czJazyk
Domů / Znalost / Obsah

Znalost

Ochranné účinky Cistanche proti H2O2/UVB-indukované degradaci kolagenu dermálních fibroblastů prostřednictvím Hsa-microRNA-4535-zprostředkované signalizace TGF/Smad

May 06, 2023

ABSTRAKTNÍ

Cílem této studie bylo prozkoumat mechanismus, který je základemochranné účinky cistancheproti poškození vyvolanému H2O2/UVB pomocí in vitro a in vivo modelů fotopoškození. Navíc jsme identifikovali zapojení regulace miRNA do tohoto procesu. Lidské dermální fibroblasty HS68 ošetřené H2O2/UVB a nahé myši C57BL/6J indukované UVB byly použity jako modely fotopoškození in vitro a in vivo. Výsledky to ukázalycistanche léčbazmírnil H2O2/UVB-indukované snížení životaschopnosti buněk, Porucha signalizace TGF/Smada dermální stárnutí. Na základě výsledků analýz mikroRNA pole a prohledávání databáze byl has-miR-4535 identifikován jakopotenciální kandidátní miRNA, která cílí na Smad4. In vitro ošetření cistanche aktivovalo komplex Smad2/3/4 a inhibovalo expresi hsa-miR-4535 v buňkách vystavených H2O2/UVB. In vivo lokální aplikace nízkých (12 mg/kg) a vysokých dávek (24 mg/kg) cistanche na dorzální kůži nahých myší C57BL/6J významně zmírnila fotopoškození kůže vyvolané UVB zářením tím, že podpořila signalizaci syntézy kolagenu TGF/Smad, snížení epidermální hyperplazie, tvorby vrásek a stárnutí kůže a také inhibice exprese hsa-miR-4535. Celkově naše zjištění naznačují souvislost mezi signalizací syntézy hsa-miR{16}} a TGF/Smad kolagenu a naznačují, že tyto faktory se podílejí na fotoprotektivním mechanismu cistanche v dermálních fibroblastech proti stárnutí vyvolanému H2O2/UVB. Důkazy tomu nasvědčovalycistanche s vlastnostmi proti stárnutímůže býtpovažován za doplněk vprodukty na péči o pleť.

Protective effects of cistanche

Výrobek péče o pleť Cistanche na prodej

ÚVOD

Mezi klinické příznaky stárnutí lidské kůže patří zvýšená tvorba vrásek, laxnost a nepravidelná pigmentace [1]. Proces stárnutí pleti je komplikovaný a lze jej rozdělit do dvou typů: vnitřní stárnutí a vnější stárnutí. Vnitřní stárnutí je způsobeno postupem času a genetickými faktory, zatímco vnější stárnutí, také nazývané fotostárnutí, je důsledkem především vystavení ultrafialovému záření [2, 3]. Předchozí studie ukázaly, že velké množství reaktivních forem kyslíku (ROS) vzniká během vnitřního i vnějšího stárnutí. Akumulace ROS může vyvolat signalizaci mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) a aktivovat její downstream transkripční faktor, aktivátorový protein-1 (AP-1). Aktivovaný AP-1 se může přemístit do jádra a vázat se na promotorové oblasti matricových metaloproteináz (MMP) [4]. MMP jsou velkou skupinou endopeptidáz závislých na zinku, která přispívá k degradaci extracelulární matrice kožní dermis (ECM). Zejména MMP-1, kolagenáza, se podílí na štěpení kolagenu typu I a III [5]. Kolagen typu I a III, hlavní složky ECM, jsou schopny poskytovat podporu a sílu kožní dermis a jejich disarifikace vede k charakteristickému vrásnění a ochabnutí stárnoucí kůže [6]. Transformující růstový faktor-beta (TGF ) je všudypřítomný a silný cytokin se třemi různými izoformami, TGF 1, TGF 2 a TGF 3, který může pozitivně regulovat syntézu kolagenu v lidské kožní dermis [2]. TGF iniciují svůj signál interakcí se specifickými komplexy receptoru serin/threonin kinázy na povrchu buněk, včetně receptorů TGF typu I (TRI) a II (TRII). Fosforylace TRI spouští fosforylaci R-Smad (Smad2 a Smad3). Aktivované R-Smad interagují se Smad4 za účelem regulace jeho translokace jádra a transkripčně aktivují kolagen typu I a III prostřednictvím vazby na promotory Smad-binding elements (SBE) [7, 8]. Přibývající důkazy naznačují, že zvýšená tvorba ROS, vyvolaná vnitřním nebo fotostárnutím, přispívá k poškození signální dráhy TGF/Smad, což má za následek sníženou syntézu kolagenu v dermálních fibroblastech lidské kůže [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxyflavon), přírodní člen rodiny flavonoidů, se hojně vyskytuje v Alpinia officinarum a propolisu. cistanche je potenciálním kandidátem na léčbu ischemické cévní mozkové příhody, diabetu a různých typů rakoviny [11–13]. Kromě toho má cistanche aktivitu pohlcující radikály a protizánětlivé aktivity [14, 15]. Již dříve jsme ukázali, že cistanche snižuje H2O2-indukovaný zánět a podporuje tvorbu kolagenu prostřednictvím signálních drah receptoru inzulínu podobného růstového faktoru 1 (IGFI-R)/ERK1/2 v buňkách HS68 [16, 17]. Kromě toho studie ukázala, že cistanche byla identifikována jako sloučenina Alpinia officinarum a má inhibiční účinky na kolagenázu v buňkách dermálních fibroblastů [18]. Nicméně podrobnější molekulární mechanismus související s tím, jak cistanche reguluje stárnutí kůže, není znám. MikroRNA (miRNA) jsou skupinou malých jednořetězcových nekódujících molekul RNA s průměrnou délkou 22 nukleotidů. Zralé miRNA jsou transkribovány ze sekvencí DNA. Ve většině případů se zralé miRNA vážou na 3′-nepřeložené oblasti (UTR) cílových mRNA, aby umlčely translaci mRNA [19]. V lidské kůži hrají miRNA zásadní roli v regulaci buněčného metabolismu, rakoviny, stárnutí a tvorby kolagenu [20–23]. Například miR-377 může indukovat stárnutí dermálních fibroblastů inhibicí exprese DNA methyltransferázy 1 (DNMT1), což následně vede k menší methylaci v promotoru p53 a stárnutí dermálních fibroblastů [22]. Profil miRNA při poškození způsobeném UVB zářením v buňkách lidské dermální papily (nHDP) byl již dříve zkoumán [24]. Nicméně, jak UVB-indukované stárnutí dermálních fibroblastů prostřednictvím regulace miRNA, zejména v zapojení přírodní sloučeniny, je do značné míry neznámé. Cílem této studie bylo prozkoumat ochranné účinky cistanche proti dermálnímu poškození vyvolanému H2O2/UVB a také roli mikroRNA zprostředkované degradace kolagenu v tomto procesu. Dále jsme se zaměřili na identifikaci mikroRNA zapojených do regulace syntézy kolagenu.

Protective effects of cistanche

VÝSLEDEK

cistanche inhibuje UVB/H2O2-indukovanou cytotoxicitu u lidských dermálních fibroblastů HS68

Pro zkoumání cytotoxicity cistanche (obrázek 1A) in vitro byly buňky HS68 ošetřeny různými dávkami cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) po dobu 24 hodin. Výsledky testu MTT ukázaly, že cistanche nebyl cytotoxický pro buňky HS68 (obrázek 1B). Dále jsme vystavili buňky HS68 různým dávkám H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) a UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) po dobu 24 hodin. Léčba H2O2 a UVB snížila životaschopnost buněk způsobem závislým na dávce (obrázek 1C, 1D). Vyhodnotit cytoprotektivní vlastnosti cistanche následujícíH2O2 a UVB expozici jsme ošetřili buňku HS68různá koncentrace cistanche (10, 20, 30 μM)po H2O2- (200 μM) a indukované UVB zářením (40mJ/cm²) poškození. H2O2 nebo samotné UVB ošetřenívýznamně snížila (40 procent) životaschopnost HS68buňky. Léčba cistanche však zabránila buněčné smrtizpůsobem závislým na koncentraci (obrázek 1E, 1F).Výrazně vyšší koncentrace cistanche (30 μM).Alenied H2O2- cytotoxicita vyvolaná UVB zářením.Proto byla použita dávka 30 μM cistanche vnásledujícíin vitrostudie pro hodnocení jeho ochranyúčinky v buňkách HS68.

Protective effects of cistanche

Obrázek 1. cistanche inhibuje UVB/H2O2-indukovanou cytotoxicitu u lidských dermálních fibroblastů HS68. (A) Chemická struktura cistanche. (B) Buněčná životaschopnost buněk HS68 ošetřených různými koncentracemi cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) po dobu 24 hodin. (C a D) Buněčná životaschopnost buněk HS68 vystavených různým dávkám H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 uM) nebo ozářených UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) po dobu 24 hodin. (E a F) Buněčná životaschopnost buněk HS68 vystavených H2O2 (200 uM) nebo ozářených UVB (40 J/cm2) po dobu 1 hodiny a poté ošetřených cistanche (10, 20, 30 uM) po dobu 23 hodin. Cytoprotektivní účinky cistanche byly stanoveny testem MTT. Kontrolním buňkám byla přiřazena 100% životaschopnost. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SE. Kvantifikace výsledků je ukázána (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetřené kontrolní buňky; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. buňky ošetřené H2O2 nebo UVB.



Cistanche zeslabuje H2O2-indukovanou buňku HS68spíše senescence než apoptóza

Abychom určili, zda snížení životaschopnosti buněk bylo způsobeno buněčnou smrtí nebo inhibicí růstu, zkontrolovali jsme expresi několika markerů apoptózy a přežití westernovým přenosem v buňkách HS68 vystavených různým dávkám H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM ) po dobu 24 hodin. Zjistili jsme významně sníženou expresi markerů přežití, jako je p-Akt, a zvýšenou expresiapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 uM H2O2 (obrázek 2A). Dále jsme provedli průtokovou cytometrii pro hodnocení apoptotických buněk pomocí barvení Annexinem V a PI a pozorovali jsme podobné výsledky. Celkem vzato, 200 μM H2O2 nezpůsobilo apoptózu buněk HS68 (obrázek 2B). Dále jsme detekovali expresi několika senescentních markerů, jako jsou p16, p21 a SA{11}}gal, abychom určili senescentní buňky. Naše výsledky ukázaly, že léčba cistanche významně snížila hladiny proteinu p16 a p21 indukované H2O2-a také počet SA- -gal-pozitivních buněk (obrázek 2C, 2D).


Cistanche tlumí UVB/H2O2-indukovanou intracelulární/mitochondriální produkci ROS a nerovnováhu MMP v buňkách HS68

Oxidační stres hraje klíčovou roli u různých onemocnění a může být vyvolán endogenními nebo exogenními faktory. Zde jsme použili H2O2 jako endogenní a UVB jako exogenní faktor k indukci oxidačního poškození a poté jsme zkoumali aktivity cistanche eliminující ROS. K identifikaci zdrojů ROS byly použity MitoSOX a DCFH-DA ke stanovení intracelulárního a mitochondriálního ROS. Výsledky barvení ukázaly, že ošetření H202 a UVB indukovalo akumulaci ROS, zatímco ošetření cistanche snížilo tvorbu ROS (obrázek 3A, 3B). vnavíc, protože nevyvážená MMP může iniciovat buněčnou smrt, použili jsme JC-1 ke stanovení změn v MMP. Normální mitochondrie fluoreskovaly červeně (JC-1 dimery), zatímco poškozené mitochondrie fluoreskovaly zeleně (JC-1 monomery). Expozice UVB a H2O2 vyvolala vysoké úrovně zelené fluorescence. Je pozoruhodné, že léčba cistanche posunula zelenou fluorescenci na červenou, což ukazuje na oživení mitochondriálních funkcí (obrázek 3C).

Protective effects of cistanche


cistanche zeslabuje H2O2-indukovaný TGF /Smadpoškození dráhy syntézy kolagenu v buňkách HS68

Signalizace TGF/Smad přispívá k tvorbě kolagenu v dermálních fibroblastech lidské kůže [25–27]. Proto jsme zkoumali roli syntézy cistanche inkolagenu cestou TGF/Smad v buňkách HS68 vystavených H2O2. Výsledky Western blot ukázaly, že cistanche významně zvýšily signalizaci TGF/Smad a také syntézu kolagenu v buňkách HS68 vystavených H2O2- (obrázek 4A). Dezorganizace kolagenu typu I a III je navíc jednou z typických charakteristik starých kožních fibroblastů [28]. Protože se rodina MMP podílí na katabolismu kolagenu [29], potvrdili jsme dále vliv cistanche na aktivaci MMP-1. Zjistili jsme, že cistanche zabraňuje degradaci kolagenu v buňkách HS68 potlačením hladiny H2O2-zvýšené hladiny MMP-1 (obrázek 4A).
Dále jsme identifikovali subcelulární molekulární mechanismus, který je základem tohoto ochranného působení, porovnáním buněk HS68 ošetřených samotnou H2O2 nebo společně ošetřených s cistanche pomocí imunoblotu a imunofluorescenčního barvení. Léčba cistanche zvýšila jadernou akumulaci p-smad2/3 a Smad4, která byla narušena expozicí H2O2 v buňkách HS68(Obrázek 4B, 4C). Tato zjištění ukázala, že cistanche může zlepšit H2O2-indukovanou fragmentaci kolagenu aktivací TGF/Smad dráhy v HS68 buňkách.


Léčba Cistanche snižuje H2O2-indukovanou upregulovanou expresi hsa-miR-4535, u níž se předpokládá, že bude cílit na Smad4

Analýza miRNA polecistanche ošetřenéBuňky HS68 odhalily, že exprese hsa-miR-4535 byla snížena ve skupině léčené cistanche ve srovnání s expresí v kontrolní skupině (obrázek 5A). Dále jsme pomocí miRNA databází, jako je miRDB a TargetScanHuman, předpověděli domnělé konzervované cílové místo pro hsa-miR-4535 v Smad4-3′-UTR (obrázek 5B). Po potvrzení cílového místa byly reportérové ​​konstrukty Smad4-3′-UTR-WT a Smad4-3′-UTR MT transfekovány do buněk HS68, aby se ověřila přímá vazba hsa-miR-4535 na Hloupé4-3′-UTR. Pozorovali jsme 50procentní snížení luciferázových aktivit mezi skupinami divokého typu a mutovanými skupinami Smad4-3′-UTR po hsa-miR-4535 mimických transfekcích (obrázek 5C). Poté jsme hodnotili účinky H2O2 (100 200 μM) na regulaci hsa-miR-4535 a Smad 4 v buňkách HS68 a zjistili jsme, že H2O2 v závislosti na dávce zvyšuje hsa-miR-4535 a potlačuje Smad4 RNA exprese (obrázek 6A, 6B). Kromě toho byl tento trend v expresi hsa-miR-4535 a Smad4 po léčbě cistanche zvrácen, což naznačuje, že regulace signalizace Smad se může podílet na cistanche zprostředkovaném zmírnění poškození buněk HS68 vyvolaného H2O2- (obrázek 6C, 6D). Celkově tyto výsledky naznačují, že cistanche zeslabuje H2O2-indukované poškození dráhy TGF/Smad snížením exprese hsa-miR-4535 v dermálních fibroblastech lidské kůže.


Protective effects of cistanche

Obrázek 4. cistanche zeslabuje poškození dráhy syntézy kolagenu TGF/Smad H2O2- v buňkách HS68. (A) Buňky HS68 byly vystaveny působení H2O2 (200 uM) po dobu 1 hodiny a poté ošetřeny cistanche (30 uM) po dobu 23 hodin. Proteinová exprese komponent dráhy související se syntézou kolagenu (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) a proteinu souvisejícího s degradací kolagenu (MMP-1) byly detekovány pomocí western blotu. (B) Proteinová exprese p-smad2/3 a Smad4 v jaderných a cytosolových frakcích byla detekována westernovým přenosem. GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SE. Je zobrazena kvantifikace výsledků (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetřené kontrolní buňky; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. buňky ošetřené H2O2-. (C) Anti-p-Smad2/3, protilátka Smad4 a sekundární protilátka konjugovaná s FITC/PE byly použity k detekci exprese p-Smad2/3 (zelená) a Smad4 (červená). DAPI označilo umístění jádra (modře). Snímky byly zachyceny pomocí fluorescenčního mikroskopu (200×).


Modulace Smad4 pomocí has-miR-4535 se podílí na syntéze kolagenu v dermálních fibroblastech lidské kůže vystavených H2O2-

Abychom dále určili mechanismy, kterými has-miR-4535 uplatňuje svůj účinek na expresi Smad4 a jeho downstream signalizaci v buňkách HS68, transfekovali jsme buňky HS68 napodobeninami nebo inhibitory hsa-miR{6}} a měřili Smad4 a jeho downstream exprese kolagenu. Výsledky ukázaly, že inhibice hsa-miR-4535 inhibitorem hsa-miR-4535 významně zvrátila downregulaci exprese mRNA Smad4 a proteinu v buňkách HS68 ošetřených H2O2- (obrázek 7A–7C) . Kromě toho suprese hsa-miR-4535 částečně obnovila H2O2-indukované poškození COL1A1 a COL3A1 u buněk HS68 ošetřených H2O2- (obrázek 7C). Naopak zvýšená exprese hsa-miR-4535 jako výsledek mimické transfekce hsa-miR-4535 blokovala cistanche zprostředkovanou upregulaci Smad4 v buňkách HS68 vystavených H2O2 (obrázek 7D–7F). Nadměrná exprese hsa-miR-4535 částečně redukovala COL1A1 vyvolanou cistanche

a hladiny COL3A1 (obrázek 7F). Nadměrná exprese hsa-miR-4535 (obrázek 8A–8C) nebo inhibice Smad4 pomocí siRNA (obrázek 8D, 8E) vedly ke snížení syntézy kolagenu při léčbě cistanche po expozici H2O2. Překvapivě jsme zjistili, že jak přímé umlčení Smad4, tak ošetření pomocí hsa-miR-4535 napodobují reverzní syntézu kolagenu indukovanou cistanche v buňkách HS68 ošetřených H2O2-. Celkově jsme dospěli k závěru, že cistanche reguluje syntézu kolagenu, potenciálně prostřednictvím snížení hladiny hsa-miR-4535, aby se zvýšila signalizace Smad4 v buňkách HS68 vystavených H2O2.

KSL30


cistanche zvyšuje dráhu syntézy kolagenu TGF/Smad a zmírňuje dermální stárnutí, stejně jako inhibici exprese has-miR-4535 v buňkách HS68 vystavených UVB

Vzhledem k tomu, že UV světlo hraje důležitou roli u různých poruch kožní dermis, včetně zánětu, imunosuprese, rakoviny a předčasného stárnutí [30–32], zkoumali jsme účinek cistanche na signalizaci související se syntézou kolagenu v buňkách HS68 vystavených UVB záření. Hladiny proteinů složek TGF/Smad dráhy a downstream COL1A1 a COL3A1 byly sníženy v buňkách HS68 ošetřených UVB, ale byly účinně up-regulovány po ošetření cistanche (obrázek 9A). Výsledky Western blotting potvrdily, že cistanchepotlačila expresi MMP-1 zesílenou UVB v buňkách HS68 (obrázek 9A). Kromě toho jsme objasnili účinek cistanche proti stárnutí v buňkách HS68 vystavených expozici UVB tím, že jsme prokázali, že cistanche snížilo zvýšení hladin p16 a p21 vyvolané UVB (obrázek 9A). Abychom vyhodnotili, zda by cistanche mohla zmírnit UVB-indukovaný rozklad kolagenu prostřednictvím inhibice hsa-miR- 4535 cíleného na Smad4, zkoumali jsme hladiny has-miR-4535 a Smad4 v buňkách společně ošetřených UVB a cistanche pomocí qPCR. Našli jsme výraz has-miR-4535byl významně upregulován v buňkách vystavených UVB, ale po ošetření cistanche se snížil. Naopak exprese Smad4 byla potlačena expozicí UVB a toto potlačení bylo výrazně zvráceno ošetřením cistanche (obrázek 9B, 9C). Souhrnně naše zjištění naznačují, že cistanche má podobné účinky jako H2O2 k obnovení poklesu tvorby kolagenu vyvolaného UVB potlačením hladin hsa-miR-4535, aby se podpořila signalizace Smad4 v buňkách HS68.

Protective effects of cistanche


Lokální aplikace cistanche zmírňuje hyperplazii kůže a degradaci kolagenu vyvolanou UVB a také zvyšuje TGF/Smad signalizaci na dorzální kůži nahých myší C57BL6/J

Abychom objasnili fotoprotektivní účinek cistanche na poškození kůže vyvolané UVB zářením in vivo, hodnotili jsme hladinu mikroRNA-4535, Smad4 a změny kožní tkáně. Obrázek 10A ukazuje schéma experimentálního designu a časovou osu pro topickou aplikaci cistanche po UVB ozáření na dorzální kůži nahých myší C57BL6/J. Tvorba vrásek byla pozorována na dorzálních řezech kůže myší C57BL/6J ve skupině vystavené UVB. Lokální aplikace cistanche významně redukovala tvorbu vrásek, což ukazuje na cistanche zprostředkované zvýšení obsahu kolagenu pro udržení integrity kůže (obrázek 10B). Navíc histologická analýza dermální vrstvy ukázala, že obsah a hustota kolagenu v kůži
byly významně nižší ve skupině ozařované UVB ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem. Nicméně místní aplikace cistanche (12 mg/kg a 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Obrázek 6. cistanche up-reguluje expresi Smad4 snížením hladiny hsa-miR-4535. (A, B) Buňky HS68 byly ošetřeny různými koncentracemi H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) po dobu 24 hodin. (C, D) Buňky HS68 byly vystaveny působení H202 (200 uM) po dobu 1 hodiny a poté ošetřeny cistanche (30 uM) po dobu 23 hodin. Exprese hsa-miR-4535 a Smad4 byla detekována pomocí qRT-PCR. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SE. Kvantifikace výsledků je ukázána (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetřené kontrolní buňky; ##P < 0,01, ###P < 0,001 oproti buňkám ošetřeným H2O2-.


Propagované zvýšení obsahu kolagenu a hustoty v závislosti na dávce ve srovnání s myší vystavenou UVB záření (obrázek 11). Morfologie kůže byla hodnocena barvením H&E. Expozice UVB zvýšila tloušťku epidermis ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem. Lokální aplikace cistanche však významně zmírnila indukci UVBepidermální hyperplazie (obrázek 11). Navíc imunohistochemické barvení -gal indikované aplikací cistanche snížilo vysokou expresi -gal v kůži ozářené UVB (obrázek 11). Zjistit, zda cistanche může zlepšit kolagen vyvolaný UVB zářením

Protective effects of cistanche

Obrázek 7. Nadměrná exprese nebo inhibice hsa-miR-4535 reguluje syntézu kolagenu v buňkách HS68. (A–C) HS68 buňky byly transfekovány inhibitorem hsa-miR-4535 (40 nM) nebo inhibitorem NC (40 nM) po dobu 1 hodiny a poté společně ošetřeny H2O2 (2 00 μM) po dobu 23 hodin. (D–F) HS68 buňky byly transfekovány hsa-miR-4535 mimic (10 nM) nebo mimic NC (10 nM) po dobu 1 h a poté společně ošetřeny cistanche (30 uM) po dobu 23 hodin. Hladiny hsa-miR-4535 byly detekovány pomocí qPCR, aby byla zajištěna úspěšná transfekce. Hladiny proteinů Smad4, COL1A1 a COL3A1 byly analyzovány westernovým přenosem. GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SE. Kvantifikace výsledků je ukázána (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetřené kontrolní buňky; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. buňky ošetřené H2O2 nebo cistanche.


ztráta vláken prostřednictvím downregulace hsa-miR-4535 ke zvýšení Smad4 in vivo, její exprese RNA byla hodnocena ve vzorku vyříznuté dorzální kůže pomocí qRT-PCR. Exprese hsa-miR-4535 byla zvýšena v kůži ozařované UVB, ale významně potlačena v kůžikůže ošetřená cistanchev nízkých i vysokých dávkách. Kromě toho byly nízké hladiny exprese Smad4 RNA v kůži ozářené UVB zářením obnoveny ošetřením cistanche (obrázek 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Obrázek 8. Inhibice Smad4 pomocí siRNA nebo mimika hsa-miR-4535 obrací cistanche zprostředkované zvýšení syntézy kolagenu v dermálních fibroblastech. (A–C) HS68 buňky byly transfekovány hsa-miR-4535 mimic (10 nM) nebo mimic NC (10 nM) po dobu 1 hodiny s následnou společnou léčbou cistanche (3 {{40}} μM) a H2O2 (200 μM) po dobu 23 hodin. Hladiny Hsa-miR-4535 (A) a Smad4 (B) byly detekovány pomocí qPCR, aby byla zajištěna úspěšná transfekce. Buňky (D–E) HS68 byly transfekovány siRNA Smad4 (20 nM) nebo siRNA NC (20 nM) po dobu 1 hodiny s následným společným ošetřením cistanche (30 μM) a H2O2 (200 μM) po dobu 23 hodin. Hladiny Smad4 byly detekovány pomocí qPCR, aby byla zajištěna úspěšná transfekce (D). Hladiny proteinů Smad4, COL1A1 a COL3A1 byly analyzovány westernovým přenosem (C, E). GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. Uvedené hodnoty jsou průměry ± SE. Kvantifikace výsledků je ukázána (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetřené kontrolní buňky; #P < 0,05, ##P < 0,01, vs. buňky ošetřené H2O2-; $$P < 0,01, $$$ P < 0,001 vs. buňky ošetřené H2O2 plus cistanche

Kromě toho aplikace cistanche zachránila expresi proteinů TGF, psmad2/3 a Smad4 v kožní tkáni poškozené UVB zářením (obrázek 12C). Naše zjištění ukázala, že cistanche může potenciálně chránit pokožku před poškozením způsobeným UVB inhibicí hsa miR-4535, aby se zvýšila exprese Smad4 pro aktivaci P-smad2/3, aby se konečně podpořila syntéza kolagenu (obrázek 13)


image

Obrázek 9. cistanche zvyšuje dráhu syntézy kolagenu TGF/Smad a zeslabuje dermální stárnutí, stejně jako inhibici exprese hsa-miR-4535 v buňkách HS68 vystavených UVB. Buňky HS68 byly vystaveny UVB (40 mJ/cm2) a poté ošetřeny cistanche (30 uM) po dobu 23 hodin. (A) Proteinová exprese složek dráhy souvisejících se syntézou kolagenu (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteinu souvisejícího s degradací kolagenu (MMP{{20}}) a stárnutí- přidružené markery (p16 a p21) byly detekovány pomocí western blotu. GAPDH byl použit jako kontrola zatížení. (B a C) RNA exprese hsa-miR-4535 a Smad4 byla detekována pomocí qRT-PCR. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SE. Kvantifikace výsledků je ukázána (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, vs. neošetřené kontrolní buňky; #P < 0,05, ##P < 0,01 vs. buňky vystavené UVB.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950


Mohlo by se Vám také líbit