Kvantitativní proteomická analýza pacientů s COVID{0}}: Fetuin-A a tetranektin jako potenciální modulátory vrozených imunitních odpovědí

ABSTRAKTNÍ

Léčba závažných případů koronavirového onemocnění 2019 (COVID-19) je nesmírně důležitá pro minimalizaci úmrtí a poškození koncových orgánů. Zde jsme provedli proteomickou analýzu vzorků plazmy od pacientů s mírným, středně těžkým a těžkým COVID-19. Analýza odhalila rozdílně exprimované proteiny a různé terapeutické potenciální cíle související s vrozenými imunitními odpověďmi, jako je fetuin-A, vitronektin (TN) a paraoxonáza-1 (PON1). Kromě toho změny proteinů v plazmě ukázaly dysregulaci komplementu a koagulačních kaskád u pacientů s COVID-19 ve srovnání se zdravými kontrolami. Závěrem lze říci, že naše proteomická data naznačovala fetuin-A a TN jako potenciální cíle, které by mohly být použity k diagnostice, stejně jako signatury pro lepší pochopení patogeneze onemocnění COVID{9}}.

Koncové orgány označují tkáně nebo orgány, které konečně dokončují specifické funkce v lidském těle, jako jsou játra, ledviny a plíce. Poškození těchto orgánů může vést k řadě závažných onemocnění, jako je chronické onemocnění ledvin, cirhóza jater a chronická obstrukční plicní nemoc. Imunita označuje imunitní odpověď organismu na cizí patogenní mikroorganismy a tkáně. Imunita organismu zůstává normální, což může zabránit vzniku a dalšímu zhoršování onemocnění. Poškození koncových orgánů tedy úzce souvisí s imunitou a jejich vzájemným působením ovlivňují imunitní funkce lidského těla.

Poškození koncových orgánů může vést k poškození počtu a kvality imunitních buněk v těle. Například u pacientů s onemocněním jater se objeví leukopenie, abnormální funkce jater a snížená syntéza protilátek, což je učiní náchylnějšími k infekci po onemocnění; snížená funkce ledvin povede k urémii. Syndrom, anémie, osteoporóza a další nemoci, tyto faktory ovlivní i imunitní funkce těla. Na druhou stranu imunitní reakce těla může ovlivnit i koncové orgány, například nadměrná imunitní reakce může vést k imunitní hepatitidě nebo anafylaktickému zápalu plic. Souhra poškození koncových orgánů a imunitní dysfunkce činí tělo náchylnější k nemocem a zkracuje jeho životnost.

Proto je udržení normální funkce koncových orgánů a robustní imunitní funkce klíčem k udržení dobrého zdraví. Lidé by měli předcházet poškození koncových orgánů správnou životosprávou, jako je zdravá strava, správné cvičení a relaxace, a udržovat normální imunitní funkce aktivní prevencí a léčbou nemocí. Je vidět, že si na imunitu musíme dávat pozor. Cistanche může zlepšit imunitu a účinek je dobrý. Polysacharidy v mase mohou regulovat imunitní odpověď lidského imunitního systému, zlepšovat stresovou schopnost imunitních buněk a posilovat imunitní buňky. baktericidní účinek.

Klikněte na zdravotní přínosy cistanche

1. Úvod

Těžký akutní respirační syndrom, koronavirus 2 (SARS-CoV-2), způsobil koronavirové onemocnění 2019 (COVID-19) [1]. Onemocnění COVID{6}} je charakterizováno různými klinickými fenotypy od asymptomatických, mírných a středně těžkých až po extrémně závažné, charakterizované těžkým zápalem plic a vysokým rizikem úmrtí u starší populace, zejména u pacientů starších 70 let [ 2,3]. Vakcíny byly vyrobeny koncem roku 2020 a většina lidí na celém světě byla očkována alespoň 2 dávkami. Přes pokles počtu nakažených i hlášených závažných případů není problém dosud vyřešen a příčina progrese onemocnění do těžkého stavu zůstává neznámá. Kromě toho se SARS-CoV-2 stejně jako jiné viry v průběhu času mění a nové varianty mohou mít modifikaci původních vlastností, jako je šíření a související závažnost onemocnění, a mohou být menší (omikronová varianta) [4] nebo více (delta varianta) [5] těžký. Potenciální vznik nových variant je stále možný a pochopení mechanismu cest za onemocněním COVID-19 je velmi kritické.

Je dobře známo, že dysfunkce imunitních odpovědí je hlavním problémem proti odstranění viru a zotavení z nemoci. Kromě toho jsou vrozené imunitní odpovědi považovány za klíčové faktory při modulaci progrese onemocnění směrem k asymptomatickým, mírným, středně těžkým, těžkým nebo extrémně závažným klinickým fenotypům [6,7]. Neutrofily a monocyty/makrofágy jsou zásadními obrannými prvky první linie, které řídí vrozené imunitní reakce během infekce [8,9]. Spike protein SARS-CoV{5}} může aktivovat makrofágy přímo prostřednictvím receptoru ACE2 přítomného v těchto buňkách [10].

Během infekce imunitní buňky uvolňují několik proteinů, cytokinů a mediátorů, aby regulovaly zánět a udržovaly fyziologickou homeostázu těla. Proteomika založená na plazmě je praktický přístup k analýze proteinových profilů a třídění změn spojených s patofyziologickými stavy nebo progresí onemocnění [11]. Byly provedeny různé proteomické studie k identifikaci a charakterizaci profilů proteomů v různých kohortách COVID-19 pomocí tkání [12,13], buněk [14] nebo plazmy [15,16]. Proto jsme použili proteomiku založenou na plazmě k identifikaci potenciálních proteinů spojených s vrozeným imunitním systémem, které jsou relevantní pro onemocnění COVID{10}} a progresi závažnosti. Naším cílem je studovat vzorec exprese plazmatických proteinů u zdravých pacientů a pacientů infikovaných COVID{11}}a vyhodnotit potenciální interakci s vrozenými imunitními reakcemi.

2. Výsledky

2.1. Plazmatické proteomické profily

Aby bylo možné posoudit reakce hostitele na SARS-CoV-2, byla provedena plazmatická proteomická analýza kohorty pacientů s COVID-19 a zdravých kontrol. V naší studii byla metoda iTRAQ 4plex pečlivě vybrána oproti jiným proteomicky značeným metodám kvůli vysoké reprodukovatelnosti a pokrytí proteomem [17]. Navíc jsme pro lepší hloubku celkového pokrytí proteomu zkombinovali silnou frakcionaci katexových peptidů do iTRAQ. Ilustrace pracovního postupu studie je uvedena na obr. 1. Celkem 176 proteinů bylo identifikováno ve všech COVID-19 a zdravých kontrolních vzorcích plazmy s falešnou mírou objevení<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1,20 pro upregulaci a<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Výsledky ukázaly, že počet proteinů, které se měnily mezi skupinami srovnání, se měnil, jak je ukázáno na obr. 2a. Srovnávací výsledky ukázaly, že 27 procent rozdílně exprimovaných měření proteinů se překrývá ve všech třech skupinách (obr. 2b). Vennův diagram také ukázal, že počet jedinečných proteinů v párovém soucitu mírné versus kontroly má vyšší číslo ve srovnání s jinými skupinami. To nemusí nutně odrážet rozdíly na úrovni identifikace proteinu, ale na kvantitativní úrovni s ohledem na to, že statistická kritéria byla vybrána pro násobek změny a p-hodnoty. Aby bylo možné posoudit, zda lze odlišně exprimovaná měření proteinů pro všechna srovnání rozlišit mezi skupinami COVID-19 či nikoli, byla použita analýza PCA. Je zajímavé, že výsledky ukázaly, že mezi skupinami COVID-19 byl jasný rozdíl, jak je znázorněno na obr. 3. Kromě toho byly odlišně exprimované proteiny prezentovány vytvořením sopečného grafu pro všechna párová srovnání zdravé kontroly versus COVID{{{{101} 7}} skupiny (obr. 4). Některé z odlišně exprimovaných proteinů v našem souboru dat byly dříve hlášeny jako biomarkery pro COVID-19 [16,18].

Analýza genové ontologie a dráhy pomocí online nástroje 'STRING' byla provedena na rozdílně exprimovaných měřeních proteinů pro zdravou kontrolu a pacienty s COVID {{0}} bez ohledu na skupinu, ve které jsou. Pro analýzu obohacení go byla většina Bylo zjištěno, že rozdílně exprimovaných proteinů se účastní biologické regulace, extracelulární oblasti a regulátoru molekulární funkce pro biologický proces, buněčného komplementu a molekulární funkce (doplňkový materiál, obr. S1). Dále jsme studovali rozdílně exprimované proteiny a jejich zapojení do analýzy dráhy pomocí databáze KEGG. Statistická kritéria analýzy obohacení byla zvolena tak, aby byla p < 0,01 a pořadí podmínek dráhy bylo založeno na násobku obohacení, jak je uvedeno v doplňkovém materiálu (obr. S2). V průběhu infekce iniciují poškozené a mrtvé buňky velké imunitní reakce a uvolňují různé buněčné složky a endotoxiny, které aktivují kaskádu srážení krve [19]. Aktivace těchto drah vede k endoteliální dysfunkci a zánětu, stejně jako ke stimulaci migrace leukocytů a tkáňové infiltraci, čímž spouští aktivaci vrozených imunitních lokálních odpovědí [20]. V naší studii bylo zjištěno, že systém komplementu, který je centrálním modulátorem vrozené imunity a drah koagulační kaskády, je nejvýznamnějším z ostatních termínů dráhy. Několik proteomických studií na plazmě pacientů s COVID-19 ukázalo, že komplementové a koagulační kaskády byly jednou z nejvíce obohacených cest [21,22]. Naše diskuse se však zaměřuje na tři proteiny fetuin-A, TN a PON-1 jako potenciální nové cíle zapojené do vrozených imunitních odpovědí na infekci SARS-COV-2 a závažnost COVID{{{101} 14}} nemoc.

2.2. Plazmatické hladiny TNF jsou spojeny s příznaky onemocnění COVID-19

Cytokinová bouře vyvolaná Sars-CoV2 je jedním ze znaků závažných případů onemocnění COVID-19 [23]. Bylo hlášeno, že nadměrné uvolňování TNF je spojeno se závažností a špatnou prognózou pacientů s onemocněním COVID-19 [24,25]. V naší studii měření plazmatických hladin TNF ukázalo očekávaný nárůst u COVID-19 skupin ve srovnání se zdravými kontrolami, což potvrdilo další zvýšení u těžkých vzorků ve srovnání se středně nebo mírnými vzorky.\

3. Diskuse

Ke zkoumání změny ve vzorcích séra/plazmy COVID{0}} bylo použito několik necílených proteomických studií. Počet identifikovaných proteinů z těchto studií se liší kvůli různým metodám, které byly použity. Kvantifikace bez označení využívající metodu akvizice nezávislou na datech vykazovala vyšší pokrytí plazmatickým proteomem [26]. Pro proteomický přístup založený na značení prokázala kvantifikační metoda TMT založená na LC-MS/MS Orbitrap vyšší pokrytí proteomem v plazmě/séru s počtem identifikovaných proteinů dosahujícím 900 [27]. V naší studii byl celkový počet identifikovaných proteinů 176, což je velmi blízké dvěma publikovaným studiím, které používaly stejný hmotnostní analyzátor (TripleTOF), kde bylo identifikováno 179 a 189 proteinů [28,29]. Cirkulující proteiny v plazmě pacientů s COVID-19 představují okno pro detekci postupu a závažnosti onemocnění, stejně jako podpis zánětu a vrozených a adaptivních imunitních odpovědí.

Produkce a nadměrné uvolňování prozánětlivých cytokinů jsou považovány za klíčový bod při posunu klinického fenotypu ze středně těžkého na těžký stav u pacientů s COVID-19. V průběhu infekce jsou vrozené imunitní odpovědi modulovány molekulárními vzory spojenými s poškozením (DAMPs) nebo molekulárními vzory spojenými s patogeny (PAMPs) [30]. Proteiny akutní fáze (APP), jako je fetuin-A, jsou systematicky uvolňovány v plazmě, aby podpořily protizánětlivý proces během zánětu. V naší studii pozorujeme jasnou down-regulaci plasmatického fetuinu-A u středně těžkých a těžkých případů ve srovnání se zdravými kontrolami (obr. 4). Bylo prokázáno, že fetuin-A může inhibovat časné (TNF, IL{11}}, IL{12}} a INF) a pozdní (HMGB1) mediátory uvolňované vrozenými imunitními buňkami, jako jsou makrofágy [31]. Analýza TNF v naší kohortě COVID{15}} ukazuje trend nárůstu plazmatické koncentrace ve srovnání se zdravými dárci, kteří jsou v těžkých případech více potencováni (doplňkový materiál, obr. S3). Během zánětu aktivované monocyty/makrofágy uvolňují prozánětlivé cytokiny, které jsou oslabeny všudypřítomným biogenním aminem zvaným spermin [32]. Avšak protizánětlivé účinky sperminu jsou závislé na fetuinu-A. Spermin tedy nemohl inhibovat funkci buněk s deficitem monocytů/makrofágů fetuin-A [33]. Kromě toho může pokles hladiny fetuinu-A souviset s vaskulárními abnormalitami a trombózou zjištěnou v extrémně závažných případech v důsledku zvýšení vaskulární kalcifikace a endoteliální dysfunkce [34,35] a oxidačního stresu [36] spojeného s hladinami fetuinu-A .

Po virové infekci je apoptóza buněk jedním z obranných mechanismů hostitele. Nadměrná akumulace apoptotických buněk z důvodu defektů apoptotické buněčné clearance je však spojena s hyperinflamací a autoimunitou [37]. Snížení plazmatické hladiny fetuinu-A by se mohlo alespoň částečně podílet na tomto procesu, protože zvyšuje kapacitu fagocytózy čistit apoptotické buňky makrofágy [38] a vezikuly pomocí VSMC [39].

Nedávno bylo publikováno, že fetuin-A hraje klíčovou roli nejen jako inhibitor kalcifikace, ale jako multiprotektivní složka tím, že snižuje fibrózu a zánět a moduluje polarizaci makrofágů [40].

Rudloff a kol. prokázali, že fetuin-A je cílový gen HIF, který má ochrannou roli při dysfunkci ledvin vyvolané hypoxií [40]. Fetuin-A zmírňuje přetížení makrofágů vápníkem v důsledku hypoxie. Nedávno jsme prokázali, že spike protein SARS-CoV-2 koronaviru aktivuje -1-podobné makrofágy a zvyšuje intracelulární hladiny vápníku [41]; tedy fetuin-A může hrát roli lapače vápníku při regulaci buněčné homeostázy a modulaci adekvátní polarizace pro rozumné vrozené imunitní reakce, čímž se zabrání nadměrnému zánětu.

Syndromy multiorgánové dysfunkce (MODS) nebo MODS související s infekcí jsou považovány za jednu z hlavních příčin úmrtí u závažných případů COVID-19 [42]. Hyperzánět a imunitní dysregulace během infekce vedou k poškození koncových orgánů v důsledku selhání vrozené imunitní odpovědi a hypercytokinemie. Při systémové infekci jsou bakteriální endotoxiny a virové RNA rozpoznány vrozeným imunitním systémem, který spouští expresi a uvolňování časných cytokinů (TNF a INF). Kromě toho vrozené imunitní reakce v první linii stimulují produkci pozdních mediátorů, jako je například skupina 1 s vysokou mobilitou (HMGB1) [43]. Intracelulární nebo extracelulární HMGB1 exprimovaný ve většině buněk je alarmin uvolněný po stimulaci nebo po smrti buňky [44]. Nadměrné uvolňování HMGB1 spouští produkci cytokinů, jako je IL-6 [45]. Zvýšená koncentrace IL-6 byla spojena se závažnými následky u multisystémového zánětlivého syndromu u dětí (MIS-C) souvisejícího s infekcí SARS-CoV-2 [46]. IL-6 je vylučován hlavně monocyty/makrofágy, když je polarizován na fenotyp podobný M{20}}. Bylo také prokázáno, že HMGB1 může polarizovat makrofágy prostřednictvím Toll-like receptoru (TLR) 4 [47].

Tetranektin (CLEC3B) je jedním z HMGB 1-vazebných proteinů a jeho interakce může modulovat biologickou funkci a zánětlivý proces během infekce. Vysoce purifikovaný TN protein inhiboval uvolňování HMGB1 indukované LPS v makrofázích v závislosti na dávce [48]. Dysregulace vrozeného imunitního systému vedoucí k nadměrné aktivaci imunity je běžnou budoucností závažných případů COVID-19 a sepse. Nedávno bylo prokázáno, že koncentrace vitronektinu v krvi je dramaticky snížena u pacientů s extrémně těžkou sepsí [48]. Nedávno Yuming Li a kol. [49] popsali downregulaci vitronektinu u těžkých případů pacientů s COVID{10}} pomocí metody kvantitativní proteomiky bez označení. Významný plazmatický pokles tohoto proteinu jsme potvrdili v naší studii (obr. 4) s různými skupinami a na základě značící kvantitativní metody. Vitronektin lze tedy považovat za potenciální marker vrozené imunitní dysregulace spojené se závažností symptomů COVID{14}}.

Tetranektin je zapojen do systému fibrinolýzy, což vede ke kontrole abnormální koagulace; downregulace TN je tedy spojena s kardiovaskulárními onemocněními, jako je onemocnění koronárních tepen (CAD) [50]. Pozoruhodné je, že mnoho závažných případů pacientů infikovaných SARS-COV-2 vykazuje vaskulární dysfunkci pravděpodobně způsobenou nedostatkem TN. Pokles hladiny TN v séru je doprovázen snížením paraoxonázy 1 (PON1) u různých kardiovaskulárních onemocnění. V naší studii by down-regulace PON1 (obr. 4) mohla být markerem progrese onemocnění k závažným symptomům, protože bylo hlášeno, že přítomnost zánětu a oxidačního stresu je spojena s poklesem PON1 v séru u kardiovaskulárních onemocnění [51]. . Nízká hladina PON1 může navíc zhoršit vrozenou prozánětlivou reakci na virovou infekci, protože bylo prokázáno, že PON1 potlačuje nadměrnou reakci makrofágů a udržuje zánět při ateroskleróze [52]. Dysregulace TN má vliv na AMPK downstream efektory, jako je HIF1, který reguluje fenotyp a funkci vrozených imunitních buněk a moduluje polarizaci makrofágů směrem k fenotypu podobnému M1-, stejně jako maturaci DC [53,54].

Souhrnně může být downregulace vitronektinu, fetuinu-A a PON1 pozorovaná u středně těžkých a těžkých případů spojena s dysregulací vrozených imunitních odpovědí prostřednictvím dysfunkce monocytů/makrofágů, což vede k nadměrnému uvolňování cytokinů a progresi COVID{4} } onemocnění až těžký stav.

Navíc naše proteomická analýza odhalila up-regulaci APOE (doplňkový materiál, obr. S4) v závažných případech ve srovnání se zdravými kontrolami. Je známo, že plazmatické hladiny APOE modulují funkci lipoproteinů a kardio-metabolická onemocnění. Kromě toho se APOE účastní zánětlivého procesu změnou polarizace makrofágů a ovlivněním pro-/protizánětlivých fenotypů [55]. V souladu s tím bylo hlášeno, že zvýšení hladin APOE může souviset se závažností COVID-19 [56].

V průběhu infekce je interakce makrofág-komplementový systém důležitá pro vrozené imunitní odpovědi, stejně jako modulaci funkcí komplementu a přechod z vrozených na adaptivní imunitní stavy [57]. Interaktivita komponent komplementu s různými receptory na makrofázích řídí zánětlivý proces a produkci cytokinů. V různých proteomických studiích bylo hlášeno, že dysregulace kaskády komplementu [58,59]u pacientů s COVID-19 a že aktivace systému komplementu zesiluje v závažných případech cytotoxicitu T-buněk [60]. Zaznamenali jsme významný nárůst komplementů 1q, 5, 6, 7 (doplňkový materiál, obr. S5) u středně těžkých a těžkých pacientů s COVID-19. Během procesu apoptotické buněčné clearance C1q řídí polarizaci monocytů/makrofágů a inhibuje aktivitu zánětu [61]. Analýza obohacování prokázala významnou souvislost mezi složkami komplementu C1q, C5, C6, C7 a koagulačními kaskádami, kde nacházíme i zapojení kalikrein-kininového systému prostřednictvím kininogenu-1, který moduluje vrozené imunitní reakce prostřednictvím bradykininové dráhy.

Tato studie má omezení, pokud jde o velikost vzorku. Naše výsledky však prokázaly dobrou shodu s předchozími proteomickými studiemi covid{0}}, kde jsme identifikovali biomarkery, které vykazují podobný projev. To ukazuje, že proteomický přístup použitý v této studii je platný, ale možná není optimální.

4. Závěr

Během infekce SARS-COV-2 je porucha imunitních reakcí hlavním problémem, který vede k eskalaci onemocnění COVID-19 do závažných případů. Mechanické cesty vedoucí k vrozené imunitní dysfunkci jsou klíčovými kameny při řešení komplikací spojených s nekontrolovanou infekcí SARS-CoV-2. Pokud je nám známo, toto je první studie, která využívá přístup iTRAQ u vzorků plazmy/séra COVID-19. Sérové ​​hladiny TN, fetuinu-A a PON1 jsou potenciálními markery, které se alespoň částečně podílejí na vrozeném imunitním systému, konkrétně na hyperaktivaci makrofágů, a v důsledku toho by mohly být považovány za potenciální cíle léčby COVID-19.

5. Materiály a metody

5.1. Design studie a populace

Naše studijní kohorty zahrnují 25 subjektů: Zdravá kontrola (n=5) a 20 pacientů infikovaných SARS-COV-2 seskupených podle závažnosti onemocnění (obr. 1) do mírných (n=5) , Střední (n=5), Vážné (n=5) ​​a Mrtvé (n=5). Mrtvá skupina byla od začátku studie vyloučena kvůli komorbiditám subjektů, které by mohly ovlivnit specifičnost účinků COVID{10}}. Všichni pacienti byli přijati v dětské nemocnici King Abdallah Specialist Children's Hospital (KASCH) a King Abdulaziz Medical City (KAMC). Informovaný souhlas podepsali všichni účastníci při vyplňování dotazníku o klinických příznacích a demografických údajích.

Odběr krve: Od každého pacienta bylo odebráno 3–5 ml žilní krve. Zkumavky EDTA byly použity pro odběr vzorků krve; poté byla plazma oddělena centrifugací před skladováním při 80 °C pro další analýzu.

5.2. Příprava vzorku proteomické plazmy iTRAQ

Pět biologických vzorků z každé skupiny bylo spojeno do jednoho vzorku. Všechny vzorky plazmy byly poté podrobeny kazetám Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin, aby se z plazmy odstranilo 14 nejhojnějších proteinů podle výrobního protokolu (Agilent, USA). Poté byly proteinové digesty označeny pomocí reagencií 4-plex iTRAQ (Sciex, Kanada) podle výrobního protokolu s malými úpravami. Stručně řečeno, 100 ug proteinů bylo denaturováno, redukováno a alkylováno za použití 8 M močoviny/100 mM triethylamonium bikarbonátu (TEAB), 50 mM Tris (2-karboxyethyl) fosfinu (TCEP) a methylmethanthiosulfonátu (MMTS). Vzorky proteinů byly poté štěpeny na peptidy pomocí trypsinu v poměru 1:40 (trypsin k proteinu). Následně byly vzorky peptidů označeny 114, 115, 116 a 117 pro zdravou kontrolu, těžkou, střední a mírnou. Všechny 4 označené vzorky byly poté smíchány a spojeny do jednoho vzorku.

5.3. Frakcionace a odsolování peptidů

Shromážděný vzorek iTRAQ byl frakcionován offline na základě kationtové výměny pomocí spinové kolony Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, rotační kolona byla nejprve kondicionována pomocí {{0}},1 procenta kyseliny mravenčí, poté následovalo nanesení značených peptidů do kolony. Byly provedeny dva kroky promývání za použití 0,1% kyseliny mravenčí. Peptidy byly poté eluovány do 22 frakcí změnou poměru 10 procent koncentrace acetonitrilu a mravenčanu amonného z 15 mM na 900 mM. Následně byl proveden krok odsolování a čištění pomocí polymerního sorbentu s reverzní fází za použití Oasis HLB Cartridge (Waters, USA). Stručně řečeno, patrona byla kondicionována a ekvilibrována acetonitrilem a 0,1% kyselinou mravenčí. Poté byly naneseny značené peptidy a byly aplikovány dva kroky promytí 0,1% kyselinou mravenčí. Eluce peptidů byla provedena za použití 70% acetonitrilu.

5.4. NanoLC-MS/MS

Každá frakce (celkem 22) byla nanesena na Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA), spojený s TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Kanada) v triplikátech. Separace peptidů na NanoLC byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [41]. MS1 a MS/MS pro analýzu iTRAQ byly nastaveny následovně: Rozsah hmotnosti TOF 250–1500 s dobou akumulace 0,25 s. Kritéria IDA byla pro ionty vyšší než 400 m/z se stavem nabití 2–5. Práh hojnosti přesahuje 200 cps. Upravený CE při kontrole parametru činidla iTRAQ. Parametry iontového zdroje byly nastaveny následovně: iontový zdroj plynu 1 (GS1), 25; Clonový plyn (CUR), 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF), 2250; Teplota ohřívače rozhraní (HIT), 60.

5.5. iTRAQ kvantitativní proteomická analýza

Nezpracovaná data MS iTRAQ byla zpracována pomocí softwaru ProteinPilot (v 4.5, Sciex) pro identifikaci a kvantifikaci. Parametry byly nastaveny následovně: typ vzorku, iTRAQ 4plex, Cys, Alkylace, MMTS, Digesce, Trypsin, Speciální faktory, Denaturace močoviny, Druhy, Homo sapiens, Databáze, databáze UniProt Proteome Humans (staženo 29. října 2019); globální FDR byla zkontrolována.

Změna násobku a p-hodnota byly vypočteny na základě průměru intenzity peptidu a Studentova t-testu, v daném pořadí. Data iTRAQ MS byla uložena v ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) s identifikátorem PXD037400.

5.6. Bioinformatická analýza

Analýza PCA byla provedena pomocí 'hlavní' funkce ve statistickém softwaru R. VolcaNoseR [62] byl použit pro vytvoření grafů sopek. Online nástroj STRING [63] byl použit pro genové obohacení a analýzu dráhy se statistickými kritérii nastavenými na p < 0,05. Pro analýzu dráhy byla použita databáze Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

5.7. Měření ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays).

Vzorky byly připraveny, jak bylo popsáno dříve [64] s použitím faktoru nekrózy nádorů (TNF-) a testovací soupravy ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Stručně řečeno, 100 ul vzorků nebo standardů bylo přidáno do každé jamky a poté inkubováno při 37 °C po dobu 1 h 30 min. Po čtyřnásobném promytí promývacím pufrem byla přidána detekční protilátka konjugovaná s biotinem (100 ul) před inkubací po dobu 1 hodiny při 37 °C. Byl proveden druhý promývací krok (čtyřikrát) a před inkubací po dobu 30 minut byl přidán Streptavidin-HRP (100 ul). Po promytí byl přidán roztok substrátu (TMB) (100 ul) a inkubován po dobu 15 minut ve tmě před přidáním zastavovacího roztoku a měření absorbance bylo detekováno při 450 nm.

Financování

Tento článek byl podpořen grantem King Abdullah International Research Center č. RC20/153/R a RC20/205/R a BioBank KAIMRC NGHA.

Etický souhlas a souhlas s účastí

Tato studie byla schválena Institutional Review Board (IRB) Etického výboru King Abdullah International Medical Research Center (KAIMRC) s IRB RC20/153/R a RC20/205/R. Od všech účastníků studie byl získán písemný informovaný souhlas.

Příspěvky autorů

BA: Vymyslel a navrhl experimenty a analyzoval a interpretoval data. FAM, H⋅S, KA a HA: Provedly se experimenty. FA, HSA a MR: Analýza a interpretace dat. FA, MJ, AH a MB: Přispěli reagenciemi, materiály, analytickými nástroji nebo daty a napsali referát. TB: Vymyslel a navrhl experimenty a analyzoval a interpretoval data.

Prohlášení o dostupnosti dat

Data spojená s touto studií byla uložena na Data iTRAQ MS byla uložena v ProteomeXchange Consortium s identifikátorem PXD037400.

Prohlášení Deklarace zájmu

Autoři prohlašují, že nemají žádné známé konkurenční finanční zájmy nebo osobní vztahy, které by se mohly zdát ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.

Poděkování

Autoři oceňují číslo projektu Researchers Supporting Project (RSP{0}}/17) na Univerzitě krále Sauda, ​​Rijád, Saúdská Arábie.

Reference

[1] M. Almutlaq, et al., Klasický a kontraregulační systém renin-angiotensin: potenciální klíčové role v patofyziologii COVID-19, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli a kol., Untargeted lipidomics odhaluje specifické lipidové profily u pacientů s COVID-19 s různou závažností z regionu Campania (Itálie), J. Pharm. Biomed. Anální. 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang a kol., Lidské genetické a imunologické determinanty kritické pneumonie COVID{1}}, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello a kol., Infekce SARS-CoV-2 variantou Omicron je spojena s méně závažným onemocněním u hospitalizovaných pacientů s COVID-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff, et al., Infections with the SARS-CoV-2 Delta Variants vykazují čtyřnásobně zvýšenou virovou zátěž v horních cestách dýchacích ve srovnání s Alfa nebo non-varianty, které jsou předmětem zájmu, Sci. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 a lidský vrozený imunitní systém, Cell 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz, et al., Buněčný povrch SARS-CoV-2 nukleokapsidový protein moduluje vrozenou a adaptivní imunitu, Sci. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso, et al., Fyzikální interakce s bakteriemi a protozoálními parazity zakládají scavenger receptor SSC4D jako širokospektrální receptor pro rozpoznávání vzorů, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei a kol., Deficit EDIL3 zlepšuje nepříznivou srdeční remodelaci neutrofilními extracelulárními pastmi (NET) zprostředkovanou polarizací makrofágů, Cardiovasc. Res. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao a kol., Spike Protein of SARS-CoV-2 Aktivuje makrofágy a přispívá k indukci akutních zánětů plic u myší, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel a kol., Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii: stávající schopnosti a budoucí směry, Chem. Soc. Rev. 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang a kol., Proteomická a metabolomická charakterizace SARS-CoV-2-infikovaných makaků cynomolgus v rané fázi, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie a kol., Multiorgánová proteomická krajina autopsií COVID{2}}, Cell 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon, et al., Mapa interakce proteinů SARS-CoV-2 odhaluje cíle pro přeměnu léčiva, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, CO-M.-oBACEa a CO-M.-oBA Consortium, krevní atlas COVID-19 definuje charakteristické znaky závažnosti a specifičnosti onemocnění, Cell 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed a kol., Longitudinal plasma proteomics analysis odhaluje nové kandidátní biomarkery u akutního COVID-19, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] TM Casey, et al., Analýza reprodukovatelnosti pokrytí proteomem a kvantifikace pomocí izobarických hmotnostních značek (iTRAQ a TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] T. Shu a kol., Plasma proteomics identifikuje biomarkery a patogenezi COVID-19, Imunita 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Sterilní zánět: snímání a reakce na poškození, Nat. Rev. Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Vrozená imunita a koagulace, J. Thromb. Hemostáza 9 (Suppl 1) (2011) 182–188.

[21] J. Park a kol., Hloubková analýza profilování krevních proteomů odhalila odlišné funkční charakteristiky plazmatických proteinů u pacientů s těžkým a nezávažným COVID-19, Sci. Rep. 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner, et al., Ultra-high-throughput klinická proteomika odhaluje klasifikátory infekce COVID-19, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang a kol., Klinické rysy pacientů infikovaných novým koronavirem z roku 2019 ve Wuhanu, Čína, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] DM Del Valle, et al., Signatura zánětlivého cytokinu předpovídá závažnost a přežití COVID-19, Nat. Med. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos a kol., Vysoké hladiny TNF-alfa u pacientů s COVID-19 refrakterním na tocilizumab, Eur. J. Cancer 149 (2021) 102–104.

[26] H. Li a kol., Plazmová proteomická a metabolomická charakterizace pacientů, kteří přežili COVID-19 6 měsíců po propuštění, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen a kol., Proteomická a metabolomická charakterizace séra pacientů s COVID{1}}, Cell 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] J. Sarif a kol., Plazmatický gradient rozpustného receptoru aktivátoru plazminogenu typu urokinázy je spojen s patogenním plazmatickým proteomem a imunitním transkriptomem a stratifikuje výsledky u těžkého COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar, et al., Charakterizace kvantitativní sérovou proteomikou prognostických biomarkerů souvisejících s imunitou pro symptomatologii COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Protizánětlivá role fetuinu-A při poranění a infekci, Curr. Mol. Med. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] W. Li, et al., Jaterní protein, fetuin-A, zaujímá ochrannou roli při letálním systémovém zánětu, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Regulace aktivace makrofágů a zánětu sperminem: nová kapitola starého příběhu, Crit. Care Med. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang a kol., Fetuin chrání plod před TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler a kol., Asociace nízkých koncentrací fetuinu-A (AHSG) v séru s kardiovaskulární mortalitou u pacientů na dialýze: průřezová studie, Lancet 361 (9360) (2003) 827–833.

[35] K. Caglar a kol., Koncentrace fetuinu v séru a endoteliální dysfunkce u chronického onemocnění ledvin, Nephron Clin. Praxe. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A má ochranný účinek proti experimentálně vyvolané střevní ischemii/reperfuzi potlačením autofagické buněčné smrti, Exp. Biol. Med. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Clearance apoptotických buněk: základní biologie a terapeutický potenciál, Nat. Rev. Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alfa2-glykoprotein HS zvyšuje fagocytózu apoptotických buněk a makropinocytózu lidskými makrofágy, Clin. Sci. (Londýn.) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds a kol., Multifunkční role pro sérový protein fetuin-a při inhibici kalcifikace buněk hladkého svalstva lidských cév, J. Am. Soc. Nephrol. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff a kol., Fetuin-A je cíl HIF, který zajišťuje integritu tkáně během hypoxického stresu, Nat. Commun. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi a kol., SARS-CoV-2 koronavirem vyvolaná apoptóza, zánětlivé a oxidační stresové reakce u THP-1-podobných makrofágů: potenciální role enzymu konvertujícího angiotenzin inhibitor (perindopril), Přední. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade a kol., Načasování a příčiny úmrtí u pacientů s těžkým COVID-19, Crit. Care 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu a kol., Endogenní regulace a farmakologická modulace uvolňování a působení HMGB1 vyvolaného sepsí: aktualizovaný přehled, Cells 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Cílení na zánět řízený HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Elevace prozánětlivého cytokinu HMGB1 v synoviální tekutině pacientů s Legg-calve-perthes nemocí a korelace s IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com