Značky kvality Cistanches Herba založené na vztahu mezi antioxidačním spektrem a účinkem

Abstrakt: Cíl: Stanovit výzkumnou metodu pro ukazatele kvality (Q-markery).Cistanches Herba(CH) na základěvztah antioxidační spektrum-účinek, poskytující základ pro studium jeho farmakologických látek a kontrolu kvality. Metody: Pro stanovení profilů otisků prstů pro 10 šarží CH byla použita ultra vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UPLC). Byl vytvořen model buněčného oxidačního poškození pomocí H2O2 a antioxidační kapacita CH byla stanovena na základě poloviční maximální inhibiční koncentrace reaktivních forem kyslíku, stejně jako úrovnísuperoxidedismutázaakatalázatak jakofarmakologické ukazatele. Vztah spektrum-účinek byl konstruován pomocí analýzy hlavních složek, Pearsonovy korelační analýzy a částečné regresní analýzy nejmenších čtverců. Theaktivní složkybyli podrobenifarmakologická validace. 

Výsledek:Profily otisků prstů pro CH byly stanoveny pomocí UPLC, přičemž bylo identifikováno 17 běžných píku. Na základě korelační analýzy spektrální účinek bylo vybráno devět složek. Výsledky farmakologické validace ukázaly, že kyselina geniposidová, 8-epiloganová kyselina,echinakosid,akteosid, isoacteosid, atubulosid Avykazovaly antioxidační aktivitu v závislosti na koncentraci.

Závěr: Tato studie zkoumala Q-markery pro CH na základě vztahu spektrum-účinek a poskytla referenční informace pro její farmakologický základ a zlepšení standardu kvality.

klíčová slova:Cistanches Herba; Q-marker;vztah spektrum-účinek; antioxidant

Cistanche deserticola je sušený dužnatý stonek se šupinatými listy Cistanche deserticola YCMa nebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, rostliny patřící do čeledi Cistanche deserticola orbaceae. Je teplé povahy, sladké a slané chuti; vrací se do meridiánů ledvin a tlustého střeva; má účinky vyživování jangu ledvin, doplnění esence a krve, zvlhčení střev a projímadlo a je důležitým lékem na tonizaci ledvin a doplnění esence [2-3]. Ledviny uchovávají esenci a esence a krev pocházejí ze stejného zdroje. Pokud je nedostatek esence a krve, ovlivní to celkové životní aktivity lidského těla; dřeň produkující esenci je uložena v kostech a mozek je dřeňové moře. Pokud je esence ledvin nedostatečná, kosti ztrácejí výživu a mozek bude nedostatek, což má za následek degenerativní změny kostí, jako je uvolněná struktura, ztráta zubů, ztráta paměti, demence a snížená imunitní funkce [4-6]. Cistanche deserticola obsahuje fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany a další strukturální složky, včetně echinakosidu, verbascosidu, verbascosidu, kyseliny genipinové a 8-epistryanové. , tubulin A atd. [7]. Současná kontrola kvality Cistanche deserticola ve vydání „Pharmacopoeia Čínské lidové republiky“ pro rok 2020 stanoví pouze obsah echinacosidu a verbascosidu, který nemůže plně odrážet vícesložkové a vícecílové vlastnosti tradiční čínské medicíny. , což neprospívá její kontrole a hodnocení kvality.

Za účelem zlepšení úrovně kontroly kvality tradiční čínské medicíny a optimalizace hodnocení kvality tradiční čínské medicíny navrhl akademik Liu Changxiao nový koncept ukazatele kvality (Q-marker) tradiční čínské medicíny [8]. Mezi nimi je „účinnost“ základním prvkem „Pěti principů“ Q-markeru [9] a je také jádrem hodnocení kvality tradiční čínské medicíny.

Vzhledem k současnému stavu výzkumu slabé korelace mezi standardy kvality a účinností léků má pro zlepšení kvality tradičních čínských léků velký význam prozkoumání Q-markerů tradičních čínských léků a stanovení více vědeckých a přiměřených standardů kvality. Vztah mezi spektrem a účinkem spojuje otiskové chromatografické vrcholy tradiční čínské medicíny se specifickými farmakodynamickými daty za účelem nalezení účinných látek tradiční čínské medicíny, čímž se odráží inherentní kvalita tradiční čínské medicíny [10]. Zavedení matematického modelu spektrální účinnosti může objasnit QMarker tradiční čínské medicíny z „holistického pohledu“ a poskytnout více referencí pro pozdější kontrolu kvality tradiční čínské medicíny, formulaci standardů kvality a screening účinných látek. Tato studie využívá otisky prstů v kombinaci s poloviční mírou inhibice reaktivních forem kyslíku (ROS IC50), obsahem superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT) ke studiu vztahu spektra a účinku tradiční čínské medicíny a využívá analýzu hlavních složek. (PCA) ), Pearsonovou korelační analýzou (PCC) a parciální regresní analýzou nejmenších čtverců (PLS) za účelem komplexní analýzy Q-markeru Cistanche deserticola, která poskytne základ pro kontrolu její kvality.

1 materiál

1.1 Ukázka

Cistanche deserticola byla sklizena z okresu Yutian, Xinjiang, a pěstitelské základny dobré zemědělské praxe (GAP) Cistanche deserticola ve Vnitřním Mongolsku. Byl identifikován výzkumníkem Zhang Tiejunem z Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. jako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight a Cistanche deserticola.

YC Ma, podrobné informace jsou uvedeny v tabulce 1.

1.2 Testovací medicína

Echinaceaside (číslo šarže: 111670-201907, čistota: 91,8 %) a verbascosid (číslo šarže: 111530-201914, čistota: 95,2 %) byly oba zakoupeny od China Institute of Food and Drug Control; isorescosid (číslo šarže: 61303-13 -7), salidrosid (číslo šarže: 10338-51-9), 8-kyselina epistrychnová (číslo šarže: 82509-41-9), kyselina genipinová (číslo šarže: Z24A10X95926) , tuberóza B (číslo šarže: 112516-04-08), 2-glykosid acetyleugenolu (číslo šarže: 94492-24-7) byly zakoupeny od společnosti Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., čistota větší nebo rovna 98 %; Cystanche glykosid A (číslo šarže: MUST -20062806, čistota: 98,51 %), floridin A (číslo šarže: MUST19110102, čistota: 98,57 %) byly zakoupeny od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; chromatograficky čistý acetonitril a kyselina mravenčí byly zakoupeny od Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Čištěná voda (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). vitamín E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimethylsulfoxid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company of the United States); Jednoroztoková souprava pro detekci buněčné proliferace CellTiter 96® AQueous (G3580, Promega Company of United States); Detekce CAT Souprava (S0051), souprava pro detekci aktivity SOD (S0101M) a souprava pro detekci ROS (S0033S) byly zakoupeny od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Nástroje

Ultra vysoce výkonný kapalinový chromatograf Waters H-class-PDA (Waters Company, USA); elektronická váha Sartorius BT25S (Sartorius Company, Německo); vysokorychlostní stolní odstředivka H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

čtečka mikrodestiček (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Biologický mikroskop WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 buňky

V tomto experimentu byly použity buňky lidské embryonální ledviny HEK 293 buňky a byly zakoupeny z buněčné banky Čínské akademie věd.

2 způsoby

2.1 Vytvoření mapy otisků prstů

2.1.1 Příprava testovacího roztoku: Odvažte 2 g léčivého materiálu Cistanche deserticola, přidejte 10násobek vody, zahřejte a refluxujte 3krát, pokaždé 1 h, odstřeďte při 1.0 ×105r·min-1 po dobu 15 min (odstředivý poloměr je 300 mm), Spojte supernatanty a zakoncentrujte, abyste získali zásobní roztok s hmotnostní koncentrací 100 mg·mL-1, zřeďte jej 10krát, a přefiltrujte ji přes 0,22 um mikroporézní filtrační membránu, abyste ji získali.

2.1.2 Příprava směsného referenčního roztoku

Vezměte 8-kyselinu epistrychnovou, salidrosid, echinaceaside, cistanche glykosid A, kyselinu genipinovou, verbascosid, anthokyanosid A, isorbascosid a 2'-acetyleugenol. Referenční látky glykosid a angiosid B byly měřeny ve vhodných množstvích a přesně zváženy. Přidejte 50% roztok methanolu k rozpuštění a připravte směsný roztok referenční látky s hmotnostní koncentrací 20 µg·mL–1.

2.1.3 Chromatografické podmínky

kolona ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobilní fáze je acetonitril (A) ~ 0,1% roztok kyseliny mravenčí (B), gradientový eluční program (0 ~ 6 min, 5 % ~ 8 % A; 6~10 min, 8 %~15 %A 10-13 min, 15%-19%A, 13-20 min, 19%-25%A); detekční vlnová délka je 237 nm; průtoková rychlost je 0,4 ml·min –1; teplota kolony je 40 stupňů; injekční objem je 3 µl.

2.1.4 Výběr referenčního píku

V ultravýkonné kapalinové chromatografii (UPLC) chromatogramu Cistanche deserticola byl jako referenční pík spektra otisků prstů vybrán pík s největším poměrem plochy píku, středním retenčním časem a dobrou separací. 2.1.5 Metodické šetření Zkouška přesnosti: Odeberte vzorek T1 a připravte zkušební roztok podle metody v 2.1.1. Vstříkněte vzorek 6krát nepřetržitě a zaznamenejte otisk prstu. Výsledky ukazují, že relativní plocha píku RSD každého píku je 0.10%~4.61%. RSD relativního retenčního času je 0,08 %~1,32 %, což ukazuje, že přístroj má dobrou přesnost.

Zkouška opakovatelnosti: Odeberte vzorek T1 a připravte paralelně 6 vzorků zkušebního roztoku podle metody podle bodu 2.1.1 a vzorek kontinuálně vstřikujte. Výsledky ukazují, že relativní plocha RSD píku každého chromatografického píku je 1,35 %~4,80% a relativní retenční čas RSD je 0,10 %~1,80 %, což splňuje požadavky otisku prstu a ukazuje, že opakovatelnost nástroje je dobrý.

Test stability: Odeberte vzorek T1 a připravte testovací roztok podle metody podle 2.1.1, vstříkněte vzorky pro testování v 0, 2, 4, 8 a 12 hodinách a zaznamenejte otisk prstu. Vypočtená RSD relativní plochy píku každého chromatografického píku je 0,53 %~4,82 % a RSD relativního retenčního času je 0,09 %~2,17 %, což splňuje požadavky otisku prstu a znamená, že testovaný produkt je stabilní do 12 hodin.

2.2 Výzkum antioxidačního účinku Cistanche deserticola

2.2.1 Příprava matečného louhu Cistanche deserticola:Odeberte matečný louh podle bodu 2.1.1, přefiltrujte a sterilizujte a před použitím zřeďte kultivačním médiem na požadovanou koncentraci.

2.2.2 Účinky Cistanche deserticola a pozitivní kontroly VE na životaschopnost buněk HEK 293

Nastavte normální skupinu (buněčná suspenze), skupinu pro podávání Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), skupinu VE (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), každý Nastavte 6 duplikátů jamek pro každou koncentraci a kultivujte po dobu 24 hodin. Do každé jamky přidejte 20 µl jednoroztokového činidla CellTiter 96® AQueous, abyste detekovali životaschopnost buněk. Pokračujte v kultivaci po dobu 2 hodin. K detekci hodnoty absorbance (OD) každé jamky při 490 nm použijte čtečku mikrotitračních destiček. Vypočítejte míru přežití buněk podle vzorce (1). Míra přežití (%)=(experimentální skupina OD/slepá skupina OD) × 100 % (1)

2.2.3 Účinek Cistanche deserticola na ROS indukované H2O2 v buňkách HEK 293

Buňky byly rozděleny do normální skupiny (buněčná suspenze) a do skupiny s podáním Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola a 60 µm·L–1 H2O2) a kultivovány po dobu 24 hodin. Při dalších operacích postupujte podle kroků soupravy pro detekci ROS, přímo pozorujte barvení buněk mikroskopem a použijte čtečku mikrodestiček k detekci intenzity fluorescence každé skupiny. Nastavení parametrů používalo vlnovou délku excitace 488 nm a vlnovou délku emise 525 nm. Experiment byl opakován třikrát.

2.2.4 Účinek Cistanche deserticola na H2O2-indukovanou SOD buněk HEK 293

Rozdělte buňky na normální skupinu (buněčná suspenze) a modelovou skupinu

(60 µm·L–1 H2O2), skupina VE (60 µm·L–1 VE a 60 µm·L–1 H2O2), skupina podávání Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola a 60 µm·L–1 H2O2 ), shromážděte buňky po 24 hodinách kultivace, přidejte roztok pro přípravu vzorku SOD pro lýzu buněk, centrifugujte při 4 stupních, 12 000 ot./min-1 po dobu 5 minut (odstředivý poloměr je 300 mm), odeberte supernatant jako vzorek, který má být testován, postupujte podle detekční sady SOD Postupujte podle níže uvedených kroků. Experiment byl opakován třikrát.

2.2.5 Účinek Cistanche deserticola na H2O2-indukovanou CAT v buňkách HEK 293

Řiďte se metodou podle 2.2.4 a skupinovým podáním, přidejte lyzační roztok, centrifugujte při 4 stupních, 12 000 ot./min-1 po dobu 10 minut (poloměr centrifugy je 300 mm), odeberte supernatant a postupujte podle kroků Detekční sada CAT. Následné operace. Experiment byl opakován třikrát.

2.2.6 Statistická analýza

Pro statistickou analýzu byl použit software SPSS 26.{1}}. Každá skupina dat byla reprezentována (±±(). Jednosměrná analýza rozptylu byla provedena na datech, která odpovídala normálnímu rozdělení. Pokud byly rozptyly stejné, byla použita metoda nejmenšího významného rozdílu. Pokud rozptyly byly nerovnoměrné, byla pro vykreslení použita Dunnettova metoda T3 a graf P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Korelační analýza spektrálního účinku antioxidantu Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Oblasti píku společných píků 10 šarží Cistanche deserticola, které vytvořily otisky prstů, byly standardizovány hodnotou Z a vytvořeny do datové matice 10 × 17, která byla importována do softwaru SPSS 26.0 pro PCA.

2.3.2 PCC Použijte SPSS 26.0 k provedení bivariační analýzy ke studiu vztahu spektrální účinnosti mezi otisky prstů Cistanche deserticola a antioxidanty.

Testování významnosti používá oboustranný test (T) s P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Importujte experimentální výsledky standardizované plochy píku a antioxidantu Cistanche deserticola do softwaru SIMCA-P 14.1, nastavte plochu píku jako proměnnou X a nastavte farmakodynamický index jako proměnnou Y pro provedení PLS.

2.4 Ověření antioxidační aktivity Q-markeru Cistanche deserticola

2.4.1 Příprava matečného louhu účinné látky

Přesně odvažte vhodná množství kyseliny genipinové, 8-epistrichnové, echinaceasidu, verbascosidu, isorebascosidu a anthokyanosidu A a přidejte DMSO, aby se rozpustily na 10 mmol·l–1 pro kontrolu. produktové řešení.

2.4.2 Vliv účinných látek na cytotoxicitu HEK 293

Poté, co byly buňky HEK 293 inkubovány po dobu 24 hodin, bylo přidáno 100 µl roztoků účinné látky podle bodu 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·l–1) do každé jamky byly přidány různé koncentrace a stimulace pokračovala. O 24 hodin později bylo k buňkám přidáno jednoroztokové činidlo CellTiter 96® AQueous, aby se detekovala životaschopnost buněk.

2.4.3 Antioxidační účinek aktivních složek na H2O2-indukované buňky HEK 293

Buňky byly seskupeny následovně: normální skupina, modelová skupina, VE skupina byly seskupeny jako v 2.2.4, experimentální skupina (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktivní složky a 60 µm·L–1 H2O2), kultivovaný po dobu 24 hodin. Stanovte intracelulární hladiny ROS, obsah SOD a CAT enzymů podle metod podle 2.2.3, 2.2.4 a 2.2.5, v tomto pořadí.

Podpůrná služba Wecistanche

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop