Kvantifikace degenerace neuritů se zvýšenou přesností a účinností v modelu Parkinsonovy choroby in vitro, část 2

Výsledek

Vytvoření modelu buněčné kultury degenerace neuritů spojené s PD

K vývoji metody pro zkoumání degenerace neuritů v modelu buněčné kultury PD jsme použili kultivované buňky LUHMES, populaci podmíněně imortalizovaných lidských mesencefalických buněk. Po diferenciaci se buňky LUHMES stanou postmitotické, přijmou profil genové exprese charakteristický pro zralé dopaminergní neurony a vyvinou se neuronální morfologie s neurity, které dosahují délky až 500 mm (obr. 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer a kol., 2021).

Neurodegenerace, stav, kdy nervové buňky mutují nebo odumírají, úzce souvisí s pamětí. V modelech buněčných kultur můžeme řídit kultivační podmínky, abychom zmírnili expresi neurodegenerace a zlepšili tak výkonnost paměti.

Studie ukázaly, že homeostáza nervových buněk hraje důležitou roli v přežití buněk a funkci systému. Stabilitu buněk můžeme zlepšit kontrolou faktorů, jako jsou živiny a růstové faktory v kultivačním médiu. Zároveň dbejte na udržování čistoty a kontroly teploty kultivačního prostředí, aby nedocházelo k narušování a poškozování buněk prostředím.

Kromě toho v modelu buněčné kultury můžeme také injektovat určité sloučeniny nebo léky do buněk, abychom snížili expresi neuromodulace, a tím zlepšili míru přežití a paměťovou výkonnost buněk. Tato technika je také široce používána při studiu neurodegenerativních onemocnění.

Stručně řečeno, neurodegenerace má důležitý dopad na buněčnou stabilitu a funkci systému a technologie buněčné kultury je dobrou modelovou výzkumnou metodou, která může provádět hloubkový průzkum a výzkum vztahu mezi neurodegenerací a pamětí. Výkon neuromodulace můžeme zmírnit kultivací kontroly prostředí, injekčním podáváním léků do buněk atd., abychom zlepšili přežití buněk a výkonnost paměti a poskytli komplexnější základ pro studium neurodegenerativních onemocnění. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche dokáže výrazně zlepšit naši paměť, protože Cistanche dokáže také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů, které jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může maso také zlepšit průtok krve a podpořit dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostane dostatečnou výživu a energii, čímž se zlepší vitalita a vytrvalost mozku.

Klikněte na vědět doplňky pro zlepšení paměti

Vzhledem k lepším optickým vlastnostem skla ve srovnání s plastem byly kultury založeny na skleněných podložních sklíčkách obsahujících osm komor s médiem. Na základě předchozích zpráv (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014) jsme se nejprve pokusili založit kultury na komorových sklíčkách potažených PLO a fibronektinem; nicméně takové kultury vykazovaly deficit adheze a nízkou životaschopnost. V důsledku toho jsme testovali, zda by potažení dalšími substráty zlepšilo životaschopnost buněčných kultur LUHMES usazených na skleněných površích.

Buněčné kultury LUHMES byly založeny na sklíčkách, které byly buď nepotažené nebo potažené PLO a fibronektinem, PDL a lamininem, nebo kombinací všech čtyř substrátů. Analýza životaschopných jader fluorescenční mikroskopií odhalila, že potahování sklíček významně ovlivnilo životaschopnost kultur [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], přičemž post hoc vícenásobné srovnávací analýzy odhalily, že sklíčka potažené kombinací všech čtyř výše uvedených substrátů poskytují významně vyšší míru životaschopných buněk ve srovnání se sklíčky potaženými pouze PLO a fibronektinem (p= 0.0437; obr. 1B, C).

Po identifikaci optimálních povlakových substrátů pro kultivaci buněk LUHMES na skleněných podložních sklíčkách jsme hodnotili účinky buněčné hustoty na vhodnost kultur pro měření degenerace neuritů. Buňky LUHMES byly kultivovány v diferenciačním médiu s hustotou nanesení 57 500 buněk na jamku, 115, 000 buněk na jamku nebo 230, 000 buněk na jamku, a pátý den diferenciace byly buňky byly fixovány 4% PFA a zobrazeny mikroskopií s fázovým kontrastem.

Hustota 57 500 buněk na jamku vedla ke kulturám se špatně propojenými neurity a nepravidelnou morfologií neuritů, zatímco kultury vytvořené s hustotou 230,{3}} buněk, přestože byly životaschopné, obsahovaly hustoty neuritů příliš vysoké pro přesné měření neuritů. Střední hustota buněk 115, 000 buněk na jamku poskytla vysokou životaschopnost a dobře oddělené axonové dráhy, které napomáhaly přesným měřením degenerace neuritů (obr. 1D).

Abychom modelovali degeneraci neuritů související s PD in vitro, vystavili jsme diferencované buňky LUHMES 6-OHDA, široce používanému neurotoxinu, který podporuje oxidační stres a degeneraci katecholaminergních neuronů (Bové a Perier, 2012). Vystavení diferencovaných buněk LUHMES působení 6-OHDA podpořilo na dávce závislé zvýšení degenerace neuritů, přičemž 5,0 mM 6-OHDA a 7,5 mM 6-OHDA vyvolaly středně těžkou a těžkou degeneraci neuritů (obr. 2F). Ke kvantifikaci degenerace neuritů v kulturách buněk LUHMES vystavených 6-OHDA jsme použili široce citovanou metodu, ve které jsou snímky kultur s fázovým kontrastem binarizovány, buněčná těla ze snímků jsou digitálně odstraněna a algoritmus analyzátoru částic ImageJ se používá k měření oblasti fragmentů neuritů. Fragmentované oblasti neuritů se pak sečtou a vydělí celkovou plochou neuritů, aby se určila DI (obr. 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler a kol., 2019).

Jak se očekávalo, expozice diferencovaných buněk LUHMES působení 6- OHDA způsobila na dávce závislé zvýšení DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; obr. 2G). Během analýz buněk vystavených 6-OHDA jsme však pozorovali několik problémů, které zřejmě negativně ovlivňují přesnost a účinnost měření DI. Snažili jsme se tedy optimalizovat tuto běžnou metodu pro provádění měření DI, kterou dále nazýváme tradiční metodou DI, abychom vytvořili protokol umožňující efektivnější měření fragmentace neuritů.

Snížení umělé fragmentace spojené s binarizací mikrofotografie

Při použití tradiční metody DI jsme často pozorovali problém, kdy se intaktní neurity v obrazech s fázovým kontrastem jevily jako fragmentované v odpovídajícím binarizovaném obrazu (obr. 3A). Tato umělá fragmentace postihovala především neurity s nízkou prominencí. Zkoumali jsme tedy, zda by bylo možné problém snížit postupy, které zvyšují kontrast obrazu. Abychom zlepšili kontrast obrazu, nejprve jsme zachytili obrazy neuritů pomocí různých intenzit světla, abychom určili úroveň jasu obrazu, která by vytvořila optimální kontrast.

Snímky zachycené s optimální intenzitou světla byly poté podrobeny dalšímu vylepšení kontrastu pomocí ImageJ k aplikaci LUT s minimálními a maximálními hodnotami intenzity 90 a 205. Začlenění těchto vylepšení kontrastu poskytlo mírně přesnější reprezentaci neuritů v binarizovaných obrazech generovaných z obrazů s fázovým kontrastem (obr. 3B). Nicméně kvantitativní analýza binarizovaných obrazů zdravých neuritů ukázala, že zvýšení kontrastu významně nesnížilo umělou fragmentaci (p=0,9999; obr. 3D). Dále jsme tedy zkoumali, zda by použití imunofluorescenčního zobrazování poskytlo obrazy s vynikajícím kontrastem a tím usnadnilo produkci přesnějších binarizovaných obrazů neuritů se sníženou umělou fragmentací.

Sklíčka popsaná na obrázku 2, obsahující fixované buňky LUHMES vystavené různým koncentracím 6- OHDA, byla imunobarvena na cytoskeletální protein b III-tubulin, zobrazena pomocí fluorescenční mikroskopie a analyzována zaslepeným výzkumníkem na umělou fragmentaci (obr. 3C). Kvantitativní analýza binarizovaných snímků získaných z fluorescenčních mikrosnímků a odpovídajících mikrosnímků s fázovým kontrastem odhalila, že typ mikroskopie ovlivnil úrovně umělé fragmentace [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Konkrétně fluorescenční mikrofotografie produkovaly binarizované obrazy s významně sníženou umělou fragmentací ve srovnání s mikrofotografiemi s fázovým kontrastem (p=0,0016; obr. 3D).

Výsledkem bylo, že snímky zdravých kultur poskytly výrazně nižší skóre DI, když byly použity fluorescenční mikrofotografie namísto mikrofotografie s fázovým kontrastem (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; obr. 3E). Kromě toho je pozoruhodným celkovým trendem to, že násobek změny mezi průměrnými hodnotami DI spojenými se zdravými kulturami (ošetřené vehikulem) a kulturami vykazujícími degeneraci neuritů (ošetřené 5,0 nebo 7,5 mM 6-OHDA) byl větší při měření pomocí fluorescenčních mikrografů než při získání z mikrofotografie s fázovým kontrastem (obr. 3E). K tomu došlo navzdory fluorescenčním mikrosnímkům kultur se střední degenerací neuritů (indukovaných expozicí 5 mM 6-OHDA), které mají výrazně nižší skóre DI než odpovídající fázové snímky kvůli snížení umělé fragmentace (p=0,0001 , d=0.6312).

Optimalizace parametrů pro detekci fragmentovaných a celkových neuritů
Tradiční metoda provádění měření DI zahrnuje použití pluginu Analyze Particles pro ImageJ s parametry velikosti 20 10,000 pixelů k detekci fragmentů neuritů. Zjistili jsme však, že velká část neuritových fragmentů nebyla při použití těchto široce citovaných parametrů analyzátorem částic detekována (Shin a kol., 2012; Di Stefano a kol., 2015; Sasaki a kol., 2016; Loreto a kol. , 2020; Shin a Cho, 2020) k měření degenerace neuritů na mikrofotografiích s fázovým kontrastem buněk LUHMES vystavených 6-OHDA, vytvořených tak, jak je popsáno na obrázku 2.

Znovu jsme tedy analyzovali snímky z tohoto souboru dat pomocí různých limitů minimální velikosti pro detekci částic, abychom určili optimální parametry pro identifikaci fragmentů neuritů. Z kvalitativního hodnocení binarizovaných snímků generovaných z mikrosnímků s fázovým kontrastem, parametry velikosti 5–10000 pixelů zlepšily detekci fragmentů neuritů, ale byly také spojeny se špatnou identifikací šumu na pozadí, artefaktů obrazu nebo jiných malých neneuritový materiál jako fragmenty neuritů. Ve srovnání s široce používanými parametry 20–10,000 pixelů však parametry 10–10,{10}} pixelů zlepšily detekci fragmentů neuritů bez znatelně velkého nárůstu falešně pozitivních výsledků (obr. 4A , vlevo, odjet).

Podobné analýzy byly také provedeny s binarizovanými snímky získanými z fluorescenčních mikrografů buněk LUHMES imunoznačených pro b III-tubulin. Parametry velikosti analyzátoru částic 5–10,000 pixelů usnadnily nejcitlivější detekci fragmentů neuritů, a protože fluorescenční mikrofotografie obsahovaly méně malých úlomků, tyto parametry znatelně nezvýšily chybnou identifikaci neneuritového materiálu jako fragmentů neuritů (Obr. 4A, vpravo).

Tradiční metoda pro provádění měření DI pomocí parametrů velikosti analyzátoru částic 20–10,000 pixelů vylučuje z měření fragmentů neuritů objekty menší než 20 pixelů.

Takové malé objekty jsou však typicky chybně zahrnuty do měření celkové plochy neuritů, protože tradiční metoda měření DI zahrnuje výpočet celkové plochy neuritů sečtením všech černých pixelů v binarizovaných obrazech. K překonání tohoto problému jsme použili plugin Particle Remover pro ImageJ, který napsal vývojář ImageJ Wayne Rasband, k odstranění malých objektů bez neuritů z binarizovaných obrázků. Aplikace tohoto pluginu při provádění měření DI pomocí mikrosnímků s fázovým kontrastem buněk LUHMES vystavených působení 6-OHDA, vytvořených tak, jak je popsáno na obrázku 2, vedla k významnému nárůstu měření DI napříč všemi koncentracemi expozice neurotoxinu (F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Kromě toho významná interakce ukázala, že zvýšení DI způsobené použitím odstraňovače částic zesílilo při vyšších koncentracích (F(1,881,15,05)=59,97, p=0,0001, R{ {8}}.0094, obr. 4B, C). Také jsme zobrazili stejná sklíčka buněk fluorescenční mikroskopií a hodnotili účinky odstranění malých částic na měření DI získaná z fluorescenčních mikrografů. Zatímco odstranění malých částic poskytuje hodnoty DI, které jsou teoreticky přesnější, tyto hodnoty se v průměru významně nelišily od hodnot získaných bez použití pluginu pro odstraňování částic při měření pomocí fluorescenčních mikrografů (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; obr. 4D).

Automatizace DI měření z fluorescenčních mikrosnímků

Provádění DI měření pomocí tradiční metody vyžaduje zdlouhavé a časově náročné zpracování obrazu, použití nástroje od ruky k digitálnímu odstranění jednotlivých buněčných těl a měření fragmentovaných oblastí neuritů a celkových neuritů z každého snímku. Snažili jsme se tedy zvýšit efektivitu metody napsáním makra, které plně automatizuje DI analýzy. Pro automatizaci odstranění soma provádí makro s názvem ANDI binarizaci obrazů buněčných jader, označených pomocí jaderného barviva DAPI, následovanou úpravou binarizovaného obrazu tak, že prahové jaderné oblasti jsou zvětšeny tak, aby zahrnovaly celou oblast soma. Takové obrazy s binarizovanými a zvětšenými jádry jsou pak odečteny z odpovídajících fluorescenčních mikrofotografií neuronů imunoznačených pro b III-tubulin, čímž se vytvoří obraz výhradně obsahující neurity (obr. 5A, B).

Aby se přizpůsobily proměnlivé velikosti jader způsobené smršťováním nebo fragmentací jádra spojenou s neurodegenerací, jsou binarizované obrazy jader zvětšeny kombinací dilatací a erozí, které kombinují jaderné fragmenty a rozšiřují binarizované oblasti tak, aby zabíraly plochu větší než somas diferencovaných buněk LUHMES. . Obrazy obsahující výhradně neurity jsou pak binarizovány a podrobeny DI analýze prostřednictvím řady automatických funkcí (obr. 5C, D). Abychom vyhodnotili přesnost makro operací spojených s odstraněním soma z obrázků, porovnali jsme skóre DI získané po ručním odstranění buněčných těl z fluorescenčních mikrosnímků pomocí nástroje ImageJ od ruky (jak bylo dříve znázorněno na obr. 4D) se skóre DI. generované z analýz identických snímků po automatizovaném odstranění buněčného těla pomocí operací odstranění soma, které jsou součástí ANDI Macro. Naše analýzy odhalily, že skóre DI vypočítané pomocí automatického odstranění buněčného těla korelovalo téměř identicky s měřeními DI získanými ze snímků podrobených manuálnímu odstranění soma (r(34)=0,980, p, 0,0001; Obr. 5E).

Pro zvýšení přesnosti analýz jsme začlenili několik dříve popsaných úprav, které zlepšují měření DI do ANDI. Makro obsahuje operace vylepšení kontrastu, použití pluginu Particle Remover k odstranění neneuritové hmoty ze snímků neuritů a nejaderné hmoty ze snímků jader a detekci fragmentů neuritů pomocí parametrů velikosti 5–10,000 pro plugin Analyze Particles.

Předpokládali jsme, že k přesnějšímu měření degenerace neuritů společně přispěje použití fluorescenční mikroskopie, operace zvýšení kontrastu, odstranění malých předmětů pomocí odstraňovače částic a optimalizované parametry pro detekci částic. Pro testování této hypotézy byly snímky s fázovým kontrastem buněk LUHMES vystavených různým koncentracím 6-OHDA, vytvořené tak, jak je popsáno na obrázku 2, analyzovány slepým a subjektivním skórováním s použitím rozmezí hodnot mezi 0. 0 a 1.0, přičemž hodnoty představují zdánlivý podíl fragmentované oblasti neuritů. Poté jsme vyhodnotili korelaci mezi subjektivními skóre a měřeními DI získanými tradiční metodou a také korelaci mezi subjektivními skóre a měřeními DI získanými pomocí ANDI Macro.

Zatímco měření DI získaná pomocí tradiční metody korelovala se subjektivními skóre (r {{0}}.7850, p,0.0001; obr. 5F), makro ANDI poskytlo měření, která mnohem silněji korelovala se subjektivními hodnoceními (r 2=0,978, p, 0,0001; obr. 5G). Přímá statistická srovnání odhalila, že skóre získaná pomocí ANDI Macro korelovala významně silněji se subjektivními hodnoceními než skóre získaná tradiční metodou (z=6,626, p, 0,0001; obr. 5F, G). Další analýzy odhalily, že makro usnadňuje provádění měření DI s robustním a významným zlepšením časové efektivity. DI analýzy provedené pomocí ANDI Macro vyžadovaly průměrnou dobu 12,75 s na analyzovaný snímek ve srovnání s průměrnou dobou 5,27 min na snímek analyzovaný tradiční metodou [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Celkově tyto výsledky naznačují, že ANDI poskytuje rychlé generování měření DI, které se ve srovnání se skóre získanými tradiční metodou více blíží degeneraci, kterou badatelé vnímají z kvalitativní analýzy obrazů neuritů.

Po stanovení přesnosti a účinnosti makra ANDI pro měření degenerace neuritů v diferencovaných buňkách LUHMES vystavených působení 6-OHDA jsme vyhodnotili vhodnost makra pro experimenty zahrnující jiné modely buněčných kultur. Nejprve byla provedena pilotní studie k posouzení přesnosti ANDI při provádění měření DI pomocí mikrofotografie primárních sympatických kultur imunoznačených pro b III-tubulin a DAPI. Je však zajímavé, že buněčná těla sympatických neuronů jsou větší než těla diferencovaných buněk LUHMES, a proto operace v ANDI související s automatickým odstraněním soma neodstranily celý soma (data nejsou uvedena).

Abychom tento problém překonali, upravili jsme ANDI tak, aby obsahovalo dialogové okno, které uživatelům umožňuje zvolit velikost odstranění soma řízením počtu dilatací binarizovaných mikrosnímků jader. Tato verze ANDI, verze 1.1, byla poté použita k provedení DI měření z mikrofotografie zobrazujících zdravé, vehikulem ošetřené sympatické neurony nebo degenerující sympatické neurony vystavené peroxidu vodíku. Snímky neuronů vystavených peroxidu vodíku poskytly významně vyšší skóre DI ve srovnání se snímky neuronů ošetřených vehikulem (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 0,9301, obr. 6A, C). Kromě toho jsme porovnali tato skóre DI, která byla získána pomocí ANDI, s měřeními DI získanými ze stejné sady snímků po ručním odstranění buněčných těl z fluorescenčních mikrofotografií pomocí nástroje ImageJ od ruky. Nebyl žádný významný rozdíl ve skóre DI vypočteném po manuálním odstranění soma ve srovnání se skóre získanými pomocí ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000, obr. 6A–C). Post hoc testy také potvrdily, že skóre DI získané pomocí ANDI se významně nelišilo jak v případě neošetřených neuronů (p=0,0972), tak v případě neuronů vystavených peroxidu vodíku (p=0. 9986).

Kromě toho skóre DI vytvořené z ANDI korelovalo téměř identicky se skóre DI získanými po ručním odstranění buněčných těl z odpovídajících mikrosnímků (r(34)=0.991, p, 0.0001). Tato data ukazují, že ANDI je vhodný pro měření degenerace neuritů v kulturách primárních neuronů s operacemi odstranění soma, které si uživatel může přizpůsobit tak, aby odpovídaly různým typům neuronů. Kromě toho detekce fragmentů neuritů v kulturách vystavených peroxidu vodíku demonstruje použitelnost makra pro použití v experimentech zahrnujících degeneraci neuritů indukovanou jinými zdroji než 6-OHDA. Pro další ověření použití ANDI při detekci degenerace neuritů spojené s různými příčinami jsme také použili makro k měření degenerace neuritů na mikrosnímcích zdravých sympatických kultur nebo kultur podrobených vysazení NGF. Jak se očekávalo, snímky kultur podrobených vysazení NGF poskytly významně vyšší hodnoty DI ve srovnání se snímky zdravých kultur (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958, obr. 6D, E). Souhrnně tato zjištění ukazují, že ANDI lze použít k detekci degenerace neuritů spojené s různými biologickými kontexty.

Protože se barvení na TH běžně používá k vizualizaci katecholaminergních neuronů, hodnotili jsme také vhodnost mikrosnímků znázorňujících barvení TH pro měření degenerace neuritů pomocí ANDI. Kultury zdravých sympatických neuronů ošetřených roztokem vehikula nebo degenerujícími sympatickými neurony vystavenými peroxidu vodíku byly fixovány a podrobeny imunofluorescenčnímu značení na TH a bIII-tubulin, stejně jako kontrastnímu barvení na DAPI. Snímky neuritů zobrazující barvení na TH nebo bIII-tubulin a odpovídající snímky jader se značením DAPI byly poté zachyceny v podobných zorných polích. Byl proveden ANDI a snímky obsahující barvení TH nebo barvení b III-tubulinem byly vybrány jako snímky neuritů. Naše analýzy odhalily, že skóre DI získané pomocí snímků barvení TH velmi silně korelovalo se skóre získanými ze snímků barvení b III-tubulinem (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Obr. 6F, G). Tato data naznačují, že přesná měření DI lze získat pomocí ANDI za použití alternativních postupů barvení, které označí celé neurity, jako je imunoznačení pro TH.

Abychom demonstrovali užitečnost vylepšené metody pro provádění měření DI ve vědeckém experimentu, použili jsme novou metodu k posouzení role JNK v degeneraci neuritů indukované oxidačním stresem v lidských mesencefalických buňkách. Diferencované buňky LUHMES byly předem ošetřeny po dobu 1 hodiny JNK inhibitorem SP600125 nebo roztokem vehikula. Buňky byly poté ošetřeny po dobu 24 hodin 6- OHDA pro indukci oxidačního stresu nebo roztokem vehikula. Fixované buňky byly podrobeny imunoznačení pro bIII-tubulin a barvení DAPI a ANDI bylo použito k získání DI měření z fluorescenčních mikrografů. Zatímco kultury bez předchozího ošetření inhibitorem JNK vykazovaly po expozici 6-OHDA degeneraci neuritů, inhibice JNK vedla k výraznému a významnému snížení 6- OHDA-indukované degenerace neuritů (p= 0.0001 , d= 2.0209; obr. 7). Tato zjištění podporují klíčovou roli signalizace JNK při degeneraci neuritů indukované oxidačním stresem v lidských mesencefalických buňkách a co je důležité, demonstrují užitečnost naší nové metody pro generování vědeckých objevů tím, že usnadňuje rychlé a přesné měření degenerace neuritů.

Diskuse

Degenerace neuritů je spojena s řadou neuropatologických stavů, avšak molekulární mechanismy, které jsou základem degradace neuritů, zůstávají neúplně pochopeny. Metody usnadňující přesnou a účinnou analýzu degenerace neuritů jsou nezbytné pro úspěšnou identifikaci nových faktorů regulujících tuto důležitou buněčnou událost. V této studii odhalujeme více zdrojů chyb spojených s běžně používanou metodou pro kvantifikaci degenerace neuritů. Uvádíme experimentální data podporující procedurální úpravy, které lze implementovat za účelem snížení chyb analýzy DI, a takové úpravy jsou začleněny do nového makra ImageJ, aby poskytly nástroj pro rychlé, přesné a objektivní analýzy DI pomocí open source a svobodného softwaru. Kromě toho ukazujeme, jak lze vylepšenou metodu použít k měření degenerace neuritů v modelu buněčné kultury PD, což je porucha, ve které je axonální fragmentace v dopaminergních neuronech událost v raném stádiu, která předchází případné ztrátě neuronů (Tagliaferro a Burke, 2016) .

V této studii demonstrujeme užitečnost ANDI Macro při měření degenerace neuritů v modelu buněčné kultury PD sestávajícího z diferencovaných buněk LUHMES vystavených 6-OHDA.

Uvádíme experimentální poznatky podporující optimální substráty, na kterých by měly být kultury založeny, a také demonstrujeme hustotu plátování, která je nejvhodnější pro analýzy degenerace neuritů. Použití tohoto modelového systému ke studiu degenerace neuritů má několik výhod. V buňkách se vyvinou neurity, které jsou dobře propojené sítěmi a obvykle dlouhé 0,500 mm, a kultury jsou náchylné k neurodegeneraci vyvolané klasickými neurotoxinovými modely PD, jako je 6-OHDA, 1-methyl{{4 }}fenylpyridiniový iont (MPP1) a rotenon (Lotharius a kol., 2005; Zhang a kol., 2014; Smirnova a kol., 2016; Kraemer a kol., 2021). Lidský původ buněk LUHMES dále zvyšuje přeložitelnost nálezů spojených s modelem a podmíněná imortalizace usnadňuje rychlé vytváření a propagaci kultur (Scholz et al., 2011). Ve spojení s automatizovanými analýzami prováděnými pomocí ANDI lze tedy buňky LUHMES použít k novým objevům souvisejícím s degenerací neuritů souvisejících s PD a zároveň usnadnit podstatně vyšší výkon ve srovnání s neautomatizovanými analýzami prováděnými s primárními neuronovými kulturami.

Mnoho výzkumných skupin provedlo analýzy DI pomocí snímků s fázovým kontrastem, aby získaly přehled o faktorech, které regulují degeneraci neuritů (Press a Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 Di Stefano a kol., 2015; Hill a kol., 2018; Geisler a kol., 2019). Zde uvádíme důležitou nevýhodu spojenou s touto široce používanou metodou pro měření degenerace neuritů: binarizace snímků s fázovým kontrastem způsobuje, že se značná část intaktních neuritů jeví jako fragmentovaná. Zatímco úroveň kontrastu, kterého lze dosáhnout při pořizování mikrosnímků, se liší v závislosti na systému mikroskopu, který mají vyšetřovatelé k dispozici, tento problém je všudypřítomný mezi různými výzkumnými skupinami, protože DI 0,2 je běžně přijímán jako práh, nad kterým jsou kultury považovány za degenerující. axony a většina vědeckých zpráv obsahujících měření DI z mikrofotografie s fázovým kontrastem uvádí skóre DI pro zdravé neurony mezi 0,1 a 0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto a kol., 2020). Naše DI analýzy získané z fluorescenčních mikrofotografií, stejně jako subjektivní skóre od zaslepených vyšetřovatelů, naznačují, že 10–20% fragmentace neuritů není v kulturách zdravých neuronů běžná. Takové kultury spíše vykazují v průměru pouze 2,5% fragmentaci neuritů. Naše zjištění tedy podtrhují potřebu metod, které zlepšují přesnost analýz degenerace neuritů snížením tohoto běžného a významného zdroje chyb měření.

Zatímco většina studií zahrnujících měření DI použila k provedení analýz degenerace neuritů snímky s fázovým kontrastem, několik výzkumných skupin nedávno provedlo měření DI pomocí snímků neuronů imunoznačených pro cytoskeletální vlákna, jako je polypeptid neurofilamentového média nebo b-b-tubulin (Wakatsuki a kol., 2011; Li a kol., 2017; Pease-Raissi a kol., 2017; Hernandez a kol., 2018; Sundaramoorthy a kol., 2020). Nicméně, která forma mikroskopie je nejvhodnější pro měření degenerace neuritů, zůstala nejasná, protože bylo zapotřebí výzkumů, aby bylo možné pochopit, zda změny v lokalizaci těchto cytoskeletálních proteinů během degenerace neuritů vhodně modelují celkové změny v morfologii neuritů, a také pro vyhodnocení stupně, do kterého DI měření získaná fluorescenčními mikrofotografiemi korelují s podobnými měřeními získanými z mikrofotografie s fázovým kontrastem. Zde ukazujeme, že fluorescenční mikrofotografie zobrazující barvení b III-tubulinem nejen přesně reprezentují fragmentaci neuritů, ale také umožňují přesnější měření DI díky jejich vynikajícímu kontrastu a snížené náchylnosti k umělé fragmentaci při binarizaci. Naše výsledky tedy zdůrazňují užitečnost použití barvení b III-tubulinem k měření degenerace neuritů.

Mezi publikovanými studiemi zahrnujícími DI analýzy k měření degenerace neuritů se uváděné parametry velikosti a cirkularity používané k detekci fragmentů neuritů značně lišily. Například nedávná studie zahrnující hodnocení degenerace neuritů v kultivovaných hipokampálních neuronech používala parametry velikosti 4–900 pixelů (Li et al., 2017), zatímco studie zahrnující kultivované neurony DRG používala parametry detekce 0–10,000 pixelů (Wakatsuki et al., 2011). Jedním z potenciálních důvodů pro takové variace je to, že účinnost parametrů velikosti analýzy částic při detekci fragmentů neuritů se mění v závislosti na rozlišení obrazu, protože parametry velikosti pro detekci částic jsou spojeny s pixelovými jednotkami. Bohužel většina publikovaných studií zahrnujících DI analýzy neobsahuje popis rozlišení obrazu použitého pro analýzy. Bylo tedy zapotřebí stanovit standardní parametry analýzy pomocí protokolu, který plně odhaluje důležité detaily, jako je doporučené rozlišení obrazu. Zde uvádíme, že nejčastěji uváděné parametry pro detekci fragmentů neuritů jsou 20–10,000 pixelů (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin a Cho, 2020), vedou k tomu, že velká část fragmentů neuronů není detekována. Snížení kritéria minimální velikosti pro detekci fragmentů neuritů zvyšuje citlivost detekce fragmentů a současně zvyšuje počet obrazových artefaktů a neneuritových úlomků, které jsou falešně detekovány jako fragmenty neuritů. Při hledání parametrů, které by nejlépe vyvážily citlivost detekce a míru falešné pozitivity, jsme identifikovali parametry analýzy 10–10,{19}} jako nejpřesnější detekci fragmentů neuritů v binarizovaných snímcích získaných z mikrografů s fázovým kontrastem, zatímco parametry 5–10,000 umožňují nejpřesnější detekci neuritových fragmentů v binarizovaných snímcích získaných z fluorescenčních mikrografů. I když byla tato určení provedena s použitím rozlišení obrazu 1280 1024, takové parametry by měly také umožnit přesnou detekci fragmentů neuritů na snímcích pořízených v jiných rozlišeních s vertikální velikostí 1024 pixelů, jako je běžné celoobrazovkové rozlišení {{ 27}}, protože neurony zobrazené na takových obrázcích by měly podobnou velikost pixelů.

Mnoho výzkumných skupin použilo kritérium minimální velikosti při konfiguraci parametrů analýzy částic, aby se zabránilo zahrnutí malých, neneuritových úlomků do měření fragmentů neuritů (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki a kol., 2016; Li a kol., 2017; Loreto a kol., 2020; Shin a Cho, 2020; Sundaramoorthy a kol., 2020). Takové studie však chybně zahrnuly do měření celkové plochy neuritů malou nefragmentovou hmotu, protože taková měření se získají sečtením plochy všech černých pixelů v obraze. Zde demonstrujeme užitečnost pluginu Particle Remover k odstranění malých nefragmentovaných nečistot z obrazu před analýzou DI. Využití pluginu významně zvýšilo citlivost měření degenerace neuritů získaných ze snímků s fázovým kontrastem. Naše výsledky tedy zdůrazňují hodnotu pluginu Particle Remover pro vyšetřovatele provádějící DI analýzy pomocí mikrofotografie s fázovým kontrastem. Je zajímavé, že fluorescenční mikrofotografie vykazovaly méně malých, neneuritových úlomků, a proto bylo možné pro detekci fragmentů použít menší kritérium velikosti pěti pixelů. Zatímco odstranění částic neneuritových úlomků o velikosti menší než pět pixelů významně neovlivnilo měření DI získaná z fluorescenčních mikrosnímků, takové operace poskytují hodnoty, které jsou teoreticky přesnější, a proto byly zahrnuty do ANDI.

Vzhledem k tomu, že DI analýzy musí být prováděny s použitím snímků výlučně obsahujících neurity, aplikace analytické metody byla primárně omezena na použití s ​​kultivačními systémy umožňujícími odstranění buněčných těl, jako jsou kultury explantátů, ve kterých mohou být buněčná těla fyzicky vyříznuta (Catenaccio et al. , 2017; Shin a Cho, 2020) nebo kultury v mikrofluidních zařízeních usnadňujících segregaci soma a axonových kompartmentů (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Alternativně lze provádění DI analýz s disociovanými kulturami dosáhnout únavnou a časově náročnou prací spojenou s digitálním odstraňováním buněčných těl z mikrosnímků (Kraemer et al., 2014). V této studii odhalujeme, že ANDI umožňuje provádět měření DI z mikrofotografie s buňkami LUHMES, které jsou disociované a mozaikově distribuované v 2D kultivačním systému. Naše zjištění také ukazují, že ANDI usnadňuje 24-násobné zkrácení času potřebného k provedení analýz a operace v ANDI související s odstraněním soma poskytují výsledky analýzy DI, které korelují z 98 % s podobnými analýzami provedenými po ručním odstranění soma pomocí od ruky nástroj ImageJ. Makro tedy podstatně zvyšuje účinnost analýz prováděním automatizovaného odstraňování soma prostřednictvím procesu, který nezhoršuje přesnost, a takové operace rozšiřují vhodnost metody pro analýzu disociovaných kultur s mozaikovitě distribuovanými buněčnými těly.

Kromě usnadnění automatického odstraňování buněčných těl ze snímků nabízí ANDI několik revizí tradiční metody pro provádění DI analýzy, včetně použití fluorescenčních mikrografů, revidovaných parametrů analýzy částic a použití odstraňovače částic k odstranění malých, neneuritových úlomků. z obrázků. Naše zjištění naznačují, že tyto optimalizace společně poskytují hodnoty DI, které se více přibližují hodnotám získaným slepým a podrobeným skórováním. Kromě podstatného zkrácení času potřebného k provedení analýz tedy ANDI usnadňuje měření DI, které ve srovnání s tradiční metodou přesněji odráží degeneraci neuritů, kterou výzkumníci údajně pozorují z kvalitativní analýzy obrazu.

Jednou nevýhodou tradiční metody pro provádění analýz DI je, že takové analýzy vyžadují školení v používání ImageJ, takže uživatel je obeznámen s únavnou sadou operací ImageJ. Pro efektivní provádění analýz je navíc vyžadováno další školení uživatele, aby mohl provádět dávkové analýzy nebo psát skripty pro poloautomatizaci provádění konkrétních kroků. Díky plné automatizaci analýzy ANDI usnadňuje DI měření pouze v několika krocích souvisejících se stažením a provedením makra. Pro zvýšení uživatelské přívětivosti obsahuje makro kód, který poskytuje rozhraní pro výběr adresářů obsahujících obrázky, které mají být analyzovány, a také pro usnadnění výstupu výsledných obrázků a datových tabulek do adresáře podle výběru uživatele. Kromě toho skript obsahuje řadu funkcí navržených tak, aby zabránily nepřesnostem měření nebo chybám uživatele, včetně automatického vymazání předchozích výsledků ImageJ; odstranění informací o měřítku obrazu pro zajištění přesného provádění měření pomocí jednotek pixelů; vhodná konfigurace nastavení barev ImageJ, nastavení měření a parametrů analyzátoru částic; zobrazení chybové zprávy, pokud uživatelé chybně vyberou adresáře obsahující nestejný počet obrázků zobrazujících barvení b III-tubulinem a barvení DAPI; popisy protokolů udávající postup analýzy; a kódování, které zabraňuje chybám spojeným s automatickým generováním souborů .ini systémem Windows 10. Celkově tyto funkce činí analýzy DI uživatelsky přívětivějšími, což může podpořit zájem o studie související s degenerací neuritů.

Abychom demonstrovali jeho užitečnost v experimentu, použili jsme ANDI k vyhodnocení příspěvku JNK k degeneraci neuritů v buněčných kulturách LUHMES vystavených 6-OHDA. JNK je stresem aktivovaná kináza, o které se uvádí, že je klíčem k degeneraci neuritů v periferních neuronech původem z primátů (Shin et al., 2012), ale k pochopení úlohy kinázy při degeneraci neuritů v mezencefalických lidských buňkách jsou zapotřebí další studie. . Zde ukazujeme, že inhibice JNK významně chrání lidské mesencefalické buňky před degenerací neuritů spojenou s oxidačním stresem. Taková zjištění nejen odhalují důležitou roli JNK při degeneraci neuritů spojené s modelem lidského onemocnění, ale také dokládají užitečnost ANDI pro provádění automatizované a objektivní analýzy obrazu za účelem nových vědeckých objevů.

Zatímco ANDI bylo původně navrženo tak, aby usnadnilo rychlé a přesné měření degenerace neuritů v kulturách diferencovaných buněk LUHMES vystavených působení 6-OHDA, naše zjištění také naznačují, že makro lze použít k detekci degenerace neuritů vyvolané jinými příčinami, jako je např. vystavení peroxidu vodíku nebo vysazení neurotrofinu. Verze 1.1 makra navíc obsahuje dialogové okno, které umožňuje vyšetřovatelům přizpůsobit operace odstranění soma pro neurony určitých velikostí. Naše data také podporují, že k přesnému měření degenerace neuritů lze použít jiné způsoby barvení než imunoznačení pro b III-tubulin. Ačkoli doporučujeme použití pilotních studií k ověření přesnosti měření DI při použití ANDI s buněčnými typy nebo metodami barvení, které nebyly dříve testovány, tato zjištění podporují, že makro je obecně univerzálním nástrojem pro měření degenerace neuritů v kultivovaných neuronech. Vzhledem k tomu, že ANDI nebyl optimalizován pro měření degenerace neuritů ve tkáni, v současné době jej doporučujeme používat pouze pro analýzu degenerace neuritů související s kultivovanými buňkami. Kód pro ANDI je však veřejně dostupný, a proto může být také užitečný pro badatele, kteří se zajímají o úpravu skriptu tak, aby vyhovoval studiím in vivo nebo jiným aplikacím.

Na závěr tento článek představuje data odhalující běžné zdroje chyb spojených s široce používanou metodou pro kvantifikaci degenerace neuritů. Ke zlepšení metody byly použity experimentální přístupy a taková vylepšení byla začleněna do bezplatného a otevřeného makra ImageJ, které lze použít k provádění rychlé, přesné a objektivní analýzy fluorescenčních mikrografů pro degeneraci neuritů. Naše zjištění odhalují účinnost ANDI pro kvantifikaci degenerace neuritů na mikrosnímcích znázorňujících model buněčné kultury PD a také poskytují důkaz o principu, že makro může detekovat degeneraci neuritů spojenou s jinými biologickými kontexty. Uživatelsky přívětivé makro zkrátí čas potřebný k tomu, aby se vyšetřovatelé naučili kvantifikovat fragmentaci neuritů, a zároveň zvýší propustnost a přesnost studií hodnotících faktory, které jsou základem degenerace neuritů. Makro ANDI je k dispozici na následující adrese URL: https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

Reference

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Kognitivní pokles u Parkinsonovy nemoci. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Přehled: axonová patologie u neurodegenerativních poruch souvisejících s věkem. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Modely Parkinsonovy nemoci založené na neurotoxinech. Neuroscience 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Molekulární analýza axonálně-vnitřní a gliové asociované koregulace degenerace axonů. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Target-derived neurotropins coordinate transscription.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR a kol. (2015) Vzestup NAD prekurzoru nikotinamidového mononukleotidu (NMN) po poranění podporuje degeneraci axonu. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Reaktivní formy kyslíku vyvolávají degeneraci neuritů před indukcí buněčné smrti. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Degenerace axonů: kontext definuje odlišné dráhy. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vinkristin a bortezomib používají odlišné upstream mechanismy k aktivaci běžné SARM1-závislé degenerace axonů program. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Axonální degenerace vyvolaná glutamátovou excitotoxicitou je zprostředkována nekroptózou. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com