Rychlé současné stanovení šesti účinných složek v Cistanche Tubulosa pomocí blízké infračervené spektroskopie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang a Yuhai Guo

Abstraktní:

Kvantitativní stanovení více účinných složek v dané rostlině obvykle vyžaduje velmi velké množství autentických přírodních produktů. V této studii jsme navrhli rychlou a nedestruktivní metodu pro současné stanovení echinakosidu, verbascosidu, mannitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy vCistanche tubulosapomocí blízké infračervené spektroskopie (NIRS). Blízká infračervená difuzní reflektanční spektroskopie (DRS) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) byly provedeny na 116 dávkách vzorků Cistanche tubulosa. Data DRS byla zpracována pomocí standardních normálních variet (SNV) a metod multiplikativní korekce rozptylu (MSC). Částečná regrese nejmenších čtverců (PLSR) byla využita k sestavení kalibračních modelů pro složky zájmu u Cistanche tubulosa. Všechny modely byly poté hodnoceny výpočtem střední kvadratické chyby kalibrace (RMSEC), korelačního koeficientu kalibrace (r). Hodnoty r všech šesti kalibračních modelů byly stanoveny jako vyšší než 0,94, což naznačuje, že každý model je spolehlivý. Proto lze kvantitativní modely NIR uvedené v této studii kvalifikovat tak, aby přesně kvantifikovaly obsah šesti léčivých složek vCistanche tubulosa.

Klíčová slova: Cistanche tubulosa; vysokoúčinná kapalinová chromatografie; blízká infračervená spektroskopie; částečné nejmenší čtverce

Úvod

Cistanche(Hoffmg. Et Link) je vytrvalý fanerogamní rod rostlin z čeledi Orobanchaceae. Většina druhů patřících do rodu Cistanche se v Číně používá jako léčivá rostlina po tisíciletí; mít pověst vynikajícího tonika; a jsou známé jako "Ženšen pouští" [1,2].Cistanche tubulosaje obligátním parazitem kořenů vytrvalé rostliny Tamarix Chinensis. V čínském lékopisu je zdokumentován jako autentický zdroj Cistanches Herba (čínský název: Roucongrong) z vydání z roku 2005 [3]. Moderní farmakologický výzkum druhů Cistanche byl zahájen v 80. letech 20. století [4]. Farmakologické výzkumy ukázaly, že extrakty z rostlin Cistanche mají široké spektrum aktivit, jako je léčba nedostatku ledvin a stařecké zácpy, zlepšení schopnosti učit se a zapamatování, anti-Alzheimerova choroba, posílení imunity, proti stárnutí, proti únavě atd. [1,5–7]. V posledních třech desetiletích byly komplexní a systematické farmakologické studie kombinovány s fytochemickými výzkumy, aby objasnily materiální základ prospěšných účinků kořenů rostlin Cistanche. Tyto průzkumy naznačují, že fenylethanoidní glykosidy (PhGs) byly hlavními účinnými složkami rostlin Cistanche, které hrají klíčovou roli při léčbě ledvinové nedostatečnosti, impotence [8], proti stárnutí [9] a proti Alzheimerově chorobě [10]. Obsah dvou PhG (echinakosid a verbascosid) byl požadován v čínském lékopisu. Mezitím sacharidy, jako je mannitol, sacharóza, glukóza a fruktóza v rostlinách Cistanche, mají projímavou funkci a sacharidové shluky rostlin Cistanche byly použity k léčbě zácpy [11].

Divoké zdrojeCistanche tubulosajsou distribuovány hlavně v oblasti kolem pouště Taklamakan v jižní autonomní oblasti Xinjiang v Číně. Podobně jako mnoho jiných druhů používaných jako tradiční čínská léčiva (TCM) má C. tubulosa velkou ekonomickou hodnotu a ve svém volném prostředí téměř vyhynula kvůli nadměrnému sběru. Pěstování C. tubulosa začalo v 90. letech 20. století v Číně, aby se zajistily dodávky surovin pro Cistanches Herba a také se chránily zdroje volně žijících rostlin. Od roku 2017 existuje v prefektuře Hotan v Sin-ťiangu téměř 13 tisíc ha kultivované C. tubulosa [12,13]. Požaduje se pokrok v technologii výsadby, rozšíření pěstování a zlepšení kvalityCistanche tubulosa.

Primární účel kultivaceCistanche tubulosaje vyrábět Cistanches Herba, která je bohatá na tyto účinné složky. Obsah účinných složek v Cistanches Herba, jako jsou PhGs a oligosacharidy, však může být při výrobě významně ovlivněn mnoha faktory [12,13]. Měl by být prozkoumán systém detekce kvality C. tubulosa v reálném čase. Proto je nutné vyvinout vysoce výkonnou metodu, která plně naplní požadavek analýzy velkého počtu vzorků v krátkém časovém období. Tradičně se stanovení těchto primárních účinných složek, jako jsou PhG a sacharidy, u C. tubulosa obvykle dosahovalo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) [14,15]. Přestože je přesný a spolehlivý, je časově náročný a pracný pro sběr a zpracování dat. Kromě toho je také zapotřebí velké množství času a úsilí pro přípravu vzorků, která obvykle zahrnuje pulverizaci, extrakci a filtraci testů HPLC. Pro získání relativně velkého množství dat je proto potřeba jasný princip a snadno ovladatelný nástroj. Naštěstí se blízko-infračervená spektroskopie (NIRS) široce používá k hodnocení zemědělských produktů [16], potravin [17], lékařských vzorků [18] a farmaceutických produktů [19], protože je rychlá a nedestruktivní. Proto by NIRS mohla přesně odpovídat požadavkům na účinná měření TCM a není překvapivé, že NIRS byla použita pro kvalitativní identifikaci [20,21] a kvantifikaci sloučenin [22] v TCM.

V této studii byl obsah šesti účinných složek, včetně echinakosidu, verbascosidu, manitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy ve 116 šaržích vzorků C. tubulosa, které byly odebrány z prefektury Hotan v Xinjiang v letech 2013–2015, nejprve stanoven pomocí HPLC. Poté byly vytvořeny kalibrační modely těchto šesti komponent metodou parciální regrese nejmenších čtverců (PLSR). Tyto modely byly následně validovány s korelačním koeficientem a chybami predikce v kalibračních sadách. Výsledky ukázaly, že vyvinutou metodu lze použít jako spolehlivou metodu pro kvantitativní analýzu C. tubulosa.

Výsledek

HPLC analýza

Obsahy echinakosidu a verbascosidu byly stanoveny dobře definovanou metodou HPLC-UV v literatuře [3,23] a čtyři sacharidy (mannitol, sacharóza, glukóza a fruktóza) byly stanoveny dobře definovanou metodou HPLC-ELSD v literaturu [24] pro všech 116 vzorků. Příprava vzorků a metody stanovení byly popsány v částech 3.1 a 3.3. Obrázek 1 ukazuje charakteristické chromatogramy směsných standardů. Je vidět, že všech šest účinných složek bylo odděleno od základní linie, a proto je bylo možné kvantifikovat. Před testováním vzorku byla validována metoda HPLC. Hlavní výsledky metody HPLC jsou uvedeny v tabulce 1. Příznivý lineární vztah (r=0.9998) a výtěžnost (98,5 procenta) metody stanovení echinakosidu jsou uvedeny ve výsledcích, stejný výsledek jako u všech pět složek. Obsah šesti účinných složek lze tedy určit přesně. Všechna stanovená rozmezí obsahu jsou shrnuta v tabulce 1.

Analýza NIRS

Obrázek 2 ukazuje NIR spektra (4000–10,000 cm−1) vzorků C. tubulosa. U všech vzorků se objevily významné absorpční píky od 4000 cm−1 do 7500 cm−1, zatímco mírné výkyvy se objevily od 7500 cm−1 do 10 000 cm−1. K posunu základní linie NIR spekter došlo, protože vzorek byl snadno ovlivněn faktory, jako je velikost částic a barva (obrázek 2A). Ke snížení vlivu zbytečných informací do určité míry byly použity matematické předúpravy spekter. Matematické předběžné úpravy zahrnovaly první derivaci (1. derivace), druhou derivaci (2. derivaci), standardní normální varietu (SNV) a multiplikativní korekci rozptylu (MSC). Obrázek 2B ukazuje 2. derivaci NIR spekter C. tubulosa a zjevně jsou pozorovány významné variace, ke kterým došlo ve třech oblastech, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 a 7000–7500 cm−1. .

Vytvoření kvantitativních kalibračních modelů

Částečná regrese nejmenších čtverců (PLSR) je klasická modelovací metoda a je široce používána v kvantitativních modelech kvůli vysoké kvalitě výsledků. Mezi výhody PLSR patří dobrá předpovědní schopnost a relativní jednoduchost. PLSR se také široce používá při vytváření kvantitativních kalibračních modelů TCM [25]. Na základě předem upravených spekter NIR a modelu kvantitativní analýzy NIR pro šest účinných složek v C. tubulosa byl vytvořen pomocí metody PLSR s daty HPLC analýzy jako skutečnými hodnotami. 116 vzorků bylo náhodně rozděleno do kalibračních a validačních sad v poměru 3:1. Jako nejvhodnější podmínky pro kalibraci byly zvoleny nízké RMSEC a vysoký korelační koeficient.

Výběr vlnového pásma pro kalibrační modely

Výběr vhodného vlnového pásma byl důležitým krokem pro stavbu kalibračních modelů. V této studii byla porovnána NIR intervalová spektra 4000–7500 cm-1 (doporučeno softwarem TQ analytik) a 4000–10 000 cm-1. Bylo pozorováno, že tento rozsah nebyl vhodný pro kalibraci v intervalu mezi 4000 cm-1 a 7500 cm-1 z tabulky 2. Proto v současné studii byly spektrální intervaly pro šest chemických složek všechny vybrané z intervalu od 4 000 do 10 000 cm-1 porovnáním výkonu RMSEC a korelačního koeficientu.

Výběr optimálního počtu faktorů pro kalibrační modely

PLSR vysvětluje maximální množství variability v datech snížením rozměrů dat spekter výpočtem faktorů. Problém „nedostatečnosti“ se objevil kvůli nedostatečným informacím, které vyplývaly z omezeného počtu faktorů; avšak výběr faktorů větších než optimální hodnoty zavedené v modelu způsobí problém "převybavení". „Nevybavenost“ nebo „převybavenost“ sníží prediktivní schopnost zavedených modelů [22]. Obrázek 3 ukazuje vztah mezi RMSECV a faktory pro všech šest sloučenin. Proto jsme vybrali ty faktory, které odpovídají nejnižším hodnotám RMSECV. Optimální výběr faktorů pro kalibrační modely je uveden v tabulce 3.

Výběr spektrální předúpravy pro kalibrační modely

Dalším nejkritičtějším ovlivňujícím faktorem pro kalibrační modely je spektrální předúprava, která je zaměřena na snížení vlivu rozptylu a základního driftu, zvýšení poměru signálu k šumu a odstranění nepravidelných variací. K eliminaci obvyklého vlivu rozptylu záření byly použity metody multiplikativní korekce rozptylu (MSC) a standardní normální variace (SNV). Pro řešení vlivů driftu základní linie byla porovnána spektra 1. a 2. derivace a byla vybrána 2. derivace [26]. Pro požadovaný efekt jsme spektra před derivací vyhladili pomocí algoritmu Savitzky–Golay (SG) filtru, abychom zabránili zvětšení šumu. Tabulka 3 ukazuje informace o spektrální předúpravě a její výsledky pro kalibrační modely.

Hodnocení zavedených modelů

Dobrý kalibrační model NIRS by měl mít nízké hodnoty RMSEC a RMSEP, stejně jako vysoký korelační koeficient (r) a malé rozdíly mezi RMSEC a RMSEP [27–29]. Kalibrační modely šesti vybraných sloučenin byly vytvořeny podle postupů uvedených výše (tabulka 3). Hodnoty RMSEC a r pro kalibrační sadu echinakosidu byly 27,6 a 0,9808, v daném pořadí. Výkonnostní parametry ostatních modelů chemických sloučenin jsou uvedeny v tabulce 3, ze které můžeme usoudit, že zavedené modely poskytují uspokojivé výsledky predikce a lze je použít pro rychlou kvantitativní analýzu C. tubulosa. Rozptylové grafy šesti chemických sloučenin jsou znázorněny na obrázku 4, aby byly kalibrační modely popisnější a pozorované vizuálně. Jak ukazuje obrázek 4, mezi prediktivními a naměřenými hodnotami došlo k menším rozdílům, protože většina bodů byla rozmístěna kolem regresní křivky s rovnicí jako y=x. Proto byly na obrázku 4 pozorovány vynikající prediktivní výkony.

Materiály a metody

Příprava vzorků

V letech 2013 až 2015 bylo odebráno 111 vzorků C. tubulosa z prefektury Hotan v autonomní oblasti Sin-ťiang. Všechny vzorky byly kultivovány, ale byly odebrány v různých fázích růstu. Čerstvá hmotnost vzorků se pohybovala od 20 g do 1000 g. Po vysušení na slunci byly vysušené vzorky rozdrceny a prosety přes 60-síto [3,23].

NIR spektroskopický sběr dat

NIR spektra vzorků byla sbírána v intervalu 8 cm-1 ve spektrální oblasti 4000–10 000 cm-1 pomocí systému Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) vybavené ručním adaptérem pro odraz optických vláken. Každé spektrum bylo získáno průměrováním 64 skenů. Všechny vzorky byly před skenováním NIR spekter ponechány ekvilibrovat na pokojovou teplotu (25 °C), aby se zajistilo, že vzorky byly analyzovány při stejné teplotě. Vlhkost v laboratoři byla udržována na okolní úrovni.

Sběr dat HPLC

Příprava extrakce

Jeden gram prášku C. tubulosa byl extrahován 50 ml 50% methanolu v kónické baňce s ultrazvukem (500 W, 40 kHz) po dobu 30 minut. Extrakt byl skladován při 4 ◦C. Supernatant extraktu byl filtrován, aby se získal vzorek pro HPLC analýzu [3,23].

Současné stanovení echinacosidu a verbascosidu s HPLC-UV

Kapalinová chromatografická analýza byla provedena na systému Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) sestávajícím ze dvou jednotek pro dodávání rozpouštědla LC-20ADXR, čerpadla LC-20AD a vzorkovače SIL-20ACXRauto , kolonová pec CTO-20AC, detektor SPD-M20A DAD, odplyňovač DGU-20A3R a ovladač ICBM-20A.

Kolona Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) použitá pro chromatografické separace byla udržována při 35 °C. Mobilní fáze sestávala z acetonitrilu (A) a 0,1% vodné kyseliny mravenčí (B) a byla dodávána podle gradientového programu takto: 0–7 min, lineární gradient 10–20 procenta A; 7–15 min, 20 procent A; a 15–20 min, lineární gradient 20–10 procent A. Druhá rychlost mobilní fáze byla 0,4 ml/min. UV monitorování bylo prováděno při 330 nm.

Současné stanovení mannitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy pomocí HPLC-ELSD

HPLC byla provedena na systému Agilent 1100 series LC (Palo Alto, CA, USA) sestávajícím z odplyňovače aG1322A, kvartérního čerpadla G1311A, autosampleru G1311A, regulátoru teploty kolony G1316A a detektoru G1315B DAD.

Pro chromatografické separace byla použita kolona Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 x 25 0 mm, 5 um) a udržována při teplotě kolony 25 °C. Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu a vody (77:23, obj./obj.) a isokraticky se přiváděla rychlostí 0,7 ml/min. Výtok byl monitorován pomocí evaporative light scattering detector (ELSD) s přednastavenými parametry [23,24].

Zpracování dat

TQ Analyst (verze 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) byl použit k rozdělení kalibračních a validačních sad, matematické předúpravě spekter, sestavení kalibračních modelů a dalším výpočtům. K výrobě figurek byl použit Origin (verze 9.1).

Závěry

Poděkování: Tato práce byla podpořena Národním projektem plánování vědy a technologie Číny (2015BAD29B00-04).

Příspěvky autora: Xinhong Wang vymyslel a navrhl experimenty. Xinhong Wang a Xiaoguang Wang provedli experimenty. Xinhong Wang a Yuhai Guo napsali noviny.

Střet zájmů: Autoři prohlašují, že neexistují žádné střety zájmů.

Reference

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analýza chemických složek v cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma pěstovaná jako nová plodina v Číně. Genet. Resour. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Editace výboru čínského lékopisu. Chinese Pharmacopoeia, 2005. vydání; Chemical Industrial Press: Peking, Čína, 2005; Svazek 1, str. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Složky cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Píseň, ZH; Lei, L.; Tu, PF Pokroky ve výzkumu farmakologické aktivity u rostlin cistanche huffing. Et odkaz. Brada. Tradice. Bylina. Drogy 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidační účinky fenylethanoidů z Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Býk. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Výzkum účinku fenylethanoidních glykosidů (PEG) z Cistanche deserticola na anti-aging u starých myší vyvolaný D-galaktózou. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Farmakologické studie na Cistanchis Herba. I. Účinky složek Cistanchis Herba na sex a chování při učení u chronicky stresovaných myší. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Aktivní složky proti stárnutí z bylin a nutraceutik používaných v tradiční čínské medicíně: farmakologické mechanismy a důsledky pro objevování léků. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotektivní účinky herbaterapie cistanches na pacienty se středně těžkou Alzheimerovou chorobou. Evid. Založený doplněk. Alternativní. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ŽL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Studie o laxativních složkách v Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; a kol. Kultivační techniky Cistanche tubulosa a jejího hostitele Tamarix spp. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Rozvoj ekologického průmyslu cistanches herba pro podporu ekologické civilizace západní pouštní oblasti. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Kvantitativní analýza cistanches herba pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s detekcí diodového pole a hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením v kombinaci s chemometrickými metodami. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molekuly 2017, 22, 843 9 z 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciace bylinek otiskem prstu s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-detekce diodového pole-hmotnostní spektrometrie. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---