Going Micro in Leptospirosis Onemocnění ledvin Ⅱ

4. Imunitní reakce hostitele na Leptospira spp.

Hlavní cestou Leptospiry je přímá penetrace sliznic nebo otevřené kůže krví, tkáněmi, močí nebo kontaminovanou vodou, která se šíří do systémového oběhu a šíří do několika orgánů, např.játraplíce a proximálního tubulunefron v ledvinách, kde se může množit a přežít měsíc [51]. V počáteční fázi infekce,vrozená imunitní odpověďhraje zásadní roli jako první obranná linie u leptospirózy, která ovlivňuje odezvureceptory pro rozpoznávání vzorů, fagocytóza makrofágů, indukce extracelulárníakumulace neutrofilů, azásah komplementového systému [52].

Theimunitní odpověďu lidí hraje zásadní roli vvývoj klinických příznakůstejně jako faktory virulence některých patogenních kmenů. Většina lidských leptospiróz je asymptomatická nebo mírná a pouze u 10 % případů se vyvinou závažné formy s multiorgánovým selháním a zvýšenou úmrtností související scytokinová bouřea stav imunoparalýzy. Patogenní druhy stimulují humorální odpověď ve fázi bakteriémie, i když následné chováníimunitní odpověďje nejasný. Ve studiích pacientů s mnohočetnými klinickými projevy leptospirózy byla závažnost klinického obrazu spojena s různými hladinami sérových cytokinů, jako je TNF-, IL-10 a IL-6 [53], ale tento závěr zůstává kontroverzní [54]. Tyto stavy vedly ke zvýšenému zájmu o pochopení imunitní reakce obecně a biologických dějů, ke kterým dochází během infekce.

JAK DLOUHO TRVÁ, NEŽ CISTANCHE PŮSOBÍ?

4.1. Leptospira a komplementový systém

Proteolytická aktivita leptospirálních proteáz proti extracelulární matrix umožňuje infekci vstoupit do oběhového proudu. Systém komplementu v oběhovém systému je jedním z hlavních mechanismů přirozené imunitní odpovědi na patogenní leptospiry. Leptospira však vyvinula strategie, jak uniknout útoku komplementového systému navázáním proteinů na molekuly komplementu a produkcí proteáz, jako je thermolysin, termostabilní neutrální metaloproteinázový enzym, který ovlivňuje proteinový řetězec C3. Patogenní kmeny vážou faktor H (FH), protein 1 související s komplementem H (FHR-1), protein podobný faktoru H 1 (FHL-1) a protein vázající C4b (C4BP), všechny z nichž jsou zodpovědné za inhibici systému komplementu [55]. Existují tři hlavní strategie pro únik komplementu patogenních leptospir [55,56] prostřednictvím interference regulátorů komplementu hostitele, hostitelské proteázy a bakteriální proteázy. Pro regulátory komplementu používá Leptospira faktor H (FH; regulátor alternativní dráhy komplementu) a vazebný protein C4 (C4BP; regulátor klasických a lektinových komplementových drah) k urychlení rozpadu C3 konvertáz a také působí jako kofaktory pro faktor I pro štěpení C3b a C4b [57,58]. Leptospirální protein (LcpA) spolu s vitronektinem (Vn; regulátor terminální dráhy) váže C9 a inhibuje jeho polymeraci [59], čímž potenciálně blokuje tvorbu komplexu aktivujícího membránu (MAC) [60]. Kromě toho patogenní Leptospira váže několik hostitelských proteáz, jako je aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA), který indukuje aktivní plazmin [61] (serinová proteáza) pro štěpení C3b, C4b a C5 na povrchu Leptospiry [62]. Navíc metaloproteázy a termolysin, endogenní proteáza Leptospira, mohou štěpit a inaktivovat několik proteinů komplementu (C2, C3, C4 a faktor B) [60]. Kombinace regulátorů komplementu z hostitele a patogenních leptospir usnadňuje bakteriální kolonizaci v cílových orgánech hostitele [63].

4.2. Leptospiry a neutrofily

Během infekce spouštějí patogenní druhy Leptospira silnou aktivaci neutrofilů a prozánětlivou odpověď. Neutrofily jsou důležité pro kontrolu mikroorganismů, ale také přispívají k poškození tkáně hostitele. Bylo prokázáno, že nízké hladiny extracelulární akumulace neutrofilů v důsledku nízké aktivity neutrofilů v oběhu zvyšují leptospirémii, což ukazuje, že intravaskulární tvorba přísunu neutrofilů může být rozhodující pro prevenci časného šíření patogenních leptospir [64].

4.3. Leptospiry a makrofágy

V počáteční fázi infekce Leptospirou hrají makrofágy důležitou roli v eliminaci spirochéty. Tento efektorový mechanismus spolu s účinnou cytokinovou odpovědí souvisí s fagocytární kontrolou a šířením infekce, ačkoli Leptospira spp. bylo prokázáno, že indukuje apoptózu v makrofázích cestou Fas/FasL-kaspázy-8/-3 a usnadňuje jejich přežití a proliferaci v hostiteli díky uvolnění apoptózy a endonukleázy indukující mitochondriální faktor u infikovaných makrofágy [65]. Nedávný výzkum byl proveden na mikro-transkriptomu makrofágů infikovaných leptospirou, aby se určily epigenetické mechanismy, jako je post-transkripční regulace pomocí RNA. Makrofágy infikované Leptospirou ukázaly, že mikroRNA (miRNA) jsou regulovány infekcí spirochetou, což ukazuje, že tato regulace je životně důležitá v reakci těchto buněk imunitního systému na infekci Leptospirou [66]. V lidských makrofázích má aktivace zánětu zprostředkovaného reaktivními formami kyslíku a lysozomálním katepsinem B generovaným infekcí Leptospira výrazné hladiny NLRP3 a IL-18, což podporuje produkci IL-1 a vede k vysokým možnost fagocytózy a rychlé modelování některých cytokinů korelovalo s rezistencí na leptospirózu [67].

4.4. Humorální reakce na Leptospira

Specifická humorální odpověď proti Leptospira je charakterizována produkcí IgM a IgG protilátek třetí den od nástupu příznaků. Kromě toho byla hlášena produkce IgA od prvního dne do devátého měsíce po infekci; zvýšení IgM bylo ve skutečnosti použito jako alternativní opatření v časné diagnostice leptospirózy [68]. Vliv humorální odpovědi u lidí s leptospirózou umožňuje stanovení sérologické diagnózy po přirozené infekci [69]. Nejdůležitějším aspektem humorální odpovědi u infekce Leptospira může být tvorba ochranných protilátek. Vakcíny, které jsou v současné době k dispozici proti leptospiróze, se skládají z kompletních buněčných přípravků a mají omezení, jako je nízká účinnost, četné vedlejší účinky, nízká tvorba imunitní paměti a nedostatek zkřížené ochrany pro rozdíly sérovarů. Pro kontrolu onemocnění je tedy nezbytný vývoj nových vakcín a v současnosti probíhá výzkum výroby vakcín z genetické imunizace [70]. OMP Leptospiry byly považovány za antigen s lepší imunogenicitou pro B lymfocyty, které zahrnují strukturální epitopy OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} a LipL41263-282 [71]. Tyto epitopy jsou slibnými kandidáty pro vývoj univerzální vakcíny.

4.5. Adaptivní imunitní odpověď na Leptospira: T-buňky a cytokiny

Patogenní druhy Leptospira indukují imunitní odpověď zprostředkovanou T a B lymfocyty, doprovázenou expresí cytokinů, která může být spojena s gravitačními diagramy. Aktivace T-buněk během infekce Leptospirou iniciuje zánětlivou odpověď, zejména prostřednictvím produkce cytokinů. To je kritické pro včasnou eliminaci infekce, ale nekontrolovaná produkce prozánětlivých cytokinů může také vyústit v nadprodukci cytokinů následovanou stavem imunoparalýzy, která může vést k sepsi a multiorgánovému selhání. T lymfocyty produkují IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- a TNF-, které fungují jako chemoatraktanty při získávání leukocytů v místě infekce. Je zajímavé, že in ex vivo naivní δ T buňky proliferovaly v kulturách mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) stimulovaných antigeny Leptospira spolu s produkcí jak IL-17, tak IFN [72]. Kromě toho, zatímco myši divokého typu infikované leptospirózou vykazovaly vyšší hladiny spousty cytokinů, včetně IL-4, IL{13}} a IL-13 ve srovnání s neinfikovanými myšmi, leptospirou indukovaná myší chronická nefritida (Daf1-/- myši) vykazovala vyšší expresi aktinu hladkého svalstva, IL-10, IL-13, ale žádný rozdíl mezi IL-12 a IL{{21} } úrovně [73]. Jako takové mohou Daf1 a IL-17 hrát klíčovou protektivní roli v progresi CKD jako spojení mezi myší CKD vyvolaným Leptospirou a renální fibrózou [72,73]. Hypotéza vybrané cytokinové odpovědi v progresi onemocnění je však u lidské leptospirózy zatím neprůkazná. U pacientů s těžkou leptospirózou a plicním postižením byly ve srovnání s pacienty s mírnou leptospirózou získány zvýšené hladiny IL-6, CXCL8 a IL-10 [53]. Tyto vysoké koncentrace cytokinů u pacientů s leptospirózou zdůrazňují jejich klíčovou roli při rozvoji těžké leptospirózy.

U pacientů s těžkou infekcí jsou nalezeny CD4+ T lymfocyty s prozánětlivým profilem a producenty IL-2 a IFN-, zatímco CD4+ CD25high producenti IL-10 téměř chybí. Zdá se, že regulace imunitní odpovědi zprostředkované T lymfocyty nezabraňuje poškození tkáně způsobenému zánětlivou odpovědí na Leptospiru. V CD4+ T lymfocytech lidí s těžkou leptospirózou je produkce TNF- a dalších prozánětlivých cytokinů vyšší než u pacientů s mírnou formou onemocnění, což naznačuje, že tyto cytokiny lze použít jako markery závažnosti v imunologické fázi infekce [74]. Produkce IL-10 je spojována s rizikem úmrtí u lidí s leptospirózou; nicméně studie provedená na exponovaných a asymptomatických lidech spojovala produkci tohoto cytokinu s kontrolou zánětlivé odpovědi a přežitím [74]. Během infekce Leptospirou jsou u rezistentních jedinců rychle regulovány zánětlivé mediátory a působení některých leukocytárních buněk, jako jsou T lymfocyty, na rozdíl od toho, co se vyskytuje u jedinců s těžkými formami leptospirózy [75].

Abychom to shrnuli, imunitní odpověď na infekci Leptospirou není plně pochopena kvůli klinickému chování pacientů s leptospirózou, kteří interagují s různými faktory virulence bakteriálního genomu, což dává Leptospire solidní patogenní kapacitu.

5. Klinické projevy

Klinické projevy leptospirózy jsou různé, od mírných, nespecifických příznaků, jako jsou příznaky podobné chřipce (horečka, myalgie a bolest hlavy), až po závažné příznaky spolu s konečným stádiem poranění orgánů (např. AKI, akutní jaterní selhání a krvácivou diatézou, také známou jako Weilův syndrom), akutní hemoptýzu z plicního krvácení, akutní zmatenost z aseptické meningoencefalitidy a akutní srdeční selhání z akutní nebo subakutní myokarditidy [7]. V souladu s tím tři indikátory podezření na infekci leptospirózou sestávají z (i)akutní horečnaté onemocnění, (ii) žloutenka a (iii)akutní poškození ledvin[12]. Prediktory těžké formy leptospirózy jsou těžká myalgie na počátku, tendence k těžkému krvácení a výrazná žloutenka. Je zajímavé, že přítomnost obou již existujícíchchronické onemocnění ledvin(malá velikost ledvin) nebo zvětšené, překrvené ledviny s anurií souvisí s nejhorším výsledkem [12]. Pacienti s onemocněním ledvin souvisejícím s leptospirózou by proto měli být léčeni okamžitě.

6. Diagnostika

6.1. Klinická diagnóza

Diagnóza leptospirózy je založena na anamnéze expozice, rizikových faktorech a klinických projevech. Vysoký index podezření může obejít pozdější poškození orgánů. Příznaky leptospirózy jsou však často zaměňovány za jiné příčiny akutního febrilního syndromu, jako je infekce dengue, malárie, hepatitida a aktivní autoimunitní onemocnění. Absence patognomických známek leptospirózy znamená, že diagnóza je předběžně založena na hodnocení horečky a myalgie u pacientů z endemické oblasti. Z tohoto důvodu je laboratorní diagnostika leptospirózy zásadní.

6.2. Laboratorní diagnostika

Leptospirózu je obtížné laboratorně diagnostikovat, zejména v akutní fázi. Může být provedena přímou identifikací spirochet nebo jejich složek v tělesných tekutinách nebo tkáních, izolací leptospir v kultuře nebo detekcí konkrétních protilátek v různých klinických fázích. Leptospirózu je obtížné odlišit od nemocí, jako je malárie, horečka dengue, rickettsie, chřipka, hepatitida a žlutá zimnice, protože má vágní klinický vzhled. V důsledku toho jsou k potvrzení diagnózy nutné laboratorní testy. Základem těchto testů (DNA) je průkaz protilátek proti leptospirám, leptospirám samotným nebo jejich deoxyribonukleové kyselině. Současná laboratorní diagnostika zahrnuje jak přímou identifikaci (průkaz spirochet Leptospira nebo DNA ve vzorcích nebo izolace organismu ze vzorků), tak nepřímou detekci (sérologická diagnóza nebo sérologie pro identifikaci leptospirální infekce, která je založena na detekci specifických protilátek proti různým Leptospirální antigeny) (Tabulka 1).

6.2.1. Přímé mikroskopické vyšetření, kultivace a detekce antigenu

Leptospiry jsou tenké, jasné, aktivně pohyblivé spirály s charakteristicky rychlým rotováním (motilita záškubů) pod konvenčním mikroskopem v temném poli (DFM) a přibližně 10 leptospir/ml je nezbytných pro detekci jedné buňky na pole. S o týden delším trvání infekce je přibližně 10 % úbytku výtěžku DFM (od 100 do 90 %). Pro zvýšení citlivosti několik speciálních metod barvení; Barvení stříbrem Warthin– Starry [76] a imunobarvení (imunohistochemie, imunofluorescence, zachycení imunomagnetického antigenu a barvení imunoperoxidázou [77]), které vyžadují primární protilátky specifické pro sérovar (v izolaci nebo v kombinaci).

Tabulka 1. Laboratorní testy pro diagnostiku leptospirózy.

LAMP, smyčkou zprostředkovaná izotermická amplifikace; PCR, polymerázová řetězová reakce; NGS, sekvenování nové generace; IHA, nepřímá hemaglutinace; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IgM, imunoglobulin M; MAT, makroskopický aglutinační test; MCAT, test aglutinace mikrokapslí; DNA, deoxyribonukleová kyselina; DFM, mikroskopie v temném poli

Souběžně s tím je možné kultivovat Leptospiry z krve, moči, mozkomíšního moku a bioptické tkáně během prvních několika dnů až 10 dnů po nástupu příznaků onemocnění (stadium leptospirózy). Vzhledem k tomu, že kultivační vzorky rostou pomalu (doba zdvojnásobení 6–8 hodin), jsou náročné a náchylné ke kontaminaci, musí být uchovávány alespoň 3–4 měsíce, než budou vyřazeny jako negativní) s citlivostí pouze 23 %, ale je to nutné. pro test citlivosti na léky [6]. Médium EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (komplex olejového albuminu) jako takové sestává z hovězího sérového albuminu (frakce V), Tweenu 80, chloridu amonného, ​​thiaminu, fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu sodného a různých živin [78]. běžně používané, zatímco pro některé sérovary je vyžadováno specializovanější médium T80/40/LH (polysorbát 40, hydrolyzát laktalbuminu, superoxiddismutáza a králičí sérum) [79]. Pro primární izolaci velkého a různorodého spektra náročných patogenních leptospir se zdá být dobrým médiem Hornsby–Alt–Nally (HAN) [80].

Detekce leptospirálních antigenů imunoperoxidázou, imunofluorescencí nebo imunomagnetickým systémem pro zachycení antigenu byla vyvinuta pro vzorky s nízkou bakteriální zátěží nebo nelze použít mikroskopii v tmavém poli, ale není rutinně prováděna kvůli omezení primární protilátky [77]. Naproti tomu rozpoznávání nukleových kyselin s novou amplifikací DNA; polymerázová řetězová reakce (PCR) (tj. nested-PCR, kvantitativní PCR [qPCR]), izotermická amplifikace zprostředkovaná smyčkou (LAMP) a sekvenování nové generace (NGS) jsou cenné pro časnou a přesnou laboratorní diagnostiku, zejména u Izolace leptospir pomocí inokulace biologického média a hybridizace DNA (sonda DNA) [81,82]. Pro diagnostiku lze amplifikovat různé leptospirální cíle (jako je 16S ribozomální RNA) nebo DNA [83] a PCR v reálném čase (RT-PCR) je citlivější a specifičtější než standardní PCR [84]. Protože některé primery RT-PCR se mohou vázat na nespecifické místo, což vede k falešně pozitivním výsledkům, byly nejnovější testy multiplexní PCR v reálném čase vyvinuty za použití dvou sad primerů [85]. Nested PCR také pomáhá při detekci specifičtějších a citlivějších míst DNA pomocí dalších sad primerů [86,87]. Současným trendem v diagnostice leptospirózy je však použití sérologických i molekulárních technik, jako je PCR a ELISA (snazší než sérologický MAT zlatého standardu), pro země s omezenými zdroji [88,89]. Technika LAMP [90] k detekci genu 16S rRNA (rrs) je navíc nákladově efektivní, rychlá a vysoce výnosná pro detekci patogenních leptospir v moči. V současné době je NGS nejpřesněji založená na kultuře nezávislá metoda analýzy jádrového genomu v tělesných tekutinách (krev a moč) [91] a budoucím směrem testů leptospirózy by bylo posunout se směrem k molekulární klasifikaci leptospir, která překonává omezení kultivační izolace leptospir z klinických vzorků. Proto je hodnota PCR v klinické diagnostice leptospirózy obzvláště dobrá a objevuje se několik moderních technik

6.2.2. Detekce protilátek proti leptospire

Používá se několik sérologických diagnóz; například rodově specifické testy na protilátky (nepřímá hemaglutinace [IHA], enzymová imunoanalýza [ELISA], Lepto Dri Dot [latexová aglutinace], mikrokapslová aglutinace [MCAT]) a testy na protilátky specifické pro sérovar (mikroskopický aglutinační test [ MAT]) [92,93]. Kritéria MAT pro diagnózu jako taková jsou (i) čtyřnásobné zvýšení titru v párových sérech (sérokonverze současné infekce) nebo (ii) jeden vysoký titr (Větší nebo rovný 1:400 nebo 1:800, vyšší v epidemii oblasti) (séropozitivita) (protilátky mohou přetrvávat nějakou dobu po infekci nebo zkřížené reakci s jinými nemocemi). Navíc MAT vyžaduje živý panel všech sérovarů Leptospira v regionu s panelem lokálně standardizovaných sérovarů [93,94] podle Světové organizace pro zdraví zvířat (19 antigenů reprezentujících 15 séroskupin) [95]. Protože protilátky jsou detekovatelné 5–7 dní po infekci, může být MAT test negativní (titr < 1:50) během prvních několika dnů infekce. Diagnostiku leptospirózy lze provést pomocí vzorků moči [96] s použitím jak sérologické, tak molekulární detekce (16S rRNA), zejména u pacientů s nedávnou infekcí (MAT větší nebo rovno 1:800 nebo ELISA IgM-pozitivní nebo obojí) [97] .

S omezenými zdroji je klinické predikční skóre [98] založené na relevantní klinické anamnéze a souvisejících laboratorních testech se skóre v sedmi aspektech následující: hypotenze (3), žloutenka (2), bolest svalů (2), AKI (1,5) , nízký hemoglobin (3), hypokalémie s hyponatrémií (3) a neutrofilie (1) je navržena (mezní souhrnné skóre 4 má plochu pod křivkou operační charakteristiky přijímače {{10}}.78 ( 95% CI 0,68–0,89) pro diagnózu leptospirózy [77]). Toto skóre pravděpodobnosti Thai-Lepto-on-admission by mohlo být diagnostickým nástrojem pro časnou presumptivní diagnostiku leptospirózy u pacientů s vážným klinickým podezřením na toto onemocnění.