Ochranný účinek resveratrolu na poškození ledvin vyvolané akrylamidem
Feb 23, 2022
Pozadí: Akrylamid (ACR) má široké využití. Má apoškození ledvinúčinek. Cílem práce bylo prostudovat možnou ochrannou roli resveratrolu (RVS) nad zprostředkovanou ACRpoškození ledvinu krys. Byly zkoumány navrhované základní mechanismy podílející se na takové ochraně.Materiály a metody:Třicet dospělých albínských potkanů Sprague-Dawley bylo rozděleno do tří skupin: kontrola, ACR a RVS. Po 4 týdnech,ledvinabyl odstraněn a připraven pro histologické, imunohistochemické a biochemické studie. Byla hodnocena aktivita tkáňových oxidačních (malondialdehyd [MDA]) a antioxidačních (glutathion [GSH]) markerů.Výsledek:Akrylamidem indukovaná glomerulárníledvinovépostižení ve formě smršťování a distorze glomerulů se svraštěním jejich bazálních membrán a rozšířením močových prostor. Degenerativní tubulární změny byly výrazně přítomny v proximálních stočených tubulech. Nekrotické tubulární buňky vykazovaly cytoplazmatickou vakuolizaci s deskvamovanými epiteliálními buňkami v tubulárním lumen. ACR zvyšuje ukládání kolagenových vláken v bazální membráně glomerulárních kapilár a indukuje ztluštění bazálních membránledvinovékrvinky aledvinovétubuly. Podávání RVS poskytuje vysokou ochranuledvina. Glomeruly aledvinovétubuly byly téměř normální. Obsah kolagenových vláken a kyselina periodická Schiffova reakce bazální membrányledvinovétubuly byly o 70 procent a 19 procent nižší v souvislosti se skupinou ACR. Hladiny kreatininu a močoviny se snížily o 51 procent a 47 procent. RVS vyvolalo takovou ochrannou roli svým antioxidačním účinkem, protože hladina MDA klesla o 45 procent, zatímco hladina GSH vzrostla o 83 procent ve srovnání se skupinou ACR. Závěry: Akrylamid způsobuje strukturální a funkční poruchyledvin.Vyvoláváledvinapoškození oxidativním stresem a apoptózou. Při použití RVS normálníledvinaarchitektura byla zachována s malými strukturálními změnami. Přidání, funkčníledvinatest se stal normálním. RVS uplatňuje svůj ochranný účinek prostřednictvím svých antiapoptotických a antioxidačních vlastností. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
ÚVODAkrylamid (ACR) je dobře známá látka znečišťující životní prostředí, která má řadu systémových toxických účinků na lidi po pracovní i dietní expozici [2, 22]. Má řadu škodlivých vlastností: karcinogenitu, genotoxicitu, neurotoxicitu a reprodukční toxicitu [5, 7]. ACR a jeho analogy jsou široce používány v různých chemických a environmentálních aplikacích a jsou vyráběny zahříváním biologického materiálu získaného z rostlinné tkáně [25]. K tvorbě ACR dochází během zpracování potravin v důsledku vystavení sacharidů teplotám nad 200 stupňů [12]. Vysoké hladiny ACR byly zjištěny zejména v běžně konzumovaných potravinách; bramborové lupínky a chléb [31].
Akrylamid se vstřebává z gastrointestinálního traktu a široce se rozptyluje v tělesných tekutinách a ukládá se v játrech aledvina[28]. Je známo, že ACR způsobuje strukturální a funkční změny v mnoha orgánech. Theledvinovétubulární buňky podléhají degenerativním vakuolárním změnám, zánětlivé buněčné infiltraci a periglomerulárnímu edému [28]. Kromě toho podávání ACR u potkanů zvyšuje hladiny sérové močoviny, kreatininu, kyseliny močové aledvinovéprozánětlivý cytokin [1]. Metabolismus ACR spouští uvolňování volných radikálů (ROS), které iniciují oxidační stres vedoucí k nerovnováze ve vývoji a degradaci ROS [19]. Také indukuje peroxidaci lipidů a poškození DNA [1].
Účinky mnoha antioxidantů a protizánětlivých sloučenin, jako je olivový olej, vitamín E a 5-kyselina aminosalicylová, byly studovány za účelem prevence a léčby vyvolané ACRpoškození ledvin[9, 19]. Resveratrol (RVS) je fytoalexin nalezený v min72 druhů rostlin, z nichž mnohé jsou konzumovány lidmi, včetně moruše, arašídů a hroznů [8]. RVS má protizánětlivou, protidestičkovou, antioxidační a antikarcinogenní aktivitu, stejně jako schopnost snižovatpoškození ledvinzpůsobené chemickými sloučeninami [8, 10]. Není však jasné, zda se RVS může bránit proti indukci ACRpoškození ledvinnebo ne. Proto jsme studovali oxidační a apoptotický poškozující účinek ACR přesledvinaa zkoumal ochrannou roli RVS nad takovýmpoškození ledvinu krys.
klíčová slova:resveratrol, akrylamid, ledviny, ledviny, poškození ledvin
MATERIÁLY A METODY
ZvířataV naší studii bylo zahrnuto třicet dospělých albínských potkanů Sprague-Dawley o hmotnosti 170–200 g. Zvířata byla chována v prostorných drátěných klecích ve speciální místnosti s přímým denním světlem a přirozenou ventilací. Krysy měly volný přístup ke standardnímu krmivu pro krysy a vodě. Všechna zvířata byla léčena podle standardních pokynů pro péči a použití laboratorních zvířat. Studie byla povolena Etickou komisí Lékařské fakulty Káhirské univerzity v Egyptě.Postupy se řídily etickými standardy odpovědné organizace a Helsinskou deklarací z roku 1975 ve znění revidovaném v roce 1983.
Experimentální designKrysy byly rozděleny do tří skupin (10 v každé skupině): kontrola (podaná destilovaná voda v dávce 1 ml), skupina ACR a skupina RVS (současná ACR plus RVS).
ChemikálieAkrylamid byl získán v nádobě s práškem zakoupené společností Biostain Company (Spojené království) o hmotnosti 500 g. Byl rozpuštěn v destilované vodě v koncentraci 10 g/l. Byl podáván v dávce 1 ml destilované vody obsahující 40 mg/kg/den perorálně pomocí žaludeční sondy [9]. Resveratrol (čistota, > 99 procent) byl zakoupen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu a zředěn v 0,9% fyziologickém roztoku. Byl podáván v denní dávce 20 mg/kg/den perorálně pomocí žaludeční sondy [18]. Na konci experimentu (po 4 týdnech) bylo každé zvíře zváženo a vzorek krve byl odebrán z ocasní žíly pomocí jemné heparinizované kapiláry. Theledvinabyl extrahován, promyt fyziologickým roztokem a ponechán uschnout na plotnovém papíře.
Studie světelného mikroskopuledvinyvzorky byly fixovány v 10% formalínu, dehydratovány v ethylalkoholu, vyčištěny v xylolu a zality do parafinového vosku. Řezy o tloušťce 5 um byly nařezány a upevněny na sklíčka. Další řezy byly upevněny na pozitivně nabitá sklíčka pro imunohistochemii. Řezy byly podrobeny následujícímu: — hematoxylinem a eosinem (H&E) a řezy obarvené Massonovým trichromem byly připraveny podle Suvarna et al. [24]; — histochemické hodnocení: barvení kyselinou jodistou Schiff (PAS): řezy obarvené PAS byly připraveny podle Suvarna et al. [24]; imunohistochemická analýza Bcl-2-asociovaného X proteinu (BAX) [20]. Byly připraveny parafinové řezy. Poté bylo k řezům přidáno vhodné množství séra po dobu 30 minut. Endogenní peroxidáza byla inaktivována methanolovým roztokem obsahujícím H202 (1:50) po dobu 10 minut a promyta fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Tkáňové řezy byly blokovány 1,5% sérem po dobu 30 minut. Řezy byly inkubovány s primární protilátkou Bax (anti-lidský BAX protein, DakoCytomation, Dánsko), následovanou sekundární protilátkou (biotinylovaný link universal z komerční sady LSAB: DakoCytomation, Denmark). Následně byly vzorky inkubovány s AB enzymy po dobu 30 minut a opláchnuty v PBS. Pozitivní signály byly detekovány pomocí peroxidázových chromogenních substrátů. Negativní kontrola obsahovala PBS místo sekundární protilátky.
Analýza obrazu a morfometrická měřeníPomocí počítačového systému analyzátoru obrazu Leica LAS V3.8 (Švýcarsko) byly hodnoceny následující parametry: průměryledvinovéglomerulů a proximálních stočených tubulů, šířka vledvinovéprostoru a výšku výstelky proximálního tubulárního epitelu. Kromě toho byl počet strukturálně změněných glomerulů hodnocen jako procento z celkového počtu glomerulů. Hodnotil se také obsah kolagenových vláken. V histologických řezech barvených PAS byla dodatečně stanovena optická hustota bazální membrány proximálních stočených tubulů a parietálních vrstev Bowmanových pouzder. V oblasti imunohistochemického barvení BCL2 bylo také měřeno procento imunitní reakce.
Biochemická studieVzorky krve odebrané krysám před usmrcením byly použity pro biochemické hodnocení na katedře biochemie a molekulární biologie, Lékařská fakulta, Káhirská univerzita, Egypt.
Hladiny urey a kreatininu v sérubyly odhadnuty konvenční kolorimetrickou metodou za použití souprav Quanti Chrom TM Assay Kit (DIUR-500 a DICT-500), založené na vylepšených metodách Jung a Jaffe [32]. Byly vypočteny průměrné hodnoty těchto biochemických parametrů a podrobeny statistické analýze.
Tkáňová hladina malondialdehydu (MDA) a redukovaného glutathionu (GSH).Theledvinovétkáň byla homogenizována v 5–10 ml studeného pufru (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,5, 1 mM EDTA) na gram tkáně, poté byla centrifugována při 100, 000 g po dobu 15 minut při 4 stupních. Supernatant byl odebrán pro test a uložen na ledu. Test malondialdehydu byl proveden testem na kyselinu thiobarbiturovou (TBA) v supernatantu podle metody navržené Buegem a Austem [4].MDA reaguje s TBA za vzniku červené sloučeniny absorbující při 535 nm. Měření GSH bylo založeno na redukci 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoové kyseliny) (DTNB) redukovaným GSH za vzniku žluté sloučeniny [6].
Statistická analýzaStřední hodnoty relativníledvinahmotnost, histomorfometrická měření a biochemické hladiny byly analyzovány pomocí SPSS verze 22. Statistický odhad byl proveden pomocí ANOVA následované Bonferroniho párovým srovnáním.
VÝSLEDEK
Hodnocení světelným mikroskopemZkoumání kontrolní skupiny ukázalo neporušenou architekturuledvinovékůra. Theledvinovékůra je tvořena zledvinovékrvinky a proximální a distální stočené tubuly (obr. 1A). Zkouškaledvinovékůra skupiny ACR odhalila výrazné strukturální změny. Theledvinovéglomeruly vykazovaly mírné až výrazné smrštění, distorzi, segmentaci a vakuolizaci s rozšířenými močovými prostory. Theledvinovétubuly byly dilatovány s výrazným zmenšením jejich výšky epitelu a rozšířením jejich lumina. Jejich výstelkové buňky vykazovaly cytoplazmatickou vakuolizaci, buněčnou fragmentaci a tvorbu intraluminálního odlitku byly pozorovány v mnoha stočených tubulech. Intersticium vykazovalo překrvené krevní cévy se ztluštěním intimy a byla také vidět masivní buněčná infiltrace (obr. 1B–D). Vyšetření skupiny RVS odhalilo téměř normální vzhled většiny glomerulů a tubulů. Byla zjištěna minimální intersticiální zánětlivá buněčná infiltrace (obr. 1E).
Obsah kolagenových vlákenObsah vláken byl v kontrolní skupině minimální. Obsah se zvýšil kolem parietálních vrstev Bowmanových tobolek a bazálních membránledvinovétubuly ve skupinách ACR (9-násobek) a RVS (2-násobek) ve vztahu ke kontrolní skupině. Obsah ve skupině RVS byl o 70 procent nižší ve srovnání se skupinou ACR (obr. 2A–C, tabulka 1).
Histochemie ledvinV kontrolní skupině byly bazální membrányledvinovétubuly a parietální vrstvy Bowmanových pouzder prokázaly slabou PAS reakci. Navíc se apikální kartáčové okraje proximální části stočily
tubuly (PCT) byly intaktní a částečně uzavíraly tubulární luminu (obr. 3A). Bazální membrányledvinovétubuly a parietální vrstvy Bowmanových tobolek skupiny ACR vykazovaly intenzivní PAS reakci (o 42 procent vyšší než u kontrolní skupiny). Navíc byly apikální kartáčkové okraje PCT zeslabeny (obr. 3B). S použitím RVS se reakce PAS stala srovnatelnou s kontrolní skupinou a byla o 19 procent nižší než u skupiny ACR (obr. 3C, tabulka 1).
Imunohistochemické barvení BAXBAX vykazoval slabou reakci v kontrolní skupině (obr. 4A). Procento plochy BAX imunopozitivních buněk se zvýšilo 4,{2}}krát ve skupině ACR odpovídající kontrolní skupině (obr. 4B, C, tabulka 1). S použitím RVS se procento plochy imunopozitivních buněk snížilo o 56 procent ve srovnání se skupinou ACR; procento plochy ve skupině RVS však bylo 1.4-krát vyšší než v kontrolní skupině (obr. 4D, tabulka 1).
Biochemické a oxidační/antioxidační markeryHladiny sérového kreatininu a močoviny se ve skupině ACR zvýšily 275-násobně, 1{3}}násobně ve srovnání s kontrolní skupinou. Při současném užívání RVS se hladiny kreatininu a močoviny snížily o 51 procent, 47 procent ve spojení s ACR. Nicméně hladiny kreatininu a močoviny ve skupině RVS byly o 83 procent, o 55 procent vyšší než u kontrolní skupiny (tabulka 1).
Hodnoty oxidačního markeru (MDA) ve skupině ACR vzrostly 14-krát, zatímco hodnoty antioxidačního markeru (GSH) se snížily 13-krát ve srovnání s kontrolní skupinou. Při použití RVS se hladina MDA snížila o 45 procent, zatímco hladina GSH vzrostla o 83 procent ve srovnání se skupinou ACR. Přesto byla hladina obou markerů mimo kontrolní skupinu (tabulka 1).
Morfometrické glomerulární a PCT změnyProcento postižených glomerulů ve skupině ACR se zvýšilo 8{1}}krát ve srovnání s kontrolní skupinou. Při použití RVS se procento postižených glomerulů snížilo o 71 procent, což se rovnáskupina AČR; procento ve skupině RVS však bylo 1.6-krát vyšší než v kontrolní skupině (tabulka 2).
Ve skupině ACR se glomerulární průměr zmenšil o 58 procent se zvětšením šířky močového prostoru 2.4-krát ve srovnání s kontrolní skupinou. Při použití RVS se glomerulární průměr zvětšil 1,{4}}krát se zmenšením šířky močového prostoru o 57 procent, což se rovná skupině ACR. Glomerulární průměr a šířka močového prostoru u RVS a kontrolních skupin byly podobné (tabulka 2). Ve skupině ACR se průměr PCT zvýšil o 31 procent, zatímco výška jejich výstelky epithelia klesla o 62 procent ve srovnání s kontrolní skupinou. S použitím RVS se průměr PCT zmenšil o 18 procent, zatímco výška jejich výstelkového epitelu se zvýšila 1.4-krát, což se rovná skupině ACR. Oba parametry byly srovnatelné v RVS a kontrolních skupinách (tabulka 2).
DISKUSEAkrylamidem indukovaná glomerulárníledvinovépostižení ve formě smršťování a distorze glomerulů se svraštěním jejich bazálních membrán a rozšířením močových prostor. Navíc byly v PCT výrazně přítomny degenerativní tubulární změny. Nekrotické tubulární buňky vykazovaly cytoplazmatickou vakuolizaci s deskvamovanými epiteliálními buňkami v tubulárním lumen. Navíc ACR indukovala masivní zánětlivou buněčnou infiltraci s kongescí glomerulárních krevních cév. Akrylamidem indukovaná fibróza, která byla způsobena 9-násobným zvýšením ukládání kolagenových vláken v bazální membráně glomerulárních kapilár. Taková kolagenová vlákna mohou být výsledkem epidermálního růstového faktoru, který stimuluje proliferaci fibroblastů a syntézu kolagenu [14].Bazální membrányledvinovékrvinky aledvinovétubuly skupiny ACR vykazovaly intenzivní PAS reakci (o 42 procent vyšší než kontrolní skupina). Ztluštění tubulární bazální membrány je běžným znakem atrofie a může být spojeno s hyalinózou [14]. Ztluštění je také možnou příčinou sníženého aktivního transportu u PCT způsobujícího mikroalbuminurii [14].
Kartáčový okraj PCT ve skupině AČR byl přerušen. Ztráta kartáčkového lemu je nejčasnějším morfologickým znakem poruchy funkce proximálních tubulů [17, 27]. Kromě toho ztráta kartáčkového lemu ovlivňuje reabsorpční schopnost PCT se ztrátou glukózy, solí a velkého množství vody v moči [17, 27]. To většinou vysvětluje pozorované sérologické změny (zvýšené sérové hladiny močoviny a kreatininu). Průměr PCT se zvýšil o 31 procent ve skupině ACR, což je většinou kompenzační mechanismus pro zachovánífunkce ledvin [15].
Oxidační stres je hlavním patogenním mechanismem, kterým ACR indukujepoškození ledvin. Oxidační stres je posun v rovnováze mezi oxidanty a antioxidanty ve prospěch oxidantů [3]. Mnoho výzkumníků prokázalo roli oxidačního stresu ACRledvina[23]. Hodnoty oxidačního markeru (MDA) ve skupině ACR se zvýšily 14-krát, zatímco hodnoty antioxidačního markeru (GSH) se 13-krát snížily. Oxidační stres vytváří volné radikály kyslíku (ROS), které reagují s četnými biomolekulami v buňce, což nakonec vede k oxidativnímu poškození [16]. ROS je vychytáván několika buněčnými obrannými mechanismy zahrnujícími neenzymatické (GSH). Proteiny GSH peroxidázy přeměňují peroxid vodíku na vodu a lipidperoxidy na jejich příslušné alkoholy [30]. Dlouhodobé užívání ACR snížilo aktivity GSH. Tento důsledek ve zvýšené produkci O2– a H2O2, který vede k produkci OH– [11]. Mnoho výzkumníků věřilo, že hladina MDA je dostatečným důkazem oxidačního stresu [13] a vyšší hodnota MDA odhalila zvýšení peroxidace lipidů.
Apoptóza je také dalším patogenním mechanismem, kterým ACR indukujeledvinovénáklonnost [23]. Reakce BAX se ve skupině ACR zvýšila 4{2}}krát. BAX má proapoptotický účinek [29]. Resveratol jako jeden z flavonoidů poskytuje vysokou ochranuledvinajako glomeruly aledvinovétubuly byly téměř normální. Ve srovnání se skupinou ACR byl obsah kolagenových vláken a reakce PAS vledvinovétubulů se snížil o 70, 19 procent. Kromě toho se hladiny kreatininu a močoviny snížily o 51, 47 procent. Mnoho výzkumníků zaznamenalo exogenní antioxidační ochranný účinek RVSledvina[21]. RVS vyvolal takovou ochrannou roli svým antioxidačním účinkem, protože hladina MDA klesla o 45 procent, zatímco hladina GSH vzrostla o 83 procent ve srovnání se skupinou ACR. RVS zabraňuje produkci superoxidu z nenavázané endoteliální syntázy oxidu dusnatého a zvyšuje expresi různých antioxidačních enzymů [30]. Antioxidační aktivita mnoha flavonoidů je způsobena přímým vychytáváním volných radikálů nebo excitovaných forem kyslíku a také inhibicí oxidačních enzymů produkujících ROS [26]. Dalším ochranným mechanismem RVS je jeho antiapoptotický účinek. S použitím RVS se procento plochy imunopozitivních buněk BAX snížilo o 56 procent ve srovnání se skupinou ACR.
ZÁVĚRYZávěrem lze konstatovat, že ACR způsobuje strukturální a funkční poruchyledvina. Vyvolávápoškození ledvinprostřednictvím oxidačního stresu a apoptózy. Při použití RVS je normálníledvinaarchitektura byla zachována s malými strukturálními změnami. RVS uplatňuje svou ochranu prostřednictvím svých antiapoptotických a antioxidačních vlastností.
