Nedávné pokroky v objevování klíšťového antigenu a vývoji vakcíny proti klíšťatům, část 1

Abstraktní:

Klíšťata mohou vážně ovlivnit zdraví lidí a zvířat na celém světě a každý rok způsobit značné ekonomické ztráty. Chemické akaricidy jsou široce používány k hubení klíšťat, které negativně ovlivňují životní prostředí a mají za následek vznik populací klíšťat odolných vůči akaricidům. Vakcína je považována za jeden z nejlepších alternativních přístupů ke kontrole klíšťat a nemocí přenášených klíšťaty, protože je levnější a účinnější než chemická kontrola. Mnoho vakcín na bázi antigenu bylo vyvinuto jako výsledek současných pokroků v transkriptomice, genomice a proteomických technikách.

Některé z nich (např. Gavac® a TickGARD®) jsou komerčně dostupné a běžně se používají v různých zemích. Kromě toho se zkoumá značný počet nových antigenů s perspektivou vývoje nových vakcín proti klíšťatům.

K vývoji nových a účinnějších vakcín na bázi antigenů je však zapotřebí více výzkumu, včetně hodnocení účinnosti různých epitopů proti různým druhům klíšťat, aby se potvrdila jejich zkřížená reaktivita a jejich vysoká imunogenicita. V tomto přehledu diskutujeme o nedávném pokroku ve vývoji vakcín na bázi antigenů (tradičních a na bázi RNA) a poskytujeme stručný přehled nedávných objevů nových antigenů spolu s jejich zdroji, charakteristikami a metodami používanými k jejich testování. účinnost.

Antigeny jsou látky, které mohou vyvolat imunitní odpověď, včetně bakterií, virů, buněk atd. Imunita je schopnost těla reagovat na vnější antigeny, včetně imunity vrozené a imunity získané. Vztah mezi antigeny a imunitou je úzký a imunita dokáže rozpoznat a napadnout antigeny, čímž chrání tělo před onemocněním. Například, když je lidské tělo vystaveno určitému patogenu, imunitní systém rozpozná antigen a vytvoří protilátky, které jej napadnou, aby se vyhnul nemoci. Proto je souhra mezi antigeny a imunitou důležitým mechanismem pro udržení dobrého zdraví. Z tohoto pohledu je tedy potřeba dbát na zlepšování naší imunity v každodenním životě. Cistanche má významný vliv na zlepšení imunity. Cistanche je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály, snižovat oxidační stres a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Klikněte na doplněk cistanche deserticola

klíčová slova:

vakcíny; antigenní kandidáti; vakcína proti klíšťatům; ovládání klíšťat.

1. Úvod

Klíšťata jsou ektoparaziti, kteří napadají lidi a zvířata a jsou zodpovědní za značné ekonomické ztráty. Jsou po komárech druhými nejvýznamnějšími přenašeči pro přenos nemocí u lidí [1,2]. Jsou také jedním z nejdůležitějších vektorů pro přenos nemocí, které mají dopad na celosvětový průmysl skotu a domácích zvířat [3–5]. Klíšťata mají málo přirozených nepřátel, a proto je obtížné kontrolovat infekce klíšťaty. Chemické akaricidy byly účinné pouze částečně, s několika necílovými nevýhodami, včetně výběru klíšťat odolných vůči akaricidům a kontaminace životního prostředí a živočišných produktů chemickými zbytky [6].

Kromě toho se pro kontrolu nemocí přenášených klíšťaty v různých zemích používají některé vakcíny na bázi antigenů; jsou však zapotřebí nové a účinnější přístupy, včetně vývoje nových vakcín, které se zaměřují na napadení klíšťaty a infekce patogeny [7,8].

Při navrhování a vývoji vakcíny pro kontrolu parazitů/patogenů tradičně hrál zásadní roli princip „izolovat–inaktivovat–injektovat“. Vakcíny první generace byly složeny z patogenů, které byly živé, oslabené nebo zabité. Vakcíny druhé generace se skládaly z purifikovaných složek parazitů/patogenů a byly vyvinuty jako výsledek pokroku v buněčné kultuře, chemii polysacharidů, technologii rekombinantní DNA a imunologii [9,10]. Pokrok v genomice a dalších „omikách“ v posledních dvou desetiletích vyústil ve vývoj „třetí generace“ vakcín založených na technologiích, jako je funkční omika, reverzní vakcinologie a systémová biologie.

Aby se překonala omezení konvenčních přístupů k vývoji vakcín, vývoj vakcíny se stal více přizpůsobený, se zaměřením na části antigenu, na které jsou zacíleny ochranné imunitní reakce [11,12], se širokou perspektivou patogenu a jeho interakce s imunitní systém hostitele [13]. Moderní vakcinologie se tedy stále více spoléhá na nové omické přístupy využívající vysoce výkonné špičkové technologie, jako je genomika, transkriptomika a proteomika, spolu s pokroky v základní imunologii, biologii hostitel-patogen, imunomice, pokročilé bioinformatice, výpočtovém modelování a vylepšeném porozumění a technologické inovace.

Ve srovnání s používáním chemikálií je očkování rozumnou možností, protože je ekologicky bezpečné a nákladově efektivní pro kontrolu napadení klíšťaty [12,14]. I když je očkování racionální strategií kontroly zamoření klíšťaty, komercializováno bylo zatím jen několik vakcín, s minimálním zájmem o navození zkříženě reaktivní imunity proti druhům klíšťat [15].

Pro vývoj nových vakcín je zásadní identifikovat a charakterizovat nové kandidáty na antigen, které by byly více konzervativní a měly by schopnost indukovat zkříženě reaktivní imunitu u hostitelských druhů. Cílem tohoto přehledu je poskytnout přehled tradičních vakcín a vakcín na bázi RNA a možnosti jejich aplikace a nových antigenů, které mají potenciál být využity jako slibní kandidáti na antigen pro vývoj vakcín.

2. Identifikace antigenů: Plán pro vývoj vakcíny proti klíšťatům

Identifikace antigenů je pro vývoj vakcíny proti klíšťatům prvořadá. Je zásadní porozumět molekulárním mechanismům spojeným s interakcemi hostitel–parazit–patogen, aby bylo možné identifikovat kandidáty antigenu, kteří pravděpodobně poslouží jako kandidáti/cíle pro vývoj vakcíny. Ideální kandidát na antigen indukuje u hostitele dlouhotrvající a účinné imunitní reakce [16,17]. Od doby, kdy Allen a Humphreys publikovali svá zjištění v roce 1979, bylo provedeno mnoho studií, které využívají řadu antigenů, včetně homogenátů celých klíšťat a vnitřních orgánů, k navození různých úrovní imunity proti klíšťatům [16].

Od doby Ixodes scapularis, prvního druhu klíšťat, který byl sekvenován, se objevilo několik nových možností pro predikci, screening a identifikaci antigenů chránících proti napadení klíšťaty [18]. Nyní je k dispozici mnoho nukleotidových a proteinových databází z různých tkání a vývojových stádií klíšťat a je známa široká škála podnětů, které klíšťata ovlivňují, jako je krmení klíšťaty nebo infekce patogeny [17,19].

Pravděpodobnost výběru kandidátů na ochranný antigen odvozených od klíšťat pro kontrolu napadení klíšťaty a infekce patogeny se také zvýšila v důsledku nedávných pokroků v technologiích omiky (tj. transkriptomiky, proteomiky a metabolomiky) [20]. Kromě toho použití reverzní vakcinologie (RV), neboli vakcinomie, umožnilo objev nových kandidátů na vakcinační antigeny [20].

V důsledku toho byly hodnoceny syntetické a rekombinantní proteiny a bylo prokázáno, že jsou schopny vyvolat určitou úroveň ochranné imunity. Účelem této části je diskutovat kandidáty na antigeny pocházející z různých tkání, které byly identifikovány, posouzeny z hlediska jejich účinnosti a jsou považovány za potenciální kandidáty pro vývoj vakcíny proti klíšťatům na základě dostupné literatury (tabulka 1 a Obrázek 1).

Obrázek 1. Přehled schématu distribuce a hodnocení účinnosti cílových antigenů vakcíny klíšťat pro prevenci zamoření klíšťaty a nemocí přenášených klíšťaty.

2.1. Kandidáti na antigen spojený s vajíčkem

Vaječný žloutek je nezbytnou složkou pro vývoj klíšťat, protože slouží jako rezervoár různých proteinů, které hrají klíčovou roli během embryonálního vývoje těchto členovců [21,22]. Stejně jako u hmyzu jsou proteiny žloutku syntetizovány v tukovém těle klíšťat [21,23]. Degradace žloutku je prováděna různými typy enzymů, které se nacházejí ve vejcích. Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) je příkladem žloutkové proteinázy, která byla izolována z vajíček R. microplus a bylo popsáno, že je zapojena do procesu embryogeneze klíštěte.

Tyto enzymy hrají klíčovou roli zejména při degradaci vitelinu, hlavní bílkovinné složky vaječného žloutku [21]. BYC byl poprvé izolován da Silva Vaz Jr a kol. [24] z vajíček R. microplus a poté byla naočkována skotu, aby se určila její role při navození imunity hostitele. Bylo zjištěno, že tento enzym poskytuje částečnou ochranu proti klíšťatům a spouští ochrannou imunitní odpověď u skotu, ale jeho účinnost se pohybovala mezi 14 procenty a 36 procenty. Následná studie exprimovala rekombinantní protein BYC v prokaryotickém expresním systému (E. coli).

Je zajímavé, že rekombinantní protein vykazoval celkově vyšší účinnost (25,24 procenta) ve srovnání s enzymem přímo izolovaným z vaječného žloutku [25,26]. Ukázalo se, že účinnost tohoto proteinu mohou ovlivnit různé faktory, například způsob přípravy proteinu BYC může ovlivnit strukturu proteinu a v konečném důsledku i jeho funkce. Kromě toho může být tato variace také spojena s kmenem klíšťat nebo jinými experimentálními podmínkami [24].

Vitellin, lipoglykoprotein vyskytující se také ve vaječném žloutku podobně jako jiné proteiny žloutku, je syntetizován v tukových tělech členovců [27,28]. U klíšťat jsou vitellin nebo vitellogeniny klíčové pro vývoj vajíček a kladení vajíček, jak dokazuje umlčení tří genů vitellogeninu u H. longicornis [29]. Protein Vitellin byl purifikován z vajíček klíšťat jako nekovalentní komplex šesti polypeptidů o vysoké molekulové hmotnosti (44–107 kDa). Paralelně s touto studií byl izolován a purifikován 80 kDa glykoprotein (GP80) z larev R. microplus.

Oba proteiny byly poté naočkovány, aby se zjistila jejich účinnost. Vakcinace Vitellinem a GP80 prokázala celkovou 68procentní účinnost, což naznačuje, že vakcína obsahující oba antigeny může vyvolat imunitní odpověď a také poskytnout částečnou ochranu proti R. microplus u ovčích hostitelů [28].

Je pozoruhodné, že když byl rekombinantní hexahis-GP80 (HH-GP80), který byl nesprávně sbalený a neglykosylovaný, injikován do hostitele za stejných experimentálních podmínek, nevykazoval žádnou účinnost [28]. Na základě zjištění výše uvedené studie se zdá, že vakcinace vitellinem a GP80 může vyvolat imunitní reakce u ovcí a může částečně chránit ovce proti klíštěti B. micro plus. Správné sbalení HH-GP80 je klíčové pro jeho aktivitu, protože ochranné epitopy jsou spojeny se sbalením proteinu a/nebo na něj navázaných oligosacharidů a tyto epitopy jsou nezbytné pro jeho aktivitu.

Cysteinová endopeptidáza degradující vitellin (VTDCE) je další enzym spojený s vejci, který byl identifikován a izolován Seixasem et al. [30]. Podobně jako u BYC není tento enzymatický protein syntetizován ve vaječníku R. microplus a podílí se na hydrolýze vitelinu, čímž poskytuje živiny vyvíjejícím se embryím.

Bylo však zjištěno, že oba enzymy regulují hydrolýzu vitelinu odlišně [30]. Stejná výzkumná skupina později analyzovala purifikovaný protein VTDCE jako antigen a zjistila, že tento protein také poskytuje částečnou ochranu proti klíšťatům, protože imunizace hospodářských zvířat vedla k 21% účinnosti a 17,6% snížení hmotnosti plodných vajíček [31]. Proteiny spojené s vejci BYC a VTDCE poskytovaly omezenou ochranu hostitele proti zamoření klíšťaty, a proto se zdají být nevhodnými kandidáty na antigen, pokud jsou použity samostatně ve vakcíně.

2.2. Kandidáti na antigen spojený se slinnými žlázami

Klíšťata obsahují protein podobný angiotenzin konvertujícímu enzymu, který může regulovat krevní tlak regulací objemu tekutin, podobně jako angiotenzin konvertující enzym u savců [32,33]. Tato kontrola umožňuje klíštěti nepřetržitě se živit krví hostitele. Slinné žlázy a střední střevo klíštěte B. micro plus obsahují glykoprotein s nízkým výskytem, ​​který se nazývá Bm91 [32]. Bm91 v současné době není součástí komerčních vakcín proti klíšťatům, ale je považován za kandidáta na kontrolu klíšťat [34]. Když byl rekombinantní protein Bm91 hodnocen samostatně v polních podmínkách s přirozeným napadením klíšťaty, výsledky byly zklamáním, protože tento protein vykazoval pouze 6procentní účinnost, což se zdá nevhodné pro vývoj vakcíny pro kontrolu klíšťat [35].

Když se však rekombinantní protein Bm91, který byl produkován v E. coli, zkombinoval s Bm86 (kandidát na antigen, který se používá v komerčních vakcínách) a poté byla tato kombinace proteinů použita jako vakcína, výsledky byly mnohem slibnější protože přidání Bm91 zvýšilo účinnost antigenu Bm86 [33], což naznačuje, že kombinace těchto dvou proteinů (Bm91 a Bm{6}}) se zdá být účinnou strategií pro vývoj nového anti - vakcína proti klíšťatům.

Transkriptomické a diferenciální analýzy genové exprese slinných žláz ukázaly, že genom druhů klíšťat (např. R. microplus a Dermacentor andersoni) obsahuje proteinovou sekvenci nazvanou flagelliform hedvábný protein [36,37]. Charakterizace diferenciální genové exprese ve slinných žlázách R. microplus v reakci na infekci A. marginale zvýraznila molekulární mechanismy interakce klíštěte s patogenem. Následné funkční studie ukázaly, že flagelliform hedvábný protein (SILK) může hrát zásadní roli v infekci a množení A. marginale u klíšťat. Interakce mezi molekulami odvozenými od klíšťat a patogenů se účastní množení A. marginale v buňkách slinných žláz [36,38].

Po této studii bylo navrženo, že bičíkový hedvábný protein by mohl být vhodným kandidátem na antigen pro vývoj vakcíny. Pro tento účel Merino a kol. [14] produkovali rekombinantní bičíkovitý hedvábný protein a analyzovali jeho antigenní aktivitu injekcí do hostitele dobytka. Bylo zjištěno, že rekombinantní protein je vynikajícím antigenním kandidátem, protože poskytuje 62procentní ochranu proti napadení klíšťaty a infekci přenášenou klíšťaty (např. babeziózou) u skotu. Vakcinace bičíkovitým hedvábným proteinem snížila množení A. marginale u skotu. Titry protilátek specifických pro antigen korelovaly se sníženým zamořením klíšťaty a infekcí patogeny, což ukazuje, že účinek vakcíny je výsledkem protilátkové odpovědi.

Kromě toho byla exprese vakcinačních antigenů kódujících geny u klíšťat krmených skotem také ovlivněna vakcinací a koinfekcí A. marginale a B. bigemina. Zdá se tedy, že vakcíny využívající klíšťové proteiny, které se účastní interakcí vektor-patogen, mohou být účinné jak při kontrole napadení klíšťaty, tak při prevenci infekce patogeny současně [14].

Salp15 je imunosupresivní slinný protein I. scapularis s molekulovou hmotností 15 kDa, který inhibuje aktivaci CD4 plus T buněk, aktivitu komplementu, produkci cytokinů a funkci dendritických buněk v hostiteli [39–41]. Následné studie zkoumaly molekulární mechanismus Salp15. Vnější povrchový protein, OspC, je produkován B. burgdorferi na vnějším povrchu buňky. Produkce spirochet (B. burgdorferi spirochetes) ve středním střevě infikovaných klíšťat je zahájena, když se živí krví hostitele, která je následně transportována do hostitele.

Během výstupu ze slinných žláz a přenosu spirochet B. burgdorferi na hostitele Salp15 fyzicky interaguje s OspC na povrchu spirochet B. burgdorferi, což usnadňuje přežití spirochet, přenos patogenů a infekci hostitele [38,42 ]. Interakce Salp15–OspC tak může potenciálně zakrýt OspC před imunitní odpovědí hostitele, takže spirocheta je chráněna před imunitní odpovědí [38]. Nedávno byl k syntéze rekombinantního proteinu Salp15 použit expresní systém Escherichia coli a bylo zjištěno, že systém je účinný při produkci tohoto proteinu ve značném výtěžku s dobrou rozpustností. Tyto charakteristiky rekombinantního proteinu Salp15 naznačují, že má praktické využití a lze jej použít k vytvoření vakcín proti klíšťatům [41,43,44].

Metaloproteázy (MP) jsou multifunkční proteiny, které se účastní celé řady složitých fyziologických a patologických procesů v živých organismech [45]. U různých druhů klíšťat bylo identifikováno několik MP a jsou považovány za klíčové pro udržení funkcí souvisejících s krevní moučkou u klíšťat [46–49]. Například slinné žlázy klíšťat ixodidů obsahují MP, které jsou uznávány jako klíčové bioaktivní složky vitálních fyziologických funkcí, a proto se uvažuje o jejich použití jako potenciálních cílů v kontrolních strategiích boje proti těmto ektoparazitům [49]. Pro hodnocení antigenního potenciálu MPs Ali et al. (2015) [50] amplifikovali fragment sekvence kódující R. micro plus MP, exprimovali jej jako rekombinantní protein a purifikovanou formu tohoto proteinu použili jako vakcinační antigen proti R. microplus u skotu [50]. Rekombinantní protein R. micro plus MP prokázal celkovou účinnost 60 procent .

Kromě toho snížila počet krmených klíšťat, počet vyprodukovaných vajíček a počet vylíhnutých vajíček, což z ní činí [41] ideálního kandidáta pro vývoj vakcíny proti klíšťatům [50]. Pro další zkoumání vhodných kandidátů na antigen z R. microplus, Maruyama et al. [51] provedli studii RNA-seq na slinných žlázách ve všech fázích krmení R. microplus a detekovali fragment z transkriptomu, který byl podobný MP (Rm239) spolu s dalšími třemi geny, včetně Rm39, Rm76 a Rm180. . Aplikace těchto proteinů jako vakcíny ukázala, že všechny mohou inhibovat hemostatické reakce, potlačit protilátkové reakce hostitele a snížit schopnost klíštěte vázat se na hostitele pomocí cementového proteinu bohatého na glycin.

Autoři proto vyvinuli vícesložkovou vakcínu proti klíšťatům využívající tyto čtyři různé typy proteinů [51]. Imunizace skotu touto vícesložkovou vakcínou vedla ke snížení zamoření R. microplus o 73,2 procenta, což naznačuje, že formulace multiantigenové vakcíny proti klíšťatům může být účinnější než monokomponentní vakcíny [51].

Ribozomy, nazývané také továrny na bílkoviny, jsou součástí všech živých organismů. Bylo prokázáno, že ribozomální protein P{{0}} hraje klíčovou roli v regulaci translační aktivity ribozomů a pomáhá organismu přizpůsobit svůj metabolismus různým podmínkám prostředí. Patří do skupiny kyselých proteinů, které tvoří stonkovitou strukturu v největší ribozomové podjednotce ribozomu [52]. Existují důkazy, které ukazují, že sliny klíšťat obsahují ribozomální proteiny, které hrají roli při vyhýbání se obranným mechanismům hostitele [53–55]. Nedávno bylo oznámeno, že králíci očkovaní rekombinantním ribozomálním proteinem PO vykazovali silné humorální reakce, které primárně snižovaly línání nymf a reprodukci samic. Protein prokázal 57,5% ochranu proti napadení O. erraticus, ale neposkytoval zkříženou ochranu proti napadení africkým klíštětem Ornithodoros moubata [56].

V jiné studii vědci chemicky syntetizovali peptid 20 aminokyselin, který byl odvozen z ribozomálního proteinu P0 klíšťat Rhipicephalus, a úspěšně ho konjugovali s proteinem Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Megathura creulate slouží jako antigen proti R. microplus a vykazuje 96procentní účinnost u skotu [57]. V této studii výsledky naznačovaly, že P0 konjugovaný s KLH je vynikající vakcína. Výroba takové vakcíny však bude nákladná, a proto nemusí být pro hospodářská zvířata nákladově efektivní. Je proto nezbytné provést další výzkum rekombinantní produkce antigenní vakcíny, aby se vyhodnotila její účinnost a aby byla její výroba ekonomicky životaschopnější.

Inhibitory serinových proteáz: Pokusy o izolaci antigenů z druhů klíšťat identifikovaly některé inhibitory serinových proteináz (serpiny), u kterých se zdálo, že mají antigenní schopnosti. Serpiny se účastní různých fyziologických aktivit u zvířat, zejména u skotu, kde ovlivňují srážení krve, mění protrombinový čas a částečně aktivují tromboplastinový čas [58–60]. Serpiny zasahují do imunitního systému klíšťat a tím usnadňují počáteční proces krmení těchto parazitů [61]. Andreotti a kol. [62] izolovali a identifikovali R. micro plus trypsinové inhibitory (BmTI) z extraktů larev.

Pro hodnocení jeho antigenní aktivity byl křížený skot vakcinován BmTI, u kterého bylo zjištěno, že interferuje s migrací leukocytů v místě fixace larev [63,64]. Vakcinace telat antigeny BmTI výrazně snížila počet nahromaděných klíšťat a jejich hmotnost, což vedlo k 72,8% účinnosti proti R. microplus. Tato data naznačují, že imunizace BmTI může působit v rané fázi vývoje larev [65]. Aby se zjistilo, zda zkrácený BmTI může také vyvolat imunizaci, byl syntetizován N-terminální fragment BmTI a vykazoval nižší účinnost (18,4 procent) u skotu ve srovnání s proteinem plné délky.

Imunizace N-terminální doménou tedy není dostatečná ke zlepšení účinku BmTI na interakce hostitel-parazit [64]. Podobně, když byly rekombinantní inhibitory trypsinu R. microplus larvae (rRmLTI) použity jako test vakcíny, byla účinnost (32 procent) opět nízká, což naznačuje, že jak zkrácený, tak celý rekombinantní protein jsou méně účinné, pravděpodobně kvůli nedostatku přesné sbalení proteinu in vitro. Celkově tyto výsledky naznačují, že inhibitory trypsinu se zdají vhodnými kandidáty pro výrobu účinné vakcíny; je však třeba zlepšit způsob jejich výroby ve velkém měřítku, aby se zvýšila jejich účinnost [66]. Různé další serpiny byly vyhodnoceny jako možní kandidáti na vakcínu proti klíšťatům z různých druhů klíšťat, včetně Amblyomma americanum (AAS19), Haemaphysalis longicornis (HLS2), Rhipicephalus (Boophilus) microplus a tak dále. Všechny tyto serpiny prokázaly částečnou ochranu hostitele; úroveň ochrany se však může lišit podle druhu klíšťat a typu serpina [67–69].

Kombinace proteinů z jednoho nebo více klíšťat do jednoho polypeptidového řetězce představuje atraktivní strategii vakcinace proti klíšťatům. Proto mohou být inhibitory trypsinu/nebo serpiny kombinované s imunogenními fragmenty jiných klíšťových proteinů použity jako multiantigenní konstrukty. Například byl syntetizován chimérický protein obsahující rekombinantní antigen Bm86-Campo Grande (BmCG), rRmLTI a tepelně labilní enterotoxin B podjednotku z Escherichia coli (LTB) jako molekulární adjuvans. Tento chimérický antigen RmLTI–BmCG–LTB měl 55,6% účinnost proti R. microplus u skotu.

2.3. Midgut-Asociated Antigen Candidates

Feritinové proteiny jsou důležité pro fyziologické ukládání železa v netoxické, ale biologicky dostupné formě. Jsou klíčové pro metabolismus železa z přijímané krve během krmení klíšťat [70,71]. Dosud byly identifikovány a charakterizovány dvě molekuly feritinu (Ferritin 1 a Feritin 2). Feritin 1 (FER1) se nachází v buňkách, kde se podílí na fyziologickém ukládání železa.

Pro Feritin 2 (FER2) nejsou u obratlovců žádné funkční ortology. Je exprimován hlavně ve střevě a hraje klíčovou biologickou roli při transportu železa do slinných žláz a vaječníků [71]. Protein FER2 byl popsán u různých druhů klíšťat včetně D. variabilis, R. microplus, I. ricinus, Haemaphysalis longicornis a I. scapularis [71,72]. Na základě studií ztráty funkce FER2 je to slibný kandidát na vakcínu, protože suprese tohoto genu zhoršuje schopnost krmení klíšťat, snižuje ovipozici a snižuje líhnutí larev [71].

Kromě FER2 se FER1 ukázal jako vhodný kandidát na antigen pro kontrolu různých druhů klíšťat. Hajdusek a spol. testovali rekombinantní protein FER2 z R. microplus (RmFER2) k imunizaci dobytka a zjistili, že vakcína založená na FER2- vykazuje celkovou účinnost 64 procent [73]. Podobně byly k imunizaci králíků použity rekombinantní proteiny FER1 a FER2 z H. longicornis. Oba proteiny jsou vysoce imunogenní a indukují produkci hostitelských protilátek. Imunizace hostitele výrazně snížila nahromaděnou hmotnost napadených klíšťat a snížila počet vajíček a počet klíšťat se zcela vylíhnutými vejci. Rekombinantní FER2 však způsobil větší snížení s vyšší účinností (49 procent) než rekombinantní FER1 (34 procent) [72].

Nedávno Manjunathachar a spolupracovníci [74] uvedli, že tele očkované H. anatolicum FER2, přenašečem krymsko-konžské hemoragické horečky, bylo silně chráněno před napadením larvami (51,7 procenta) a dospělými (51,2 procenta) klíšťaty. stejně jako proti klíšťatům s FER2 sraženým RNAi. Mnoho dalších nedávných studií také potvrdilo, že FER2 poskytuje hostiteli významnou ochranu proti napadení klíšťaty použitím rekombinantního proteinu FER2 [75–77]. Molekulární mechanismus ochrany zahrnuje především produkci protilátek anti-FER2 v těle hostitele, které se během procesu krmení přenášejí do druhů klíšťat a protilátky anti-FER2 se vážou na FER2 uvnitř buněk střeva klíštěte nebo hemolymfy, čímž brání FER2 sestavení a/nebo funkce.

Nedávno bylo zjištěno, že předpokládané antigenní oblasti na proteinu FER2 jsou konzervované u různých druhů klíšťat. Tento protein lze tedy použít k výrobě vakcíny pro mezidruhovou ochranu [77]. V nedávné studii byly charakterizovány ortology FER2 u O. moubata (OMFER2) a O. erraticus (OEFer2) a výzkumníci zjistili, že mají vysokou sekvenční podobnost (85,3 procenta). Rekombinantní forma O. moubata Fer2 (tOMFER2) může vyvolat silné humorální reakce u králíků. U O. erraticus však tento protein nevykazuje žádný ochranný účinek, navzdory vysoké sekvenční podobnosti, což naznačuje, že nepatrný rozdíl v jejich sekvencích může určovat, zda mají či nemají ochranný účinek. Navzdory tomu výsledky této studie potvrzují, že OMFER2 má potenciál sloužit jako kandidát na antigen pro vakcíny [78].

TROSPA je klíšťový receptor, který je nezbytný pro kolonizaci spirochet v I. scapularis. Vnější povrchový protein A (OspA) B. burgdorferi je hojně produkován na těchto spirochetách a je kritický pro adhezi k vektoru prostřednictvím specifické vazby na TROSPA [79,80]. U různých druhů klíšťat, včetně R. microplus, I. scapulatus a R. annulatus, může TROSPA hrát roli v mechanismech infekce a množení patogenů Babesia. Kromě toho jsou vnější povrchové proteiny OspA a OspB exprimovány, když spirochety vstupují a sídlí v klíšťatech [81]. Jejich exprese je však během přenosu do hostitele potlačena, zatímco exprese OspC a bba52 jsou upregulovány. BBA52 má spolu s boreliovým proteinem OspC komplementární, ale nepodstatné role v procesu přenosu, protože všechny tyto antigeny jsou lokalizovány ve vnější membráně a koexprimovány v krmení klíšťat [82–84].

Biologická funkce receptoru není známa, ale vazba OspA na TROSPA je pro klíšťata nezbytná pro kolonizaci střeva klíštěte bakterií B. burgdorferi, která podporuje bakteriální infekci ve vektoru [79]. Infekce B. burgdorferi indukuje produkci konkrétních klíšťových genů (TROSPA a salp15), které mohou být zaměřeny na inhibici přenosu spirochét Borrelia a dalších mikrobů přenášených klíšťaty [80,85]. Blokování TROSPA antisérem TROSPA nebo prostřednictvím RNAi snižuje adherenci B. burgdorferi ke střevu I. lopatky, a tím snižuje bakteriální kolonizaci vektoru a potenciální přenos patogenu do hostitele [79]. V důsledku této interakce byla rekombinantní TROSPA analyzována u skotu jako antigenní vakcína ke kontrole napadení klíšťaty a přenosu patogenů, ale neovlivnila krmení klíšťaty ani plodnost [14].

Aquaporiny (AQP) nebo transmembránové vodní kanály hrají hlavní roli ve vodní homeostáze a kryoprotekci [86,87]. Jsou evolučně vysoce konzervativními členy větší rodiny hlavních vnitřních proteinů. Tvoří póry v buněčné membráně, které transportují vodu nebo jiné rozpuštěné látky [86,88,89]. Kromě transportu vody a malých neutrálních rozpuštěných látek se AQP účastní řady fyziologických procesů [90].

U klíšťat byly AQP popsány v trávicím traktu, Malpighiových tubulech a také ve slinných žlázách [91]. AQP snižují objem krve hostitele ve střevech klíšťat, což je důležitá fyziologická funkce, protože klíšťata požívají velké objemy krve v poměru k jejich velikosti a hmotnosti [62]. Fragment aquaporinu ze samic R. micro plus byl izolován a následně rekombinantně produkován a označen jako vakcína RmAQP1 [62]. Tato vakcína byla testována ve dvou pokusech pro dobytek na účinnost proti R. microplus a prokázala 68% a 75% účinnost. To naznačuje, že RmAQP1 může být potenciálním vakcinačním antigenem [62] a že aquaporiny mohou být použity ve vakcínách proti klíšťatům [62]. V nedávné studii o RmAQP2 stejného druhu bylo prokázáno, že skot očkovaný syntetickým peptidem extracelulárních domén RmAQP2 byl schopen snížit počet krmení klíšťaty až do jejich nasycení celkově o 25 procent, což naznačuje, že tento cíl (RmAQP2) může být užitečnou složkou vakcinačního koktejlu proti kousnutí klíštětem [92].

Další studie na I. ricinus potvrdila účinnost klíšťových AQP antigenů pro kontrolu zamoření klíšťaty tím, že prokázala účinek vakcinace IrAQP a CoAQP na larvy klíšťat I. ricinus u králíků. Účinnost vakcíny obsahující AQP konzervativní oblast přítomnou v CoAQP antigenu byla vyšší než u vakcíny IrAQP [93]. Kromě toho vakcinace syntetickými imunogenními peptidy odvozenými z Ornithodoros erraticus AQPs (OeAQP a OeAQP1) poskytla skotu významnou ochranu proti homolognímu druhu O. erraticus, ale mezidruhová ochrana proti Ornithodoros moubata byla nižší [94]. Kromě toho některé další studie také identifikovaly AQP z různých druhů, včetně klíšťat O. moubata a Ixodid, přičemž bioinformatické analýzy naznačují, že tyto AQP mají dobrý potenciál pro použití jako vakcína. K potvrzení antigenního potenciálu těchto AQP je proto zapotřebí dalších experimentálních důkazů [95,96].

I. ricinus je jedním z druhů klíšťat odpovědných za rostoucí prevalenci onemocnění přenášených klíšťaty u domácích zvířat v Evropě [4]. Účinek vakcín na bázi AQP na zamoření a línání larev I. ricinus by mohl vést ke snížení zamoření klíšťaty u očkovaných zvířat a podporuje to, že CoAQP by mohl být kandidátním ochranným antigenem pro kontrolu různých druhů klíšťat krmených na stejném hostiteli.

Studie využívající imunizaci expresní knihovnou proti myšímu modelu zamoření klíšťaty ukázala, že protein 4D8, později nazvaný subleasing (SUB), je potenciálním antigenem, který by mohl být použit jako vakcína proti I. scapularis [97]. Bylo zjištěno, že sekvence genu a proteinu SUB jsou konzervované u bezobratlých a obratlovců. Kromě toho byl tento gen identifikován a charakterizován u různých druhů klíšťat a bylo zjištěno, že je exprimován v různých vývojových stádiích a v různých tkáních dospělých klíšťat [98]. Vzhledem k široké distribuci SUB byl navržen jako dobrý kandidát na antigenní vakcínu. Antigenní potenciál SUB byl již dříve zkoumán u skotu pomocí rekombinantních proteinů a bylo zjištěno, že SUB může chránit (51% účinnost) proti klíšťatům.

Kromě toho kombinace SUB vakcinace a autocidní kontroly klíšťat po knockdown genu SUB u klíšťat krmených skotem pro kontrolu R. microplus dosáhla po léčbě 75% účinnosti [99 100]. Kromě toho Shakya a spolupracovníci produkovali rekombinantní SUB R. microplus a použili tento rekombinantní protein k imunizaci skotu. Tito přežvýkavci byli poté infikováni larvami R. microplus. Kromě toho byla hodnocena účinnost tohoto proteinu proti jinému geograficky odlišnému kmeni klíšťat. Účinnost rekombinantního SUB se pohybovala od 32,7 procenta do 44,1 procenta a indikovala vysokou sekvenční homologii mezi kmeny klíšťat z Mexika a Indie [101]. V jiné studii byl rekombinantní SUB syntetizován jako chimérický protein s MSP1a a následně aplikován na skot ke kontrole R. microplus.

Překvapivě tento chimérický protein prokázal 81procentní účinnost [102]. V důsledku úspěšných a slibných výsledků SUB aplikace byla testována kombinace tohoto antigenu s Bm86 a předpokládá se, že poskytne lepší výsledky, ale celková účinnost nepodporovala použití této kombinace jako vakcíny. I když se ukázalo, že vysoké hladiny specifických protilátek jsou aktivovány pro každý antigen, když jsou dva antigeny podávány současně, jsou rozděleny do různých formulací a použity na různých inokulačních místech u zvířete [103,104].

Glutathion S-transferázy (GST), dříve známé jako ligandiny, tvoří rodinu multifunkčních proteinů široce rozšířených v živočišné říši. Tyto enzymatické proteiny hrají roli v intracelulárním transportu, trávení, produkci prostaglandinů, detoxikaci endogenních i exogenních látek a obraně proti oxidativnímu stresu. Hladiny exprese GST jsou v organismech zvýšené, když jsou vystaveny insekticidům a akaricidům [105]. Králičí sérum obsahující polyklonální protilátky proti GST z R. microplus reagovalo s rekombinantní GST z H. longicornis a R. appendiculatus, což naznačuje, že klíšťové GST by mohly být složkou univerzální vakcíny, která chrání proti více než jednomu druhu klíšťat [106]. .

Na základě této předběžné studie Parizi a spolupracovníci (2011) izolovali GST z H. longicornis a vytvořili rekombinantní GST a použili jej k vakcinaci skotu proti R. microplus [107]. To chránilo skot proti R. micro plus s účinností 57 procent. Rekombinantní GST protein poskytoval částečnou zkříženou protektivní imunitu v hostiteli, což naznačuje, že proteinová ochranná kapacita GST není dostatečná, a proto se použití tohoto proteinu ve vakcíně s jedním antigenem nezdá být účinné v prevenci zamoření klíšťaty. 107].

For more information:1950477648nn@gmail.com