Analýza proteomů a in vitro antivirová, protirakovinná a antioxidační kapacita vodných extraktů z jedlých hub Lentinula Edodes a Pleurotus Ostreatus

Pro více informací prosím kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: V této studii jsme zkoumali vodné extrakty z jedlých hub Pleurotus ostreatus (hlíva ústřičná) a Lentinula edodes (houba shiitake). Analýza proteomu byla provedena pomocí LC-Triple TOF-MS a ukázala expresi 753 proteinů Pleurotus ostreatus a 432 proteinů Lentinula edodes. Bioaktivní peptidy: V obou houbách byly identifikovány inhibitor disociace Rab GDP, superoxiddismutáza, thioredoxinreduktáza, serinproteináza a lektin. Extrakty také obsahovaly slibné bioaktivní sloučeniny včetně fenolů,flavonoidy, vitamíny a aminokyseliny. Extrakty se ukázaly slibnéantivirové aktivitys indexem selektivity (SI) 4,5 pro Pleurotus ostreatus proti adenoviru (Ad7) a mírnou aktivitou pro Lentinula edodes proti herpes simplex-II (HSV-2). Extrakty nebyly cytotoxické pro normální lidské periferní krevní mononukleární buňky (PBMC). Naopak vykazovaly mírnou cytotoxicitu vůči různým rakovinným buněčným liniím. Kromě toho byla antioxidační aktivita hodnocena pomocí DPPHradikální čištěníABTS radikálové kationty a testy ORAC. Tyto dva extrakty ukázaly potenciálantioxidační aktivitys maximální aktivitou pozorovanou pro Pleurotus ostreatus (IC50 ug/ml)=39,46 ± 1,27 pro DPPH;11,22±1,81 pro ABTS; a 21,40±2,20 pro testy ORAC. Tato studie podporuje použití těchto hub v medicíně ve světle jejich nízké cytotoxicity na normální PBMC ve srovnání s jejich antivirovými, protinádorovými a antioxidačními schopnostmi.

Klíčová slova: houba bílé hniloby; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shiitake; antioxidant; protinádorové; antivirový

1. Úvod

Houby mají velké vyhlídky v lékařství a nutraceutické výrobě. Kromě dobrých organoleptických vlastností a vysokých nutričních hodnot se u mnoha hub uvádí, že mají nesčetné množství farmakologických aktivit [1-3]. Mezi nejvíce pěstované houby patří Lentinula edodes (houba shiitake) a Pleurotus ostreatus (hlíva ústřičná). Shiitake je na druhém místě po Agaricus bisporus jako celosvětově nejkonzumovanější jedlá houba [4]. Tato houba má slibné antibakteriální, protiplísňové, antivirové, hepatoprotektivní, antihyperglykemické a imunomodulační účinky [5-7]. Je bohatý na bioaktivní molekuly, z nichž nejvíce studovaným je "lentinan", polysacharid s účinkem proti bakteriím, virům a nádorům, vedle "lentinanu", který prokázal pomoc při kontrole dyslipidémie a hyperglykémie [8]. Pleurotus ostreatus, nejběžnější druh rodu Pleurotus [9], známý také jako hlíva ústřičná, je rozkladač dřeva a má širokou škálu biologických aktivit [10]. Ve srovnání s jinými terapeutickými houbami se hlíva ústřičná stává stále populárnější jako podpora zdraví [11]. Přítomnost velkého množství výživných složek, jako jsou lektiny, polysacharidy, vitamíny a minerály v hlívě ústřičné, jim umožňuje mít potenciální protirakovinné účinky,antioxidantantidiabetické, antimikrobiální a antihypercholesterolemické vlastnosti [12,13]. Ve srovnání s jinými jedlými houbami mají ústřice a houby shiitake krátkou vegetační dobu a lze je sklízet po celý rok 14. Díky snadnému pěstování a testování, vysokým nutričním hodnotám a slibným léčivým přínosům mají tyto houby obrovský potenciál. v potravinářském a farmaceutickém průmyslu [4,15]. Vyšší basidiomycety mohou být slibnými multifunkčními zdroji potravy.

V těchto dvou houbách bylo nalezeno mnoho bioaktivních sloučenin, včetně cukrů, fyziologicky aktivních proteinů, nenasycených mastných kyselin, fenolů (fenolové kyseliny a polyfenoly), flavonoidů, terpenoidů, glykoproteinů, polyketidů, steroidů a alkaloidů [16,17]. Tyto sloučeniny působí samostatně nebo synergicky, aby vyvolaly široké farmakologické působení těchto hub. Hlíva shiitake a hlíva ústřičná mají antibakteriální, antivirové, antihypertenzní, imunomodulační a antioxidační účinky [1,18,19]. Seo a kol. [20] shrnuli mechanismy antivirové aktivity houbových biomolekul, což naznačuje, že ke snížení virové infekce dochází především prostřednictvím zasahování do příjmu viru do hostitelských buněk, jeho replikace a syntézy proteinů a enzymů, kromě stimulace imunitní odpověď hostitele [21]. Antioxidanty jsou důležité molekuly tváří v tvář reaktivním formám kyslíku, které stojí za mnoha zdravotními problémy. Vzhledem k tomu, že bylo vzneseno mnoho varovných signálů proti používání syntetických antioxidantů, studium přírodních antioxidantů se stalo povinným [22]. Protinádorový účinek těchto houbových produktů souvisel s biomolekulami včetně glukanů, ergosterolu, proteoglykanů a aminokyselin (arginin a glutamin)[23]. Předpokládaný mechanismus, který je základem tohoto účinku, může kromě spuštění imunitní odpovědi proti rakovinným buňkám zahrnovat stimulaci T-lymfocytů, potlačení neovaskularizace a indukci smrti rakovinných buněk [24,25].

Proteomika se osvědčila jako jeden z cenných nástrojů biologického výzkumu, zejména zemědělského výzkumu [26]. Lindequist a kol. [27]byli první skupinou, která objasnila důležitost využití proteomiky ve výzkumu jedlých hub. Zdůraznili potřebu použití "omics" pro studium houbových bioaktivních molekul. Proteomika se ve výzkumu jedlých hub ve srovnání s patogenními houbami téměř nepoužívá [28]. V souladu s tím bylo cílem této studie analyzovat proteom dvou jedlých hub, Pleurotus ostreatus a Lentinula edodes, a prozkoumat jejich potenciál.antivirovýprotinádorové a antioxidační aktivity.

2. Výsledky

2.1. Analýza Proteom1e

Analýza proteomu byla provedena pomocí analýzy LC-Triple TOF-MS s mírou falešného objevu (FDR)<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Celkový obsah bioaktivních sloučenin

Při hodnocení celkových obsahů to zahrnovalo hodnocení celkových sacharidů, bílkovin, fenolických látek a flavonoidů. Extrakt P. ostreatus obsahoval téměř trojnásobný počet sacharidů a dvojnásobný počet proteinů přítomných v extraktu L.edodes; nicméně v extraktu z L.edodes bylo detekováno více flavonoidů než v extraktu z P. ostreatus (tabulka 1).

2.3. Molekuly fenolů a flavonoidů

Oba houbové extrakty obsahovaly katechin (detekován při retenčním čase 26,48 min). P.ostreatus dále obsahoval kaempferol a apigenin (detekován při retenčních časech 59,13 min a 59,56 min, v daném pořadí), zatímco L.edodes obsahoval také kvercetin (retenční čas=56.86 min; tabulka 2; obrázek S1).

2.4.Vitamíny

Obsah vitamínů rozpustných ve vodě i v tucích byl stanoven pomocí HPLC (tabulka 3 a obrázky S2 a S3). Obě houby jsou bohaté na vitamín C, s detekovatelným množstvím vitamínů B3, B6 a D. Mezi oběma houbami nebyl žádný významný rozdíl v množství vitamínů, které mají. Na druhou stranu vitamíny B1, B2, B9, A a E nebyly v obou houbách zjištěny.

2.5. Aminokyselinová analýza

Pro analýzu aminokyselin byl použit Sykam Amino Acid Analyzer. Celkový obsah aminokyselin byl 5,14 a 4,35 v P.ostreatus a L.edodes, v daném pořadí, jak je uvedeno v tabulce 4, a tyto dvě houby jsou bohaté na kyselinu glutamovou. Zatímco v extraktu P. ostreatus byl prolin detekován ve značné koncentraci (0,57 g/100 g proteinu), v extraktu L.edodes nebyl detekován. Histidin a kyselina asparagová nebyly detekovány v žádné z těchto dvou hub.

2.6. Biologické aktivity

2.6.1.Antivirová aktivita

Antivirová aktivita byla hodnocena proti dvěma virům: adenoviru a herpes simplex-II. Jak je uvedeno v tabulce 5, extrakt P.ostreatus vykazoval účinnou antivirovou aktivitu proti adenoviru s indexem selektivity až 4,5. Slibné antivirové účinky byly zaznamenány také u extraktu P. ostreatus proti herpes simplex-II a u extraktu z L.edodes proti oběma virům. Obrázky S4 a S5 představují křivky dávka-odpověď.

2.6.2. Cytotoxická aktivita proti normálním lidským PBMC

Minimální cytotoxicita (IC50 ug/ml; 66,41 ± 3,7 a 82,81 ± 2,72 pro P. ostreatus a L. edodes, v daném pořadí) byla zaznamenána proti normálním lidským PBMC.

Proti rakovinným buněčným liniím

V tomto testu byly použity různé linie rakovinných buněk včetně rakoviny prostaty (DU-145 a PC3); hepatocelulární karcinom (HepG2); kolorektální karcinom (Colo-205); karcinomu slepého střeva (LS-513); rakovinu děložního čípku (HeLa); a adenokarcinom prsu (MDA-MB-231 a MCF-7). Doxorubicin byl použit jako pozitivní kontrola (způsobil pokles životaschopnosti na 53 procent u HepG2; 44 procent u MDA-MB-231; 39 procent u PC3; 35 procent u DU-145; 29 procent u MCF -7:25 procent v LS-513; 23 procent v HeLa; a 19 procent v buňkách Colo{23}}). Výsledky na obrázku 2 ukazují, že extrakt Ledodes a P. ostreatus snížil životaschopnost testovaných rakovinných buněčných linií LS-513, HepG2, DU-145 a PC-3 přibližně o 20 procento .

Proti leukémii a lymfomovým buněčným liniím

Extrakty hub P.ostreatus a L.edodes byly testovány na cytotoxicitu proti buňkám leukémie (CCR-CEM, NB-4, THP-1) a lymfomu (U937). Pozitivním standardem byl doxorubicin, který způsobil pokles životaschopnosti buněk na 29 procent, 25,5 procenta, 20,3 procenta a 19,1 procenta v buňkách U937, NB4, CCRF-CEM a THIP1. Extrakt L.edodes snížil životaschopnost buněk THP1 na 66,02 procent, zatímco extrakt P.ostreatus snížil životaschopnost buněk CCRF-CEM na 70,64 procent (obrázek 3).

2.6.3. Antioxidační aktivita

Výsledky antioxidačního účinku byly studovány třemi metodami hodnocení, a to DPPHradikální čištěníABTS zachycování kationtů radikálů a testy ORAC ve srovnání s antioxidačním standardem Trolox jsou uvedeny v tabulce 6 a na obrázku S6a,b. Výsledky ukazují, že extrakt P. ostreatus měl silnější antioxidační kapacitu než extrakt L.edodes, jak naznačují tři použité antioxidační testy. Obrázek 4 ukazuje rozpad fluoresceinového signálu indukovaný extrakty v testu ORAC.

3. Diskuse

Houby bílé hniloby vzbudily zájem vědecké komunity díky svým léčivým vlastnostem, mezi které patří modulace imunitního systému, hypoglykemická a antitrombotická aktivita a antihypertenzní, protizánětlivé, antimikrobiální a protinádorové vlastnosti, stejně jako schopnost snižovat hladinu cholesterolu v krvi [ 24, 36-38]. Dvě houby s bílou hnilobou P. ostreatus a L.edodes jsou dvě z nejvíce konzumovaných jedlých hub v mnoha zemích [39]. Tyto dvě houby produkují velké množství bioaktivních proteinů a analýza proteomů je v současnosti nejúčinnějším nástrojem pro profilování proteinů [40]. V současné studii analýza proteomu ukázala expresi bioaktivních proteinů včetně inhibitoru disociace Rab GDP, thioredoxin reduktázy, serinové proteinázy, superoxiddismutázy a lektinu ve dvou testovaných houbách. Inhibitor disociace Rab GDP (Rab GDI) reguluje funkci Rab GTPáz, které hrají klíčovou roli v membránovém transportu v nádorových buňkách. Použití Rab GDI je tedy slibnou protinádorovou strategií [29].

Serinová proteináza přispívá kantivirovýaktivita jedlých hub [30,31]. Kromě toho Yap a kol. (2018) uvedl silnou selektivní cytotoxicitu serinové proteinázy tváří v tvář buněčné linii lidského adenokarcinomu prsu (MCF7) a navrhl, že mechanismus zahrnuje kolaborativní účinek jak vnějších, tak vnitřních mechanismů buněčné smrti, navíc ke stimulaci kaspázy{{ 4}} a -9 a inhibice Bcl-2 [41].

Příjem zantioxidantyje příznivá profylaktická strategie proti patofyziologii zprostředkované reaktivními formami kyslíku (ROS) [22]. Naše výsledky ukazují expresi enzymů antioxidačního obranného systému Pleurotus ostreatus a Lentinula edodes. Mezi tyto enzymy patří superoxiddismutáza, kataláza a glutathionperoxidáza, které vyvažují produkci ROS [32]. Superoxiddismutáza začíná přeměnou superoxidu na peroxid vodíku, který je následně katalázou a glutathionperoxidázou přeměněn na vodu [33].

U těchto dvou hub byla také detekována exprese lektinu. Mnoho výzkumníků uvádí pozoruhodně rozmanité biologické profily lektinu s širokou škálou aktivit zahrnujících protizánětlivé, antidepresivní, antikoncepční a vazodilatační aktivity [34,35,42]. Lektiny jsou proteiny vázající sacharidy s řadou buněčných funkcí, včetně in vitro a in vivo suprese růstu nádoru prostřednictvím selektivní vazby na membrány nádorových buněk nebo jejich receptory, což vede k aktivaci proteinkináz nebo modulaci imunitních odpovědí prostřednictvím produkce interleukinu. [43]. Kromě toho mají houbové lektiny také roli při spouštění různých cest buněčné smrti, včetně apoptózy, nekrózy a/nebo autofagie [42].

Naše data ukazují expresi jak osteolýzy, tak pleurotolyzinu u Pleurotus ostreatus. Jedná se o proteiny tvořící póry s vysoce selektivními protirakovinnými aktivitami [44,45]. Ostreolysin je 15 kDa cytolytický protein se schopností permeabilizovat erytrocyty a další buňky v submikromolárních koncentracích. Působí koloidním osmotickým mechanismem a vyvolává tvorbu širokých membránových pórů |46,47I. Nimri a kol. produkoval rekombinantní pleurotolysin se silnou protinádorovou aktivitou proti lidským a myším nádorovým buňkám tlustého střeva [48].

V L.edodes byly exprimovány proteiny obsahující valosin a západka. Dříve bylo uvedeno, že protein obsahující valosin máantioxidantvlastnosti, které by mohly pomoci při neuronálních syndromech, jako je Alzheimerova choroba, laterální skleróza a demence [49-51]. Latcripin je potenciální protinádorová látka [50]. Riaz Ud Din et al. (2020) zkoumali protirakovinný mechanismus západky proti buněčným liniím rakoviny prsu. Uváděli jeho schopnost indukovat buněčnou smrt a také autofagii, kromě inhibičního účinku na migraci a invazi [52].

Řada bioaktivních sloučenin byla kvantifikována v extraktech P.ostreatus a L.edodes. V současné studii byly detekovány TPN 19,37 ± 0,39 a 24,14 ± 1.{12}}1 mg/g extraktu pro P.ostreatus a L.edodes. Tyto hodnoty jsou vyšší než hodnoty zaznamenané Rahimah et al., kteří použili amonium a Shinoda testy ke kvantifikaci celkového obsahu flavonoidů v P. ostreatus jako 6,67 mg/g extraktu [53]. Naše výsledky jsou navíc vyšší než výsledky zjištěné Montibusem a kol., kteří testovali TPC v extraktech L edodes pomocí Folin-Ciocalteuovy metody a zjistili 0.8-1.5 procent suché hmotnosti (DW) v caps a 0.{16}}.1 procenta dw v stipes [54].

Katechin byl detekován v extraktech z P. ostreatus i L.edodes. Katechin je rostlinný sekundární fenolický metabolit se silnými vlastnostmi pohlcující volné radikály [55]. Bylo zjištěno, že extrakt L.edodes obsahuje flavonoid quercetin. Antioxidační účinek kvercetinu je zprostředkován regulací hladin glutathionu a zvýšením produkce antioxidačních enzymů včetně glutathion transferázy a Aldo-keto reduktázy [56]. Kromě toho se uvádí, že kvercetin má protinádorovou aktivitu prostřednictvím přerušení buněčného cyklu a podpory apoptózy [57,58]. Lee a kol. uvedli, že kvercetin způsobuje zástavu buněk v rakovinných buněčných liniích PC3, Du145 a U937 [59]. Naše výsledky také ukazují, že kempferol a apigenin byly nalezeny v P.ostreatus. Bylo prokázáno, že kaempferol a apigenin mají antioxidační a antiproliferační účinky [60-62]. Bylo zjištěno, že kyselina glutamová je nejhojnější aminokyselinou v obou houbových extraktech. Ve stejném duchu Chirinang et al. analyzovali obsah aminokyselin v P. ostreatus a P. major-caju a zjistili, že obsah kyseliny glutamové byl nejvyšší, následovala kyselina asparagová a poté arginin [63].

P.ostreatus a L. edodes vykazovaly slibné antivirové aktivity proti adenoviru a viru herpes simplex-II, přičemž SI dosáhl 4,5 pro extrakt z P. ostreatus proti adenoviru. SI byl použit k hodnocení účinnosti a bezpečnosti extraktů, protože odhaduje okno mezi cytotoxickými a antivirovými aktivitami. Čím vyšší je SI, tím je sloučenina bezpečnější a účinnější [64,65]. Související údaje nedávno ukázali Urbančíková et al., kde doplňky na bázi pleuranu (nerozpustný -1,3/1,6-D-glukan izolovaný z P. ostreatus) významně zkrátily dobu trvání viru herpes simplex -I symptomy, s nižší závažností respiračních symptomů, u pacientů pozitivních na virus herpes simplex-I než ve skupině s placebem, bez významných vedlejších účinků, což navrhuje pleurální pro možné budoucí použití v léčbě akutního viru herpes simplex-I [66].

Antivirový účinek hub je většinou způsoben interferencí s virovým vychytáváním, replikací, enzymatickou aktivitou a funkčními peptidy a také potencováním imunitního systému hostitele [67]. Seo a Choi (2021) navrhli, že -glukan v polysacharidové frakci P.ostreatus a L.edodes může být zodpovědný za jeho antiherpetický účinek prostřednictvím účinků před a po léčbě [20]. Anti-HIV účinek vodných extraktů P. ostreatus a L.edodes může být způsoben inhibicí enzymu reverzní transkriptázy proteinem podobným ubikvitinu a leptinem [68,69].

Bylo prokázáno, že vodné extrakty našich hub inhibují životaschopnost testovaných rakovinných buněčných linií přibližně o 20 procent. Také jsme viděli podobné účinky proti leukemickým a lymfomovým buněčným liniím, se snížením životaschopnosti na 66 procent u extraktu L.edodes proti buňkám leukémie THP1 a na 70,6 procent u extraktu z P.ostreatus proti leukemickým buňkám CCRF-CEM. Již dříve bylo popsáno, že vodné extrakty mycelia a plodů L.edodes mají antiproliferativní a apoptotické účinky na buňky MCF-7 rakoviny prsu[70]. Ethylacetátová frakce a -glukan L.edodes byly většinou zodpovědné za tyto akce[71,72]. Ve stejném kontextu byl extrakt z P. ostreatus schopen vykázat antiproliferativní aktivitu vůči buňkám adenokarcinomu prsu MCF-7 a MDA-MB-231 [73] a 6-vázaným glukanům extraktu potencovalo cytotoxicitu přirozeného zabijáka proti buňkám rakoviny prsu a plic [74]. Nedávno Jakopovic a spol. zjistili, že preparáty medicinálních hub sestávající ze 6 a 10 hub včetně L.edodes a P. ostreatus vykazovaly významné antiproliferativní a proapoptotické účinky na kolorektální (HCT-116, SW620) nádorové buněčné linie [75]. Autoři si naopak všimli, že účinek na buněčnou linii lidských fibroblastů (WI-38) byl proliferativní, což ukazuje specifičnost těchto přípravků z hub vůči nádorovým buněčným liniím. Podobně jsme detekovali minimální cytotoxicitu vylučovanou našimi houbami proti normálním lidským PBMC. Toto zjištění také naznačuje bezpečné používání našich hub.

Cytotoxicita hub byla připisována širokému spektru molekul včetně x- a -glukanů, proteinů, glykoproteinů, mastných kyselin, antagonistů nukleosidů, terpenoidů a fenolických sloučenin [76]. Abdalla a kol. (2012) navrhli, že extrakty z hub potlačovaly proliferaci buněk rakoviny prsu inhibicí aktivity aromatázy [77]. Imam a kol. (2021) izolovali z Ledodes kyselinu indol-3-mléčnou, která inhibovala dělení buněk plicního adenokarcinomu [78]. Yukawa a kol. (2012) navrhli, že přímý apoptotický účinek mycelia L edodes na buňky HepG2 je prostřednictvím aktivace cest kaspázových-3 a -8 receptorů smrti [79]. Wu et al. (2011) studovali cytotoxický účinek proteinového extraktu P. ostreatus na buňky lidského kolorektálního adenokarcinomu (SW480) a lidskou monocytární leukémii, THP-1(buňky), a uvedli vznik ROS, vyčerpání glutathionu, alteraci mitochondriálního membránového potenciálu a dezintegraci oligonukleozomální DNA, což vede k apoptóze buněk SW480 [80].

Protože antioxidanty nepůsobí jediným mechanismem, hodnocení antioxidační kapacity se obvykle provádí více než jednou metodou [81]. V této studii byly použity tři metody hodnocení, jmenovitě testy DPPH, ABTS a ORAC. Antioxidační mechanismus SET (single electron transfer) byl hodnocen pomocí testu DPPH, zatímco testy ABTS a ORAC byly použity pro reakce HAT (přenos atomů vodíku) [81]. Test ORAC poskytuje přesnější odhady, protože kombinuje dobu inhibice a stupeň inhibice v jediném termínu [82]. Zatímco fosfomolybdenátový test se běžně používá k vyjádření celkové antioxidační kapacity (TAC), používají se všechny tři metody

v tomto rukopisu byly hlášeny vyhodnocení TAC. Munteanu a Apetrei (2021) ve svém přehledu metod používaných při určování antioxidační aktivity popsali test ABTS radikálů jako „jednoduchou a pohodlnou metodu používanou k měření celkové antioxidační kapacity (TAC)“[83]. Ve své srovnávací studii Csepregi et al. (2016) porovnali čtyři metody použité pro hodnocení TAC, což byla ekvivalentní antioxidační kapacita Trolox (TEAC), železitý redukující antioxidační potenciál (FRAP), 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) test vychytávání radikálů a reaktivita činidla Folin-Ciocalteu (FCR)[84]. V roce 2013 Ou et al. představili ORAC jako novou metodu pro hodnocení TAC[85]. Ve stejném duchu Rubio et al. (2016 ) zařadil test ORAC mezi přímé metody pro stanovení TAC spolu s TEAC [86]. Výsledky testů ABTS a ORAC ukazují, že extrakty P. ostreatus a L.edode mají antioxidační kapacitu, která je vyšší než u standardního antioxidantu Trolox.

Antioxidační účinek těchto dvou hub lze přičíst přítomnosti mnoha bioaktivních složek včetněflavonoidy, fenoly, bioaktivní peptidy a vitamín C[87]. Gaber a kol. porovnali testy ABTS, DPPH, železitý redukující antioxidační výkon (FRAP) a ORAC pro hodnocení antioxidační kapacity guava extraktů a uvedli pozitivní korelaci mezi antioxidačními schopnostmi, jak byly stanoveny čtyřmi metodami, a obsahem vitamínu C a TPN. Na druhou stranu zaznamenali negativní korelaci s obsahem karotenoidů [88]. DPPH(1,1-difenyl-2-pikryl-hydrazyl) je stabilní volný radikál, který má na jednom atomu dusíkového můstku nepárový valenční elektron; vychytávání DPPH radikálu je tedy základem populárního antioxidačního testu DPPH[89]. Radikálový kationt 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonát) (ABTS) ztrácí svou modrou barvu, když je redukován antioxidantem a barevnou změnu lze kvantifikovat spektrofotometricky [90]. Test ORAC měří oxidační degradaci fluorescenční sondy volnými radikály, které jsou přerušeny antioxidační látkou. V souladu s tím, čím silnější je antioxidační kapacita, tím kratší je doba potřebná k uhašení fluorescence [91]. Navíc, protože testované extrakty vykazovaly při testování výše uvedenými metodami slibné antioxidační účinky, lze konstatovat, že působí prostřednictvímpohlcování volných radikálů. Testované houby však obsahovaly značný celkový obsah flavonoidů, a protože flavonoidy byly spojovány s aktivací transkripčního faktoru Nrf2 (2017), lze to přidat jako domnělý mechanismus [92].

4. Materiály a metody

4.1. Příprava druhů hub a subkultivace

Dříve identifikované houby P. ostreatus a L.edodes byly získány jako potěr a/nebo plodnice ze sbírky kultur Zemědělského výzkumného střediska, Káhira, Egypt [93,94]. Chirurgické čepele byly použity k aseptickému řezání plodů pro subkultivaci z plodnic hub. Vnitřní mycelia byla sklizena pomocí sterilních jehel a subkultivována na sterilních miskách s bramborovým dextrózovým agarem (PDA) (Merck, Darmstadt, Německo)95]. Pro subkultivaci plísňových potěrů byly použity sterilní kleště k sebrání semen a jejich aseptickému přenesení na sterilní PDA plotny, které byly poté inkubovány při 28 stupních po dobu 7 dnů a plodnice každého kmene byly omyty odděleně. Každý izolát (500 g) byl ponechán po dobu 48 hodin při teplotě místnosti, aby se vyschl na vzduchu, ručně rozemlet v kuchyňském mlýnku a skladován při teplotě místnosti v dobře větraném prostoru pro budoucí použití.

4.2. Vodná extrakce Pleurotus Ostreatus a Lentinus Edodes

Sušené ovoce každého izolátu bylo rozemleto na 500 g prášku za použití domácího mixéru, poté třikrát macerováno v 7 l destilované vody při pokojové teplotě po dobu tří dnů, ultrasonikováno (ultrazvukový čistič, Anglie, Velká Británie) a poté filtrováno. Proces macerace a filtrace se opakoval až do vyčerpání kapaliny. K uchování výtěžku byl použit ethanol. Po odpaření ethanolu při 45 stupních bylo celkem 500 ml každého izolátu lyofilizováno, čímž bylo získáno přibližně 20 g suchého zbytku každého extraktu [96].

4.3. Proteomická analýza

Proteomická analýza byla provedena v proteomické a metabolomické jednotce v Children's Cancer Hospital Egypt 57,357 (CCHE), Káhira, Egypt. Přibližně 600 ul 8 M močoviny v 500 mM Tris (pH 8,5) a 60 ul kompletních ultra-proteáz (Roche , Mannheim, Německo) byly přidány do každého vzorku a poté byly vzorky důkladně protřepány a odstřeďovány při 10,000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Supernatanty byly shromážděny a frakce (1 ug/10 μl) byly injikovány pomocí systému NanoLC. Systém hmotnostní spektrometrie triple TOF (Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord) byl spojen s kapalinovou chromatografií (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), sestávající z autosampleru Eksigent nanoLC400 připojeného k pumpa Ekspert nanoLC425, s průtokem 10 μL/min po dobu 55 minut, pro každý vzorek [97]. Analýza dat byla provedena pomocí ProteinPilot (verze 5.0.1.0,4895) a Paragon Algorithm (verze 5.0.1.0,4874). Proteinové sekvence byly porovnány se sekvencemi v Swiss-Prot a databázi TrEMBL (Pleurotus sp. obsahující 14 792 záznamů pro P. ostreatus a Lentinula sp. obsahující 12 603 záznamů pro L.edodes)[98]. Běžně identifikované proteiny mezi druhy hub byly ilustrovány pomocí softwaru Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, Anglie, Velká Británie).

4.4. Charakterizace bioaktivních sloučenin

Jak bylo uvedeno dříve, celkový obsah rozpustných sacharidů byl stanoven pomocí techniky fenolsírové kyseliny [100]. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD) a experimenty byly prováděny trojmo.

Celkový obsah fenolů (TPC) a celkový obsah flavonoidů (TFC) byly stanoveny, jak uvádí Ryan et al. [101]. Vzorky byly připraveny v koncentraci 20 mg/ml ve vodě. Kyselina gallová (1 mg/ml zásobní roztok) byla připravena v methanolu. Rutin (1 mg/ml zásobní roztok) byl připraven v methanolu. Standardy a vzorky kyseliny gallové byly pipetovány do jamek destičky v šesti replikátech a měřeny při 630 nm. Každý z 10 standardů a vzorků rutinu v šesti replikátech byl měřen při 420 nm.

HPLC analýza celkových fenolických látek a flavonoidů byla provedena podle metody Singha et al. [102]. Každý ze vzorků a 10 různých standardních roztoků byly rozpuštěny v methanolu a zfiltrovány pomocí 0,22 um injekčních filtrů a poté bylo 100 μl každého vzorku a 10 ul každého standardu nastříknuto pomocí HPLC kolony Waters 2690 Alliance HPLC systém vybavený detektorem fotodiodového pole Waters 996. Kolona C18 Inertsil ODS3:4,6×250 mm,5 um; mobilní fáze: pufr (0,1 procenta kyseliny fosforečné ve vodě); methanolový režim eluce byl gradient s průtokem 1 ml/min při vlnové délce 280 nm.

Pro analýzu vitamínů rozpustných ve vodě byly testovány extrakty z hub (50 mg/ml), referenční standardy (10 mg v 10 ml 0,05 M hydroxidu sodného) každého z sedm vitamínů rozpustných ve vodě (thiamin HCl, kyselina askorbová, riboflavin, kyselina nikotinová, nikotinamid, pyridoxin HCl a kyselina listová)[103] a z vitamínů rozpustných v tucích roztoky (50 mg/ml) tří extraktů z hub a byl připraven standardní roztok tří tukových vitamínů: E, D3 a A v methanolu o 806,2, 114 a 400 IU/ml. Roztoky byly poté zředěny na 100 ug/ml, přefiltrovány pomocí 0,22 um injekčního filtru a 100 ul bylo nastříknuto na HPLC kolonu, Waters 2690 Alliance HPLC systém (Milford, CT, USA) vybavenou detektorem s fotodiodovým polem Waters 996. Kolona Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm,5 μm; mobilní fáze: pufr (0,85 g sodné soli hexansulfonové kyseliny v 1000 ml vody a pH bylo upraveno na 3 kyselinou ortofosforečnou); methanolová eluce byla gradientní při průtokové rychlosti 1 ml/min při vlnové délce 210 nm [104].

4.5. Analýza proteinů a aminokyselin

Složení aminokyselin houbových extraktů bylo hodnoceno pomocí Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Německo) vybaveného systémem dodávky rozpouštědla, S 2100 (kvartérní čerpadlo s rozsahem průtoku {{ 24}}.01 až 10.00 ml/min a maximální tlak až 400 bar), automatický vzorkovač, S5200, modul pro reakci aminokyselin, S4300 (s vestavěným dvojitým filtrem fotometr při 570 nm) a chlazený organizér činidel, S4130. Jeden gram každého houbového extraktu byl smíchán s 5 ml hexanu a ponechán macerovat po dobu 24 hodin a poté byla směs zfiltrována pomocí Whatman no. 1 filtrační papír. Zbytek byl umístěn do zkumavky obsahující 10 ml 6N HC1 a inkubován v sušárně při 110 stupních po dobu 24 hodin. Po inkubaci byla provedena filtrace pomocí Whatman č. 1 filtrační papír s následným odpařením na rotační odparce. Zbytek byl zcela rozpuštěn ve 2 ml ředicího pufru (dehydrát citrátu sodného 0,06 M, kyselina citrónová 0,03 M, fenol 0,02 M, thiodiglykol 1,4 procenta, HC1 32 procent), zředěný 1000-krát ve stejném pufru a poté nanesena na kolonu s amoniakovým filtrem (LCA, K04/Na, 4,6 x 100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Německo) vybavenou automatickým analyzátorem aminokyselin (Sykam) [105].

4.6. Buněčné kultury

Buňky rakoviny děložního čípku (HeLa), akutní monocytární leukémie (Thpl), kolorektálního karcinomu (Colo{0}}) a karcinomu slepého střeva (LS{1}}) byly udržovány v médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Lonza, Kolín nad Rýnem, Německo) doplněné o 100 mg/ml streptomycinu, 100 jednotek/ml penicilinu a 10 procent tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra. Další buněčné linie: lidská leukémie (CCRF-CEM); akutní promyelocytární leukémie (NB-4); lidský lymfom (U937); rakovina prostaty (DU-145 a PC3); hepatocelulární karcinom (HepG2); adenokarcinom prsu (MCF-7 a MDA-MB-231); Vero; a Hep{15}} buňky byly subkultivovány na Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, Kalifornie, USA) a inkubace byla prováděna při 37 stupních ve vlhké atmosféře s 5 procenty CO2. Buněčné linie byly získány od Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Cairo, Egypt), zatímco primární mononukleární buňky periferní krve (PBMC) a normální lidské buňky (ATCC PCS-800-011TM) byly zakoupeny od Viscera, Cairo, Egypt. Tato práce byla schválena Výborem pro etický výzkum Farmaceutické fakulty Univerzity Ain Shams (schválení č. 294).

4.7.Antiirální aktivita

Antivirová aktivitabyl testován proti adenoviru typu 7 (Ad7) a viru herpes simplex typu II (HSV-2) (Nawah Scientific, Mokattam, Egypt). Antivirová aktivita byla hodnocena, jak bylo popsáno dříve [106]. Buňky Vero a Hep{5}} byly nasazeny do 96-jamkové kultivační destičky v hustotě 2× 10* buněk/jamku jeden den před infekcí. Buněčné kultivační médium (část 4.6) bylo odstraněno následující den a k promytí buněk byl použit fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS). Infekčnost lidského adenoviru a viru herpes simplex typu II byla stanovena pomocí metody sulforhodamin B(SRB), která sledovala cytopatické účinky (CPE) a vypočítala procento buněčné životaschopnosti [107]. Antivirová aktivita byla vypočtena na základě schopnosti extraktů z hub inhibovat virové CPE, kde 50procentní cytotoxická koncentrace (CC5o) a 50procentní inhibiční koncentrace (IC50) byly stanoveny pomocí softwaru GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego , CA, USA). Index selektivity (SD) byl vypočten tak, jak uvádí Dogan et al. [108] podle rovnice (1)Index selektivity (SI)=CC50/IC50

4.8. Cytotoxicita proti PBMC pomocí testu MTT

Cytotoxicita byla hodnocena pomocí testu MTT【109】. Alikvoty (100 μl) buněčných suspenzí (hustota buněk 1.2-1,8×10* buněk/jamka) byly umístěny na 96-jamkové destičky, bylo přidáno kompletní médium a buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin. Poté byly buňky ošetřeny sériovým ředěním houbových extraktů po dobu 48 hodin. Roztok MTT (5 mg/ml) v PBS byl přidán do jamek a inkubován po dobu 4 hodin a absorbance při 570 nm byla odečtena pomocí čtečky mikrodestiček. Neošetřené buňky byly použity jako negativní kontroly a buňky ošetřené doxorubicinem (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) sloužily jako pozitivní kontrola.

4.9. Hodnocení cytotoxické aktivity pomocí SRB proti rakovinným buněčným liniím

Cytotoxicita proti rakovině prostaty (DU{{0}} a PC3); hepatocelulární karcinom (HepG2); kolorektální karcinom (Colo-205); karcinomu slepého střeva (LS-513); rakovinu děložního čípku (HeLa); a buněčné linie adenokarcinomu prsu (MDA-MB-231 a MCF-7) byly hodnoceny pomocí kolorimetrického testu se sulforhodaminem B (SRB) [110]. Buněčné suspenze v kompletním médiu (4.6) byly inkubovány v 96-jamkových destičkách po dobu 24 hodin. Poté byly přidány různé koncentrace (0 až 100 ug/ml v kompletním médiu) houbových extraktů a inkubovány po dobu 72 h. Neošetřené buňky byly použity jako negativní kontroly a buňky ošetřené doxorubicinem sloužily jako pozitivní kontrola.

4.10. Životaschopnost leukemických a lymfomových buněčných linií pomocí testu WST-1

Cytotoxicita proti lidské leukémii (CCRF-CEM), akutní promyelocytární leukémii (NB4), akutní monocytární leukémii (THP1) a lidskému lymfomu (U937) byla stanovena testem ve vodě rozpustné tetrazoliové soli (WST{5}}) pomocí Abcamkit ( ab155902 WST-1 Cell Proliferation Reagent, Spojené království). Buněčné suspenze byly inkubovány po dobu 24 hodin a poté ošetřeny různými koncentracemi (0 až 100 ug/ml v kompletním médiu) extraktů hub po dobu 48 hodin. Buňky byly poté ošetřeny 10 μl činidla WST-1 po dobu 1 hodiny a A450 byl odečten pomocí čtečky mikrodestiček [111]. Neošetřené buňky byly použity jako negativní kontroly a buňky ošetřené doxorubicinem (Sigma-Aldrich, Německo) sloužily jako pozitivní kontrola.

4.11. Antioxidační aktivita

4.11.1. Činnost DPPH zachycující radikály

Test vychytávání radikálů DPPH byl proveden podle metody Lu et al. [112]. Výsledné snížení barvy DPPH bylo měřeno při 540 nm.Antioxidační aktivitabyla vyjádřena jako procento inhibice s odkazem na kalibrační křivku (R2=0.9903). Údaje jsou uvedeny jako průměr ± SD podle rovnice (2): (procento aktivity antioxidantu=[(abs-blank-abs-vzorek)/abs-blank]×100)

(2) kde abs-blank a abs-vzorek označují absorbanci slepého vzorku a vzorku. Byla odhadnuta koncentrace vzorku potřebná k inhibici poloviny volných radikálů (IC50).

4.11.2.ABTS (2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) Aktivita vychytávání kationtů radikálů

Test byl proveden, jak bylo popsáno dříve 【113】. Houbové extrakty (10 μl 0 až 100 ug/ml roztoků) byly smíchány se 190 μl čerstvě připraveného ABTS (Sigma-Aldrich Německo) v 96-jamkových destičkách a inkubovány ve tmě při pokojové teplotě po dobu 2 h. Každý vzorek byl testován ve čtyřech replikátech a absorbance byla měřena při 734 nm. Antioxidační aktivita byla vyjádřena jako procento inhibice (Rovnice (1)) s odkazem na kalibrační křivku (R2=0.9948).

4.11.3. Test kyslíkové radikálové absorpční kapacity (ORAC).

Analýza byla provedena tak, jak bylo dříve stanoveno [62], s menšími úpravami. Stručně řečeno, 12,5 ul houbových extraktů, v triplikátech, bylo inkubováno se 75 ul fluoresceinu (10 nm) po dobu 30 minut při 37 stupních. Měření fluorescence (485 EX, 520 EM, nm）) bylo provedeno ve třech cyklech (doba cyklu=90 s）. Poté bylo 12,5 μl čerstvě připraveného 240 mm roztoku 2,2'-Azobis 2- Do každé jamky byl okamžitě přidán amidinopropandihydrochlorid (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, UK) a měření fluorescence pokračovalo po dobu 2,5 h (85 cyklů, každých 90 s). tvorby peroxylových radikálů rozkladem AAPH. Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina), ve vodě rozpustný vitamín E Antioxidační aktivita byla vyjádřena jako procento inhibice (Rovnice (1) s odkazem na kalibrační křivku (R2= 0.9957).

4.12 Statistická analýza

Byly provedeny trojité chemické testy a výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylky. Statistické analýzy byly provedeny pomocí jednocestné ANOVA.

Významnost rozdílů mezi průměry byla hodnocena pomocí Tukey-Kramerova testu vícenásobného srovnání. Za statisticky významnou byla považována p-hodnota menší nebo rovna 0,05. Statistické vyhodnocení bylo stanoveno pomocí softwaru GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA).

5. Závěry

Houby P. ostreatus a L.edodes obsahují širokou škálu bioaktivních látek. Analýza proteomu ukázala expresi více bioaktivních molekul s četnými biologickými aktivitami. Vodné extrakty z hub jsou slibnéantivirovýaktivity proti adenoviru typu 7 a viru herpes simplex typu II. CPE byly detekovány proti rakovinným buněčným liniím, ale ne proti normálním lidským PBMC. Tato studie podporuje použití těchto hub pro farmakologické účely ve světle jejich nízké cytotoxicity na normální PBMC, navíc k jejich antivirovým, protinádorovým a antioxidačním schopnostem.

Reference

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, WC; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, FAR; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; a kol. Lentinus crinitus basidiocarp Třeň a pileus: Chemické složení, cytotoxicita a antioxidační aktivita. Eur. Food Res. Technol. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; Stephen, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Antibakteriální aktivita, in vitro antioxidační potenciál a GC-MS charakterizace metanolového extraktu Gymnopilus Junius, divoké houby z jižního západního Ghatsu v Indii. Eur. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA Výživové a lékařské výhody Agaricus bisporus: Přehled. J. Microbiol. Biotechnol. Food Sci. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN Zlepšení výnosu jedlé a medicinální houby Lentinula edodes na pšeničné slámě použitím doplňkového výtěru. Braz. J. Microbiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; Gil, M.; Benchetrit, L.; Cruz, F. Antibakteriální aktivita látky produkované houbou Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177–181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Antibakteriální aktivita Lentinula edodes pěstovaných v kapalném médiu. Braz. J. Microbiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, H.-O.; Kim, H.-M.; Yun, J.-W. Hypoglykemický účinek surových exopolysacharidů produkovaných medicinální houbou Phellinus baumii u diabetických potkanů ​​indukovaných streptozotocinem. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, BC; Maeda, Y.; Zlatník, CE; Rooney, PJ; Loughrey, A.; Rao, J.; Moore, JE Vyšetření antibakteriálních a protiplísňových vlastností složek hub Shiitake (Lentinula edodes) a Hlívy ústřičné (Pleurotus ostreatus). Doplněk. Ther. Clin. Praxe. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Kinetika růstu mycelia a optimální teplotní podmínky pro pěstování jedlých druhů hub na lignocelulózových substrátech. Folia Microbiol. 2001, 46, 231–234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Pěstování Pleurotus ostreatus a dalších jedlých hub. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]