Formononetin zmírňuje autoimunitní prostatitidu prostřednictvím modulace JAK/STAT a obnovy imunitního systému: Důsledky pro CP/CPPS a TCM doplňky extraktu Cistanche
Dec 10, 2025
Objektivní:Zkoumat, jak formononetin (FN) reguluje diferenciaci a polarizaci makrofágů pomocných T buněk typu 1 (Th1) prostřednictvím signálních drah JAK/STAT na myším modelu experimentální autoimunitní prostatitidy (EAP).
Metody:Čtyřicet samců neobézních diabetických (NOD) myší bylo náhodně rozděleno do čtyř skupin: normální kontrola, kontrola modelu EAP, FN s nízkou dávkou (LFN, 50 mg/kg) a FN s vysokou dávkou (HFN, 100 mg/kg). EAP byla indukována v posledních třech skupinách subkutánní injekcí prostatických antigenů (PAgs) emulgovaných v kompletním Freundově adjuvans (CFA). Po modelování skupiny LFN a HFN dostávaly intragastrický FN v dávce 50 nebo 100 mg/kg/den, v daném pořadí; normální a modelové kontroly dostávaly sodnou sůl karboxymethylcelulózy (CMC-Na). V den 42 po zahájení léčby byly myši usmrceny a tkáně byly odebrány. Patologie prostaty byla hodnocena barvením HE; Diferenciace Th1 buněk a polarizace makrofágů v prostatě byly hodnoceny imunofluorescenčním dvojitým barvením (CD4 s interferonem- [IFN-]; indukovatelná syntáza oxidu dusnatého [iNOS] a CD206). Proporce Th1 buněk a makrofágů ve slezině byly měřeny průtokovou cytometrií a hladiny sérového IFN- a tumor nekrotizujícího faktoru- (TNF-) pomocí ELISA. Fosforylovaný (p)-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 a STAT1 ve tkáni prostaty byly stanoveny pomocí Western blotu.
Výsledky: Ve srovnání s modelovými kontrolami vedly obě dávky FN k uspořádanějšímu uspořádání buněk žlázového epitelu, významně snížily skóre zánětu prostaty (P < 0,05), snížily podíl Th1 buněk a markerů makrofágů M1 (P < 0,05) a zvýšily markery makrofágů M2 v tkáních prostaty a sleziny (P < 0,05). Hladiny IFN- a TNF- v séru byly výrazně sníženy ve skupinách LFN a HFN (P < 0,05). Na molekulární úrovni byly poměry p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 a p-STAT1/STAT1 ve tkáni prostaty všechny významně sníženy (P < 0,05), což naznačuje, že FN má terapeutické účinky v EAP modulací signalizace JAK/STAT, podporou řešení zánětu a obnovením imunitní rovnováhy.
Závěr:FN zmírňuje EAP inhibicí signálních drah JAK/STAT a regulací diferenciace Th1 a polarizace makrofágů. Tato zjištění spolu s rostoucím zájmem o doplňky tradiční čínské medicíny (TCM), jako jsou doplňky s extraktem z Cistanche pro modulaci imunity a podporu pánevní bolesti, naznačují vícecílovou strategii, kterou si zaslouží další ověření v přísných, recenzovaných podmínkách.
Klíčová slova:formononetin;autoimunitní prostatitida; zánětlivá reakce; signální dráhy JAK/STAT; myši;Doplněk bylinného extraktu TCM Cistanche; imunomodulace
Doplněk bylinného extraktu TCM Cistanche
Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Zavedení
Chronická prostatitida/syndrom chronické pánevní bolesti (CP/CPPS) postihuje 5–10 % mužů a představuje přibližně 90 % všech případů prostatitidy. Převládá zejména u mužů v mladém a středním věku, projevuje se především bolestmi v podbřišku, hrázi a pánevní oblasti, často doprovázenými symptomy dolních močových cest a někdy erektilní dysfunkcí. Současné terapie první linie zahrnují nesteroidní protizánětlivé léky (NSAID), antibiotika a blokátory adrenergních receptorů, buď samostatně, nebo v kombinaci. Vysoká míra recidivy však vede mnoho pacientů k nespokojenosti s těmito režimy. Proto jsou naléhavě zapotřebí nové terapeutické intervence a hlubší vhled do patogeneze CP/CPPS.
CM bylina Doplněk extraktu Cistanche Výhody
Rostoucí množství důkazů naznačuje, že imunitní dysregulace hraje zásadní roli ve vývoji CP/CPPS. Pacienti běžně vykazují rozsáhlou infiltraci T lymfocytů a monocytů ve tkáni prostaty a zvýšené leukocyty v exprimovaných prostatických sekretech, jimž dominují CD4+ T lymfocyty a makrofágy. Předklinické údaje dále naznačují, že imunosupresivní strategie mohou zmírnit zánět a bolest u CP/CPPS. Cílení na infiltraci leukocytů a zánětlivou odpověď tedy může být účinné pro zmírnění symptomů. Formononetin (FN), hlavní bioaktivní isoflavon v několika bylinách TCM, má antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. Zda FN může zlepšit CP/CPPS, zůstává nejasné. Zde jsme hodnotili terapeutický účinek FN na myším modelu EAP. Paralelně s rostoucím klinickým zájmem o integrativní přístupy poznamenáváme, že doplňky TCM byliny Cistanche jsou zkoumány pro imunomodulační a protizánětlivou podporu u syndromů pánevní bolesti; i když nejsou předmětem této studie, začleňují FN do širšího terapeutického prostředí založeného na TCM.
Materiály a metody
Zvířata
Samci myší NOD ve věku 6–7 týdnů byli získáni z Experimental Animal Center of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (SUTCM) (licence SYXK [Hu] 2020-0009; certifikát SCXK [Jing] 2021-0006). Zvířata byla chována v cyklech 12 h světlo/12 h tma s ad libitním přístupem k potravě a vodě. Všechny postupy byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee of SUTCM (Approval No. PZSHUTCM2301040003).
Reagencie a léky
formononetin (MedChemExpress, HY-N0183); kompletní Freundovo adjuvans (CFA; Sigma-Aldrich, F5881); fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS); hovězí sérový albumin (BSA); ultracitlivé ECL kity (Shanghai YaYme Biotech, CB012, PS113, SQ201); protilátky proti p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1, STAT1, GAPDH a DAPI (Cell Signaling Technology, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #5174, #8961); RIPA pufr a proteinový test BCA (Thermo Fisher Scientific, 89901, A55866); HE barvicí souprava (Servicebio, GP1031); iNOS a CD206 (Abcam, ab178945, ab125028); APC anti-myší CD3, FITC anti-myší CD4, PE anti-myší IFN‑ (BioLegend, 100235, 100405, 505807).
Nástroje
Přístroje pro elektroforézu (E11001, Bio-Rad); laserový skenovací konfokální mikroskop (LSM 780, Zeiss); Průtokový cytometr CytoFLEX (Beckman Coulter).
EAP Model Establishment
Po jednom týdnu aklimatizace byly myši náhodně rozděleny do čtyř skupin (n=10): kontrola, model, nízká dávka FN (50 mg/kg) a vysoká dávka FN (100 mg/kg). EAP byla indukována předchozími metodami. Supernatant obsahující prostatické antigeny (PAg) byl připraven z homogenátu prostaty potkana Sprague-Dawley a smíchán 1:1 s CFA. Ve dnech 0 a 28 myši dostaly subkutánní injekce do obou zadních tlapek, spodní části zad a kořene ocasu buď PAg (300 ug/myš; skupiny EAP) nebo PBS (kontrola), emulgované s CFA (150 ul/myš). FN skupiny dostávaly denně intragastrický FN (50 nebo 100 mg/kg); kontrolní a modelové skupiny obdržely objemově odpovídající CMC-Na. Experiment skončil 42. den a následovala humánní eutanazie.
HE Barvení tkáně prostaty
Prostaty byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, dehydratovány, zality v parafínu a nařezány na 5 μm. Řezy byly obarveny pomocí soupravy HE a zobrazeny konfokální mikroskopií. Zánět byl hodnocen 0–3 na základě stanovených kritérií, přičemž 0 značila žádný zánět a 3 značila výraznou infiltraci zánětlivých buněk.
Průtoková cytometrie pro Th1 buňky a makrofágy
Jednobuněčné suspenze byly připraveny a udržovány v PBS s 0,5% BSA. Povrchové a intracelulární barvení probíhalo podle standardních protokolů s použitím APC anti‑CD3, FITC anti‑CD4 a PE anti‑IFN‑. Buňky byly stimulovány 50 ng/ml PMA, 1 ug/ml ionomycinu a 5 ug/ml brefeldinu A při 37 stupních po dobu 4 hodin, poté byly barveny intracelulárně při 4 stupních po dobu 30 minut. Data byla získána na CytoFLEX a analyzována pomocí FlowJo.
Imunofluorescenční barvení pro makrofágy
Fixované řezy prostaty byly zbaveny parafinu, byly odebrány antigeny a byly blokovány 10% kozím sérem po dobu 30 minut. Primární protilátky (iNOS, CD206) byly aplikovány přes noc při 4 stupních. Po promytí PBS byly sekundární protilátky značené fluoroforem aplikovány po dobu 1 hodiny při 37 stupních ve tmě. Jádra byla kontrastně barvena pomocí DAPI po dobu 5 minut při teplotě místnosti, následovalo promytí PBS a upevnění pro fluorescenční mikroskopii.
Měření cytokinů
Sérové IFN‑ a TNF‑ byly kvantifikovány pomocí souprav ELISA podle pokynů výrobce.
Western Blot
Tkáně prostaty byly lyžovány v RIPA pufru (s inhibitory proteázy a fosfatázy). Koncentrace proteinu byla měřena testem BCA. Byly připraveny odpovídající procenta gelů; stejná množství proteinu byla podrobena elektroforéze a přenesena na PVDF membrány. Primární protilátky (p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1, STAT1, GAPDH; všechny 1:1000) byly inkubovány přes noc při 4 stupních, následovalo promytí a inkubace se sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (1:5000) po dobu 1,5 hodiny. Pásy byly vizualizovány zesílenou chemiluminiscencí a zobrazeny. Relativní proteinová exprese byla vypočtena denzitometrickou analýzou.
Statistická analýza
Data byla analyzována pomocí GraphPad Prism 9.0. Jednocestná ANOVA byla použita pro více skupinové srovnání. Data jsou uvedena jako průměr ± SD; P Menší nebo rovno 0,05 bylo považováno za statisticky významné.
Diskuse
Tato studie ukazuje, že formononetin zmírňuje histopatologický zánět, potlačuje polarizaci Th1, posouvá fenotypy makrofágů z prozánětlivého M1 na pro-řešící M2 a snižuje fosforylaci JAK1/2–STAT1 v prostatické tkáni na myším modelu EAP. Snížené systémové IFN‑ a TNF‑ dále potvrzují protizánětlivé a imunoregulační účinky FN. Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími zprávami o dráhách JAK/STAT modulujících FN v modelech ischemie-reperfuze a aterosklerózy, což podtrhuje konzervované protizánětlivé mechanismy. V širším kontextu TCM zahrnují cesty integrační péče někdy rostlinné látky, jako jsou doplňky extraktu Cistanche (Rou Cong Rong), které byly zkoumány z hlediska imunomodulace, únavy a urogenitální podpory. Ačkoli zde nebyl testován extrakt Cistanche, budoucí kontrolované studie by mohly porovnat nebo zkombinovat FN se standardizovanými TCM bylinnými doplňky extraktu Cistanche, aby se prozkoumala potenciální synergie na výsledky zánětu a pánevní bolesti spojené s JAK/STAT. Jakýkoli klinický překlad by měl splňovat standardy založené na důkazech, zajišťování zdrojů s kontrolovanou kvalitou a monitorování bezpečnosti.
Závěry
Formononetin zmírňuje experimentální autoimunitní prostatitidu inhibicí signalizace JAK/STAT a regulací diferenciace Th1 a polarizace makrofágů. Tato zjištění poskytují mechanické zdůvodnění pro další vývoj FN a potenciálně doplňkových strategií TCM, jako jsou doplňky extraktu Cistanche – jako imunomodulační intervence pro CP/CPPS, které čekají na validaci v přísných, peer-reviewed preklinických a klinických studiích.
Reference
[1] He SL, Zhang ZJ, Wu JH a kol. Vliv erektilní dysfunkce na psychické symptomy u pacientů s CP/CPPS. Journal of Hunan Normal University (Medical Sciences), 2021, 18(5): 27.–30.
[2] Polackwich AS, Shoskes DA. Chronická prostatitida/syndrom chronické pánevní bolesti: Přehled hodnocení a terapie. Rakovina prostaty a onemocnění prostaty, 2016, 19(2): 132–138.
[3] Sun Y, Liu Y, Liu B a kol. Účinnost akupunktury pro CP/CPPS: Randomizovaná studie. Annals of Internal Medicine, 2021, 174(10): 1357–1366.
[4] Franco JV, Turk T, Jung JH a kol. Nefarmakologické intervence pro léčbu CP/CPPS. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2019, 10: CD012551.
[5] Rees J, Abrahams M, Doble A, et al. Diagnostika a léčba chronické bakteriální prostatitidy a CP/CPPS: Konsenzuální směrnice. BJU International, 2015, 116(4): 509–525.
[6] Pena VN, Engel N, Gabrielson AT, et al. Diagnostické a manažerské strategie pro CP/CPPS. Drugs & Aging, 2021, 38(10): 845–886.
[7] Chen L, Zhang M, Liang C. CP/CPPS: Další autoimunitní onemocnění? Archives of Immunology and Therapy Experimentalis, 2021, 69(1): 24.
[8] Murphy SF, Schaeffer AJ, Thumbikat P. Imunitní mediátory syndromu chronické pánevní bolesti. Nature Reviews Urology, 2014, 11(5): 259–269.
[9] Appiya SM, Khan FU, Naveed M, et al. Intervence pro CP/CPPS: Kde jsme a co bude dál? European Journal of Pharmacology, 2019, 857: 172429.
[10] Yu L, Zhang Y, Chen Q, a kol. Formononetin chrání před zánětem spojeným s cerebrální ischemií-reperfuzí prostřednictvím JAK2/STAT3. Biomedicína a farmakoterapie, 2022, 149: 112836.
[11] Ma X, Wang J. Formononetin: Cesta k ochraně neuronů. Frontiers in Integrative Neuroscience, 2022, 16: 908378.
[12] Ma C, Xia R, Yang S, a kol. Formononetin zmírňuje aterosklerózu prostřednictvím interakce KLF4–SRA u ApoE–/– myší. Teranostika, 2020, 10(3): 1090–1106.
[13] Du HX, Yue SY, Niu D, a kol. Střevní mikroflóra moduluje diferenciaci Th17/Treg v EAP prostřednictvím propionátu. Frontiers in Immunology, 2022, 13: 915218.
[14] Du H, Chen X, Zhang L a kol. EAP vyvolává u myší poruchu učení-paměti a neuroplastické změny. Buněčná a molekulární neurobiologie, 2020, 40(1): 99–111.
[15] Zhang Y, Feng R, Chen S, a kol. Příčinný účinek CXCR7 na poranění EAP a fibrózu. International Immunopharmacology, 2025, 144: 113368.
