárních buněk se zvýšila o ~ 50 procent oproti kontrolním hodnotám.

HSP 27 je nízkomolekulární HSP, u kterého bylo také zjištěno, že je důležitým hráčem v reakci na ochranný tepelný šok v ledvinách.4 Studie na tubulárních buňkách potkanů ​​ukazují, že akumulace HSP 27 v buňkách proximálního tubulu je spojena se zvýšeným přežitím a regenerace.26

Na základě výsledků této pilotní studie se implementace krátké hypertermické výzvy do ex vivo strojového perfuzního protokolu zdá být snadným způsobem, jak kondicionovat okrajově zachované ledvinové štěpy, které podporují odolnost vůči reperfuznímu poškození posílením buněčné sebeobrany. stroje. Stále existuje spor, zda by měla být strojová perfuze provedena předem, bezprostředně po odběru štěpu27 navzdory logistickým nepříjemnostem, nebo zda by byla dostatečná a snadněji proveditelná krátká doba perfuze na konci ischemie po transportu orgánu statickým chladírenským zařízením. klinická rutina.28,29 Ex vivo úprava štěpu pomocí CH by byla možná v obou modalitách.

Je však třeba být obezřetný, pokud jde o předčasné konečné závěry. Izolovaná perfundovaná ledvina (IPK) je užitečným nástrojem pro funkční screeningové studie30 a korelace mezi údaji o IPK a klinickými výsledky činí z modelu IPK potenciálně užitečný nástroj pro hodnocení funkce ledvin.17,31 Nicméně poměrně konstantní funkční kapacita modelu je omezena na několik hodin,32 což vylučuje dlouhodobá pozorování.

Vzhledem k tomu, že k maximální expresi HSP může dojít i po této době,22 potenciální další zvýšení ochranného účinku hypertermické léčby (např. ve smyslu zlepšené regenerace po ischemickém poškození) nebude v našem pilotním nastavení zohledněno. Navíc je dobře známo z dřívějších studií na jiných modelech, že léčba tepelným šokem nebo lentivirem indukovaná nadměrná exprese HSP 27 může vést ke zmírnění zánětlivé reaktivity poraněných cílových orgánů.

spolu s významným snížením infiltrace neutrofilů do tkáně.33,34

Infiltrace leukocytů je zase známá jako hlavní fenomén akutního typu, který spouští škodlivé zánětlivé reakce po renální ischemii a reperfuzi in vivo.

Aby se však vyloučily průvodní nepříznivé účinky aktivace krevních buněk na umělých površích hadiček, které by byly nevyhnutelné v rozšířeném modelu in vitro, zdá se, že skutečná transplantace a reperfuze za fyziologických podmínek, včetně přirozené morfologie cév, jsou pro přesné určení buněčné zánětlivé účinky, kterými se proto tento pilotní výzkum nezabýval.

Nedávná zjištění konečně prokázala zásadní významrozdíly mezi pohlavímiv transkriptech exprimovaných v buňkách proximálních tubulů samců vs. samic, které mohou odrážet rozdíly související s pohlavím u chronického onemocnění ledvin nebo prozánětlivé genové moduly.35 V naší studii byly použity pouze samice, čímž se obešly domnělé rozdíly související s pohlavím v reakce tepelného šoku. Na druhou stranu možné odlišné chování mužské tkáně nebylo v této studii řešeno, a proto je nelze zohlednit.

Závěrem, naše dosavadní data ukazují, že krátká hypertermická ex vivo perfuze je snadným způsobem k indukci chaperonu v izolovaném renálním štěpu, který poskytuje parenchymální ochranu po časné reperfuzi a zaručuje další potvrzení pomocí in vivo transplantačních modelů s prodlouženou dobou pozorování.

Poděkování. Autoři vděčně oceňují cennou technickou pomoc Bastiana a Reginy Lüerových.

Financování. Na tuto práci nebyly získány žádné finanční prostředky.

Konflikt zájmů. Autoři nedeklarovali žádné konkurenční zájmy na této práci.

Autorské příspěvky. TM a CvH napsal rukopis. TM a CvH navrhly výzkum. Výzkum provedly TM a CvH. TM a CvH analyzovaly data.