Preventivní účinky fenylethanolových glykosidů z Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You a kol

Abstraktní

Pozadí:Cistanchetubulosaje tradiční čínská bylinná medicína, která se široce používá k regulaci imunity.Fenylethanolglykosidy(CPhG) z tohoto závodu jsou primárně účinné materiály. Cílem této studie bylo vyhodnotit preventivní a terapeutické účinky CPhG na jaterní fibrózu indukovanou BSA u potkanů ​​a související molekulární mechanismy zahrnující jaterní hvězdicové buňky. Biejiarangan (BJRG), další tradiční čínský bylinný lék, byl použit jako pozitivní kontrola.

Metody:V in vivo experimentech bylo 75 SD potkanů ​​náhodně rozděleno do 6 skupin: normální (ošetřené destilovanou vodou), model (ošetřené BSA), pozitivní léčivo (ošetřené BSA plus BJRG 600 mg/kg/den) a léčené BSA plus skupiny CPhG (125, 250 a 500 mg/kg/den). Indexy jater a sleziny, sérové ​​hladiny aspartátaminotransferázy (AST), alaninaminotransferázy (ALT), kyseliny hexadecenové (HA), lamininu (LN), prokolagenu typu III (PCIII), kolagenu typu IV (IV-C), hydroxyprolinu (Hyp ) a transformující růstový faktor 1 (TGF- 1) byly měřeny v krysích játrech. Histopatologické stupně pro jaterní fibrózu byly hodnoceny pro každou skupinu pomocí H&E a Massonova trichromového barvení. Exprese TGF- 1, kolagenu I (Col-I) a kolagenu III (Col-III) byla stanovena metodou imunohistochemického barvení. Tyto účinky byly dále hodnoceny in vitro stanovením hladin exprese NF-KB p65 a Col-I kvantitativními analýzami PCR v reálném čase. Exprese Col-I proteinu byla také zkoumána westernovým přenosem.

Výsledek: Všechny dávkové skupiny (125, 250 a 500 mg/kg/den) CPhG významně snížily index jater a sleziny, snížily ALT, AST, HA, LN , sérové ​​hladiny PCIII, IV-C, obsah TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0,01="" a="" p="">< 0,01)="" a="" hyp="" obsah.="" cphg="" také="" výrazně="" zmírnily="" otok="" jaterních="" buněk="" a="" účinně="" zabraňovaly="" nekróze="" hepatocytů="" a="" infiltraci="" zánětlivých="" buněk.="" imunohistochemické="" výsledky="" ukázaly,="" že="" cphg="" významně="" snížily="" expresi="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" a="" p="">< 0,01),="" col-i="" a="" col-iii.="" in="" vitro="" účinky="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" a="" 25="" ug/ml)="" na="" hsc-t6="" ukázaly,="" že="" cphg="" významně="" snížily="" expresi="" mrna="" nf-kb="" p65="" a="" col-i="" a="" cphg="" také="" snížily="" expresi="" proteinu="">

Závěry:CPhG mají významný účinek proti jaterní fibróze a mohou být použity jako hepatoprotektivní činidla pro léčbu jaterní fibrózy.

klíčová slova:jaterní fibróza,Cistanche tubulosa,Fenylethanolglykosid,Chemokine BSA, Prevence a terapie

FenylethanolglykosidvCistanchetubulosa

Pozadí

Jaterní fibróza je reakce hojení ran na vážné poškození jater, ke kterému dochází v patogenezi chronické hepatitidy vyvolané různými faktory. Těmito faktory jsou virová infekce, abúzus alkoholu, cholestáza a metabolická a autoimunitní onemocnění [1–3]. Progresivní akumulace extracelulární matrix (ECM) a snížená remodelace narušují normální architekturu jater, což vede k jaterní fibróze [4]. Jaterní fibróza je kritická u chronického onemocnění jater a často se vyvine do ireverzibilní cirhózy a karcinogeneze. V současné době neexistují žádné metody nebo účinné léky pro léčbu jaterní fibrózy. Proto je naléhavé najít lék proti jaterní fibróze, který zmírní progresi poškození jater k fibróze a rakovině.

CistanchetubulosaW (z čeledi Orobanchaceae) je parazitická rostlina, která se hojně pěstuje v jižní oblasti Xinjiang v Číně [5]. Lidé jej obvykle používají k povzbuzení ledvin, výživě krve, uvolnění střev a oddálení stárnutí. Je oficiálně uveden v čínském lékopisu [6].Cistanchetubulosaobsahuje různé aktivní složky. Tyto zahrnujíFenylethanolglykosidy(CPhG), iridoidy a polysacharidy. Jako jedna z mnoha aktivních složek vCistanchetubulosaCPhG prokázal přesvědčivé antioxidační, protiúnavové, neuroprotektivní a protizánětlivé účinky ve studiích in vivo i in vitro [7]. V posledních letech se uvádí, že CPhG mají hepatoprotektivní účinky. Potenciální mechanismy, které jsou základem těchto účinků, jsou vychytávání volných radikálů, ochrana jaterních membrán, imunoregulace, inhibice apoptózy, inhibice exprese HBsAg a HBeAg a inhibice replikace HBV DNA a další [8–11]. Nicméně jen málo studií v literatuře se zabývá účinkem GPhC proti jaterní fibróze. Proto se tato studie zaměřovala na zkoumání účinku GPhC proti jaterní fibróze pomocí modelu jaterní fibrózy u potkanů ​​indukované hovězím sérovým albuminem (BSA). Související molekulární mechanismy byly zkoumány v buňkách HSC-T6.

Metody

Chemikálie a činidla

Hydroxyprolinová souprava (Alkaline hydrolysis) (Lot: 20140616) byla zakoupena od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Čína). Krysí TGF- 1 sendvičové ELISA soupravy (šarže: 238240615) byly zakoupeny od Lianke Biotech Co., Ltd. (Čína). Králičí protilátka proti kolagenu I (šarže: 140619), králičí protilátka proti kolagenu III (šarže: 980788 W) a králičí protilátka proti TGF- 1 (šarže: 140619) poskytla společnost Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Čína). Přiloženo s normálním ovčím sérem (pracovní tekutina) (šarže: WP141214), PV-6000 (šarže: WK141225) a soupravou DAB (šarže: K136621D) byly zakoupeny od společnosti Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Čína). Detekce primárních protilátek byla provedena pomocí 2. roztoku protilátky (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) a 2. Roztoku protilátky (Alk-Phos. Conjugated, Anti-myší) (šarže: 272387) zakoupeného od Invitrogen Company (USA) .

Bovinní sérový albumin (BSA) (šarže: SLBG8239V) byl zakoupen od společnosti Sigma (USA). Před použitím byl BSA připraven v koncentraci 18 g/l v normálním fyziologickém roztoku, bakterie byly odstraněny filtrací a BSA byl skladován při 4 stupních. Freundovo neúplné adjuvans obsahující 1 g lipidu z ovčích chlupů (šarže: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Čína,) bylo smícháno s 2 g tekutého parafínu (šarže: 20130815, Tianjin Co. Fuyu Fine Chemical Co. Ltd. (Čína), sterilizováno v parním autoklávu a skladováno při 4 stupních. Pozitivní lék BJRG byl získán jako tablety Biejiarangan od společnosti Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Čína). Zásoby léků BJRG byly připraveny rozpuštěním tablet BJRG v destilovaná voda v koncentraci 600 mg/kg.

Fenylethanol glykosidvCistanchemá preventivní účinky

Rostlinné materiály

Cistanche tubulosa(rodina Orobanchaceae) byla zakoupena z oblasti Minfeng v Xinjiang v Číně. Materiál byl ověřen výzkumníkem Jun Zhao, Klíčová laboratoř pro ujgurskou medicínu, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Poukazové vzorky byly uloženy v Institutu Materia Medica v Xinjiangu.

Příprava CPhG

Sušené a nakrájené oddenkyCistanchetubulosa(6,{1}} kg) byly postupně extrahovány pod zpětným chladičem třikrát 70% ethanolem a rozpouštědlo bylo odstraněno, čímž byl získán ethanolový extrakt. Ethanolové extrakty byly purifikovány za použití AB-8 pryskyřice za získánífenylethanoidglykosidy(CPhGs). Zásobní roztoky CPhG používané pro různé dávkové skupiny ve studiích na zvířatech (500 mg/kg, 250 mg/kg, respektive 125 mg/kg) byly rozpuštěny v 0,5 procenta (5 g/l) karboxymethylcelulóze ( sodná sůl).

Kvantifikace CPhGs

Obsah dvou složek (echinakosidu a akteosidu) v CPhG byl stanoven pomocí HPLC za použití dříve popsané metody (Zhang et al. 2004)[12]. HPLC byla provedena za použití Shimadzu LC-10AHPLC vybaveného UV detektorem. HPLC kolona byla kolona Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 um). Izokratická mobilní fáze sestávala ze směsi methanol-acetonitril-1% kyseliny octové (15:10:75, obj./obj./obj.). Eluce probíhala 40 min a průtok byl udržován na 0,6 ml/min. Teplota kolony byla udržována konstantní na 30 stupních. UV detekce byla při 334 nm.

Zvířata a buněčná linie HSC-T6

[Stupeň SPF] zdraví dospělí samci potkanů ​​Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) byli zakoupeni od Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, číslo licence: SCXK (New)2011–0004. Krysy byly krmeny potravou bez specifických patogenů (SPF). Všechny postupy související s pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku zvířat První přidružené nemocnice lékařské univerzity Xinjiang. Potkani byli umístěni v klecích za kontrolovaných podmínek prostředí (25 stupňů a 12 hodinový cyklus světlo/tma) a měli volný přístup ke standardnímu krmivu pro krysy ve formě pelet a vodovodní vodě. Potkani se před ošetřením aklimatizovali.

Zvěčněná krysí jaterní hvězdicová buněčná linie, HSC-T6, byla získána od Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, Čína). Buňky HSC-T6 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (vysoká glukóza) (DMEM, Peking, Čína) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra (Gibco, Jižní Amerika), 100 IU/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (Peking, Čína). ) ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2.

BSA-indukované poškození jater a léčby

Sedmdesát pět SD potkanů ​​bylo náhodně rozděleno do šesti skupin: normální (ošetřené destilovanou vodou), model (ošetřené BSA), pozitivní léčivo (ošetřené BSA plus BJRG 600 mg/kg/den) a skupiny léčené BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/den). Skupiny léčené BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/den) měly 13 krys v každé skupině a druhá skupina měla 12 krys v každé skupině. Model poškození jater vyvolaný BSA se dělí na primární senzibilizaci, po níž následuje imunologický záchvat) [13]. Kromě normální skupiny bylo ostatním skupinám podáváno několik subkutánních injekcí s 0,5 ml (9 mg/ml) BSAFreundova nekompletního adjuvans v den 1, den 15, den 22, den 29 a den 36 pro primární senzibilizaci. Sedm dní po páté injekci byla krev získána přes plexus krysí žíly a testována na protilátky proti sérovému albuminu. Protilátka BSA v krysím séru byla detekována metodou dvojité agarové difúze. Útočná injekce byla provedena podáním 0,4 ml BSA v normálním fyziologickém roztoku do ocasní žíly u potkanů ​​s pozitivními protilátkami BSA dvakrát týdně po desetkrát. Koncentrace a časy injekcí byly 5.00, 5,50, 6.00, 6,50,7.00, 7,50, 8,50, 9,00, 9,50 a 10,00 g/l v den 46 50. den, 53. den, 57. den, 60. den, 64. den, 67. den, 71. den, 74. den a 78. den. V normální skupině byl pro imunologické primární (senzibilizace) a sekundární (útok) injekce místo BSA použit normální fyziologický roztok a ostatní podmínky byly stejné jako v modelové skupině.

Normální skupině byla perorálně podávána destilovaná voda v dávce 10 ml/kg/den. Modelové skupině bylo orálně podáváno 10 ml/kg/den 0,5% roztoku CMC-Na. Pozitivní lékové skupině bylo orálně podáváno 600 mg/kg/den BJRG. Skupinám léčeným BSA plus CPhG (125, 250 a 500 mg/kg/den) bylo orálně podáváno 125, 250 a 500 mg/kg/den CPhG, v daném pořadí. Denní dávkování potkanům pokračovalo dva týdny po poslední injekci.

Po experimentálním období byly krysy ponechány na lačno po dobu 12 hodin před podáním 10% chloralhydrátu a poté byly okamžitě usmrceny. Vzorky séra byly odebrány od každého potkana a okamžitě použitého. Játra byla odebrána pro dva účely: (1) konzervace v kapalném dusíku pro Hyp kity a (2) fixace v 10% formaldehydu pro histologická a imunohistochemická vyšetření. Celková doba trvání studií na zvířatech byla 93 dní.

Fenylethanol glykosidvCistanchemá preventivní účinky

Indexy jater a sleziny

Játra a slezina byly vypreparovány laparotomií a promyty 4° normálními fyziologickými roztoky. Po absorbování přebytečné vody filtračním papírem byly játra a slezina zváženy, aby se vypočítaly odpovídající indexy: Relativní hmotnost orgánu=hmotnost orgánu (g)/tělesná hmotnost jednotlivce (g) × 100 procent [14].

Analýza markerů jaterní fibrózy

Ochranný účinek CPhG proti poškození jater vyvolanému BSA byl hodnocen měřením ALT a AST (automatický biochemický analyzátor Mind ray, A086A0182). Vývoj jaterní fibrózy a účinky léčby byly stanoveny vyšetřením HA, LN, PC III a IV-C (chemiluminiscenční analyzátor, TaiGeKeXin, MP2808).

Analýza obsahu Hyp a TGF- 1

Hladina Hyp v jaterní tkáni byla stanovena spektrofotometrickou metodou podle instrukcí soupravy. Hladina Hyp byla vyjádřena jako Hyp (ug)/protein (mg).Hyp (ug/mg)=(měřená OD - OD slepého vzorku)/(standardní OD slepého pokusu) × 5 (ug/ml) × 10/vlhká hmotnost tkáně (ml/mg). Hepatální koncentrace TGF- 1 byla detekována pomocí souprav ELISA podle pokynů výrobce. Inhibiční účinek CPhG na fibrózu byl potvrzen hladinami exprese TGF- 1.

Histopatologické vyšetření

Jaterní tkáň ve stejné části levého laloku byla resekována a fixována v 10% roztoku formaldehydu. Tkáně byly obarveny konvenčním barvením H&E a Massonovým strichromem pro pozorování histopatologických změn pod světelným mikroskopem. Exprese kolagenu typu I, kolagenu typu III a TGF- 1 v jaterních tkáních byla analyzována imunohistochemickým barvením [15].

Semikvantitativní imunohistochemie byla provedena podle uvedených metod [16, 17]. Pro TGF- 1 pozitivní buňky byly použity následující klasifikace: "-" označuje téměř žádnou expresi, 20=l; "plus" označuje pozitivní buňky jednotlivě shromážděné v oblasti léze, 21=2; "plus plus" označuje pozitivní buňky v malých skupinách shromážděných kolem oblasti léze, 22=4; " plus plus plus " označuje rozptýlené pozitivní buňky vyjádřené jako 23=8. Výsledky představují hierarchickou integraci. Chromogenní stupeň a rozsah kolagenu typu I a kolagenu typu III byly převedeny na CRI pro statistickou analýzu (stupeň chromogenity × chromogenní rozsah). Chromogenní stupeň se dělí na slabé „plus“, střední „plus plus“ a silné „plus plus plus“. Chromogenní rozsah je rozdělen na " plus ", jeho chromogenní rozsah < zobrazení="" 1/4;="" "plus="" plus",="" jeho="" chromogenní="" rozsah="" vidění/4-2/4;="" "plus="" plus="" plus",="" jeho="" chromogenní="" rozsah="" vidění="" 2/4-3/4;="" "plus="" plus="" plus="" plus",="" jeho="" chromogenní="" rozsah=""> 3/4. Blindscoring prováděli dva lidé, kde „plus“ je 1; "plus plus" je 2, "plus plus plus" je 3 a "plus plus plus plus" je 4. Pro každý řez byla náhodně vybrána tři pozorovací pole mikroskopu (zvětšení × 200), přičemž průměrná úroveň vzorků byla použita jako semikvantitativní úroveň.

Buněčné experimenty

Buňky HSC-T6 byly umístěny na 96-jamkovou destičku. Zpočátku byly buňky kultivovány s DMEM obsahujícím 10 procento FBS po dobu 48 hodin. Médium bylo poté nahrazeno DMEM bez FBS, aby se buňky vyhladověly po dobu 12 hodin. Buňky byly poté kultivovány s DMEM, který obsahoval 5,0 ng/mLTGF- 1 (bez FBS) po dobu 24 hodin. Konečně různé koncentrace CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml a 25 ug/ml), akteosidu (6 ug/ml, 3 ug/ml a 1,5 ug/ml), andechinakosidu (500 ug/ml, 250 ug/ml, a 125 ug/ml) byly provedeny na destičce ve čtyřech jamkách a inkubovány po dobu 48 hodin.

Analýza PCR v reálném čase

Hladina exprese mRNA NF-KB, p65 a kolagenu I byla stanovena pomocí PCR v reálném čase. Pro stanovení exprese mRNA v buňkách HSC-T6 byly buňky (4 × 105buněk) naočkovány do šestijamkových destiček s 3 ml DMEM s 10 procenty FBS a inkubovány přes noc při 37 stupních a 5 procentech CO2. buněčná kultivační média byla vyměněna za DMEM bez séra. Dále CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml a 25 ug/ml), akteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml a 1,5 ug/ml) a echinakosid (500 ug/ml, 250 ug Do jamek bylo přidáno 125 ug/ml). Po 48 hodinách inkubace s CPhG nebo monomerními kompozicemi byla celková RNA extrahována pomocí činidla TRIzol (Invitrogen, USA) a intenzivně míchána s chloroformem po dobu 15 sekund. Po sezení při teplotě místnosti po dobu 3 minut byl lyzát centrifugován při 12,000 x g po dobu 15 minut při 4 stupních. RNA ve vodné fázi byla vysrážena isopropanolem a horní vodná fáze byla přenesena do nové mikrocentrifugační zkumavky. RNA byla precipitována přidáním 0,75 procenta ethanolu, poté byla mikrocentrifugační zkumavka a centrifugována při 12,000 x g při 4 stupních po dobu ne delší než 5 minut. Supernatant byl odstraněn a RNA byla sušena při pokojové teplotě po dobu 5-10 minut. Specifické sady primerů (Sangon, Shanghai, Čína), které byly použity pro amplifikaci potkaního aktinu [GenBank: NM_031144.3], kolagenu I [GenBank: NM_ 053304.1] a NF- Geny κB p65[GenBank: NM_199267.2] byly navrženy pomocí dávkového primeru 3. Dopředné (FW) a reverzní (RV) primery byly následující: Kolagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -aktin (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGCGA CAG GGA CAA CAC A). Výsledky byly normalizovány na mRNA housekeepinggenu -aktinu jako vnitřní kontrola a jsou prezentovány jako relativní hladiny mRNA

Reakce byly provedeny s 8 μl IQ SYBR GreenSupermix, 1 μl 10 pM páru primerů, 8,5 μl destilované vody a 2,5 μl cDNA. Každá polymerázová řetězová reakce byla provedena za následujících podmínek: 95 stupňů po dobu 3 minut, poté 40 cyklů po 10 s při 95 stupních, 30 s při 55 stupních a 10 s při 55 stupních – 95 stupních pro prodloužení, následované měřením jedné fluorescence. Konečné výsledky byly popsány s relativními hodnotami (2-ΔACt). Výpočty a analýzy byly provedeny detekčním systémem iQ5 Real-Time PCR.

Western blot analýza

Hladiny exprese proteinu kolagenu I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) byly stanoveny metodou Western blotting [s -actinem (šarže: 60008-1-lg; Proteintech, Čína) jako kontrolní kontrolou. Celobuněčné extrakty byly připraveny pomocí radioimunoprecipitačního testu (RIPA) (Thermo Scientific, USA) pufru s 1 procentem koktejlu inhibitoru Haltproteázy (Thermo Scientific, USA) a 1 procenta koktejlu inhibitoru Halt fosfatázy (Thermo Scientific, USA). Koncentrace proteinu byla měřena a kvantifikována Bradfordovou metodou [18]. Protein (10–50 ug) byl separován na 10% SDS-PAGE gelu a přenesen na PVDF membrány (Millipore, USA). protilátka, ředění 1:200 nebo myší mAb -aktinu, ředění 1:5000) byly inkubovány při 4 stupních přes noc. Odpovídající Alk-Phos. konjugované sekundární protilátky byly inkubovány při teplotě místnosti. Nakonec byly temembrány třikrát promyty 1 x Tris-HClsaline s 0,1 procenta Tween 20 a signály byly skenovány a vizualizovány pomocí GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Na sledovaných proteinech byla provedena denzitometrická analýza a normalizována na -aktin pomocí softwaru GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -aktin byl použit jako vnitřní kontrola.

Statistická analýza

K ověření normality a homogenity rozptylu byly použity Shapiro-Wilkův test normality a Leveneův test variancehomogenity. Analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Tukeyho post hoc testem byla použita k identifikaci statistických rozdílů nehomogenních, normálně distribuovaných dat. Kruskal-Wallisův neparametrický test byl použit k analýze dat, která nejsou normálně distribuovaná nebo homogenní. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Významnost byla nastavena na P < 0.05.="" všechna="" data="" byla="" analyzována="" softwarem="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Výsledek

Kvantitativní stanovení CPhGsCPhGs vCistanchetubulosaobsahuje dvěFenylethanolglykosidyechinakosid a akteosid a jejich obsahy v CPhG byly stanoveny analýzou HPLC (obr. 1) na 42,71 ± 0,42 procent a 14,27 ± 0,18 procent, v uvedeném pořadí.

Indexy jater a sleziny

Jak ukázala tabulka 1, indexy jater a sleziny modelové skupiny byly významně zvýšeny [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" jaterní="" a="" slezinové="" indexy="" pozitivních="" lékových="" bjrg="" a="" cphg="" v="" různých="" dávkových="" skupinách="" byly="" významně="" sníženy="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" [pjátra="0.004," pjátra="0.003," pjátra="0.004," pjátra="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," v="" tomto="" pořadí].="" indexy="" jater="" a="" sleziny="" byly="" nižší="" než="" u="" modelové="">

Účinky CPhG na aktivity ALT, AST a markery jaterní fibrózy

V této studii byly sérové ​​hladiny jaterních enzymů AST a ALT významně zvýšeny v modelové skupině, což odráží hepatocelulární poškození u potkanů ​​s jaterní fibrózou vyvolanou BSA. Experimenty však ukázaly, že léčba BJRG (600 mg/kg) a CPhGs (125, 250 a 500 mg/kg) významně snížila AST[PAST < 0,001,="" minulost="">< 0,001,="" minulost="">< 0,001,="" minulost="">< 0,001]="" a="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0,189" ,="" palt="0.255," v="" tomto="" pořadí]="" u="" jaterních="" potkanů="" ​​s="" fibrózou.="" (tabulka="">

Hladiny HA, LN, PC a IV-C u krysích modelů byly významně zvýšeny [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" v="" tomto="" pořadí].="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" byly="" úrovně="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="0.023," v="" tomto="" pořadí],="" ln="" [pln="0,011,=0,004" pln,="0,026" pln,="0,069" pln],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }},006,="" p="" pciii="0,067," p="" pciii="0,136," p="" pciii="0,296]" a="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" v="" tomto="" pořadí]="" u="" potkanů="" ​​byly="" výrazně="" sníženy="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" a="" cphgs="" při="" různých="" dávkových="" skupinách="" (125,="" 250="" a="" 500="" mg/kg="" )="" (tabulka="">

Hyp obsah a TGF- 1

Obsah kolagenu byl také detekován měřením Hyplevelů v jaterní tkáni. Jak je uvedeno v tabulce 4, průměrná hladina Hyp v modelové skupině byla významně vyšší než u normální skupiny, ale byla výrazně snížena ve skupině BJRG a ve skupinách s různými dávkami CPhG.

Jaterní koncentrace TGF{{0}} modelové skupiny u potkanů ​​byla významně zvýšena [P < 0.001].="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou,="" hladiny="" tgf-="" 1="" pozitivního="" léku="" a="" různé="" dávkové="" skupiny="" cphg="" byly="" výrazně="" sníženy="" [p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001].="" výsledky="" jsou="" shrnuty="" v="" tabulce="">

Histopatologické vyšetření

Pozorování řezů normální jaterní tkáně obarvených H&E a Massonovým trichromem vykazuje zřetelné hepatiklobuly a jaterní sinusoidy. Struktura jaterní tkáně u modelu krys byla narušena a jaterní tkáň a jaterní sinusoidy byly nahrazeny velkým množstvím pojivové tkáně. V léčené skupině však byla detekována normálnější cytoarchitektura a méně pojivové tkáně než v modelové skupině.

H&E barvení

U normální skupiny byla pozorována strukturální integrita jaterního lalůčku bez abnormálních portálních oblastí a jaterních sinusoid. Jaterní provazce byly uspořádány uspořádaně, s jádrem kulatým a průhledným. Jádra jsou umístěna ve středu buňky s bohatou cytoplazmou. Pouze oblast portálu má malé množství vazivové tkáně (obr. 2a).

V modelové skupině byla laločnatá struktura vážně poškozena. Jaterní buňky vykazovaly mírnou vodnatou degeneraci, většinou balonovou degeneraci a/nebo tukovou degeneraci. Byla také pozorována tvorba zánětlivé buněčné infiltrace, rozsáhlá hyperplazie fibrózní tkáně, tvorba velkého počtu fibrózní přepážky, rozštěpených lalůčků a významná proliferace jaterních buněk. Tato pozorování potvrdila úspěšnost vytvoření zvířecího modelu imunitního poškození u potkanů. jaterní fibróza (obr. 2b).

Ve srovnání s modelovou skupinou došlo ke snížení infiltrace zánětlivých buněk u různých CPhG. Pozorována byla také menší nekróza a tuková degenerace jaterních buněk a také zmírnění fibrózy. CPhGs významně zmírnil patologii jaterní fibrózy indukované BSA u potkanů, zmírnil otok jaterních buněk a účinně zabránil nekróze hepatocytů a infiltraci zánětlivých buněk, což naznačuje, že CPhGs má ochranný účinek na jaterní fibrózu potkanů ​​indukovanou BSA. (obr. 2c–f ).

Massonovo trichromové barvení

V normální skupině byla jaterní tkáň normální. Oblast jaterního portálu vykazovala malý počet bluekolagenových vláken a jaterní tkáň byla normálně strukturovaná (obr. 3a). Ve srovnání s jaterní tkání normální skupiny vláknitá tkáň proliferovala centrálním cípem a expandovala do jaterního parenchymu. Kolagenová vlákna se rozšiřovala a spojovala a obalovala celý lalůček a obklopovala centrální žílu. Tyto účinky spolu s fibrózou hepatocytů, poškozením lobulární struktury, periportální fibrózou a tvorbou pseudobulů (obr. 3b) poskytly důkaz, že model byl vytvořen.

Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna u pozitivní kontrolní skupiny mírně prodloužena směrem ven z periferní portální oblasti (obr. 3c). Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna v různých dávkových skupinách CPhG významně snížena, proliferace vláken byla inhibována a proliferace vláknité tkáně v jaterním parenchymu významně snížena. Tyto výsledky naznačují, že CPhG chránily potkany před jaterní fibrózou vyvolanou BSA (obr. 3d–f).

Imunohistochemické barvení

Důležité je, že exprese kolagenu typu I a kolagenu typu III hraje zásadní roli ve vývoji jaterní fibrózy a jejich tvorba a ukládání v jaterní tkáni by mohly sloužit jako důležitý determinant účinnosti proti jaterní fibróze. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5.

Kolagen typu I

Normální skupina exprimovala kolagen typu I hlavně v krevních cévách a portální oblasti. Modelová skupina vysoce exprimovala vaskulární fibrózu kolagenu typu I v portálních oblastech. V prostoru Disse bylo barvení kolagenem typu I pozorováno jako pruh nebo jako nerovnoměrná distribuce. Kolagen obalil fibroussepta a vytvořil pseudolobule. V těchto experimentech se vytvořilo méně vláknitých přepážek pro BJRJ (600 mg/kg) a různé dávkové skupiny CPhGs (125, 250 a 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023, respektive PCol I=0.044]. Semikvantitativní výsledky ukázaly, že exprese jejich kolagenu typu I byla významně nižší ve srovnání s modelovou skupinou (obr. 4).

Kolagen typu III

Kolagen typu III byl slabě exprimován v normální skupině a periferní oblasti obklopující portální a jaterní žíly vykazovaly místo souvislých vláken malé množství jemně žluté (obr. 5a). V modelové skupině kolagenová vlákna vykazovala široké a tlusté provazce, což ukazuje na silnou expresi, lokalizovanou především v oblasti portální a vazivové tkáně (obr. 5b).

Kolagenová vlákna BJRJ (600 mg/kg) a různé skupiny dávek CPhG (125, 250 a 500 mg/kg) byla vláknitá a distribuovaná kolem centrální žíly a portálních oblastí. Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna významně redukována, barvení bylo bledé a tenké a imunohistochemické barvení bylo slabě pozitivní (obr. 5c–f). Tyto semikvantitativní výsledky ukazují, že pozitivně exprimované buňky v pozitivních a různých dávkových skupinách [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 a PCol III=0.037] byly odlišné od těch ve skupině modelů.

TGF- 1

V jaterních buňkách normálních potkanů ​​byla exprese TGIF- 1 malá. Exprese byla omezena na malý počet intersticiálních buněk (obr. 6a). V modelové skupině byla exprese TGF- 1 široce distribuována v oblasti portálu, fibrózních prostorů, jaterních hvězdicových buňkách, zánětlivých buňkách, sinusové stěně a cytoplazmě. Konkrétní oblast portálu vykazovala silně pozitivní expresi s hnědožlutým zbarvením (obr. 6b).

Bylo zjištěno malé množství exprese v oblasti portálu a vazivových přepážek BJRJ (600 mg/kg) a různých dávkových skupin CPhG (125, 250 a 500 mg/kg). Rozsah pozitivního barvení v těchto skupinách byl významně snížen ve srovnání s modelovou skupinou. Zbarvení v intersticiálních buňkách ve fibrózních septech a cytoplazmě zánětlivých buněk bylo sníženo (obr. 6c–f). Semikvantitativní výsledky odhalily, že BJRJ a různé dávkové skupiny CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" resp.]="" byly="" významné="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="">

Jak již bylo zmíněno dříve v článku, TGF- 1 je důležitým cytokinem v patofyziologii jaterní fibrózy, který stimuluje produkci extracelulární matrice [19]. Ukázali jsme, že hladina TGF- 1 se v modelové skupině zvýšila způsobem konzistentním se závažností jaterní fibrózy. Hladiny exprese TGF- 1 v játrech byly konzistentní s hladinami TGF- 1 v séru. To ukazuje, že CPhG mohou významně snížit jaterní fibrózu v důsledku exprese TGF- 1 tím, že se účastní syntézy a degradace ECM.

Exprese kolagenu typu I, kolagenu typu III a TGF- 1 může detekovat patologický proces jaterní fibrózy. Hladiny jejich exprese v léčených skupinách byly významně sníženy a ukázalo se, že CPhG mohou zlepšit aktivitu kolagenázy, udržovat dynamickou rovnováhu syntézy a degradace ECM v játrech, čímž zpomalují a zabraňují vzniku jaterní fibrózy.

Exprese NF-KB p65 a kolagenu I po lékové intervenci v buňkách HSC-T6

Aby bylo možné charakterizovat signály jaterní fibrózy, byly pomocí RT-PCR stanoveny dva klíčové regulační geny v játrech. Data ukázala, že buňky tHSC-T6 z kontrolní skupiny měly nižší hladiny NFKB a mRNA kolagenu typu I. Naopak TGF- 1 indukoval buňky HSC-T6, aby výrazně zvýšily regulaci NF-κB (P < 0.01)="" a="" col-i="" (p="">< 0,01)="" mrna,="" s="" hladinami="" vyššími="" než="" ti="" v="" kontrolní="" skupině.="" v="" přítomnosti="" různých="" koncentrací="" cphg="" jsou="" výsledky="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" pro="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" pro="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0,007" pro="" 50="" ug/ml="" a="" p="" nf-κb="0,012" pro="" 25="" ug/ml,="" v="" tomto="" pořadí]="" a="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," v="" tomto="" pořadí]="" vykazovaly="" snížené="" exprese="" těchto="" mrna="" (="" obr.="">

Western blot analýza hladiny kolagenu I po lékové intervenci v buňkách HSC-T6

Obrázek 8 ukazuje hladiny exprese proteinu kolagenu I v buňkách HSC-T6 různých experimentálních skupin. Hladina exprese proteinu kolagenu I byla významně snížena v různých dávkových skupinách CPhG (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, a 25 ug/ml) ve srovnání se skupinou TGF- 1.

Diskuse

CPhGs je fenylethanoidní glykosid izolovaný a purifikovaný z oddenku Cistanche, který se používá jako tradiční čínská bylinná medicína. V posledních letech se ukázalo, že CPhGs má silnou schopnost předcházet poranění jater [20]. Proto jsme se zaměřili na zkoumání, zda CPhG mají inhibiční účinky na fibrózu hepatitidy způsobenou BSA-indukovanou jaterní fibrózou u potkanů. BJRG se běžně používá jako terapeutické léčivo pro jaterní fibrózu v Číně. Je vyroben z želvích krunýřů. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis atd. mají účinky na doplnění Qi a krve, zmírnění únavy, změkčení uzlin. Předchozí studie navíc ukazují, že má zjevnou funkci blokování časné jaterní fibrózy, inhibici proliferace buněk ukládajících tuk a snížení syntézy kolagenu [21]. Proto byl BJRG v této studii použit jako pozitivní lék.

Patologické změny jaterní fibrózy u potkanů ​​vyvolané injekcemi BSA jsou podobné jako u lidské portální cirhózy [22]. CPhG v závislosti na dávce zmírnily stupeň jaterní fibrózy a inhibovaly transformaci HSC na buňky podobné myofibroblastům, snížily zvýšené hladiny sérové ​​ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 a jaterní index a výrazně potlačily expresi kolagenu I, kolagen III a TGF- 1 v jaterní tkáni.

Stádia jaterní fibrózy korelují s hladinami HA, LN a IV-C v séru, které jako markery mohou hrát roli při detekci stupně jaterní fibrózy [23]. Bylo popsáno, že HA je hlavním zdrojem extracelulární matrix. IV-C jako základní prvek bazální membrány bude hojně syntetizován a silně ukládán v dřívějších fázích jaterní cirhózy. Sérové ​​hladiny LN a IV-C jsou indexy rychlosti obratu bazální membrány a ukazují stupeň fibrózy v oblasti portálu a sinusových kapilár [24]. PC III je markerem v diagnostice jaterní fibrózy a časné cirhózy, ale jeho senzitivita a specificita nejsou vysoké a v mnoha referencích není mezi jednotlivými stádii fibrózy žádný významný rozdíl [24, 25]. Tato studie dosáhla podobného výsledku.

Kromě toho pozorování H&E a Massonovy trichromem barvené řezy vykazují normální jaterní tkáně s výraznými jaterními lalůčky a jaterními sinusoidami. Struktura jaterní tkáně v modelové skupině byla narušena a jaterní tkáň a jaterní sinusoida byly nahrazeny velkým množstvím pojivové tkáně. V léčebných skupinách však bylo ve srovnání s modelovou skupinou pozorováno významné zlepšení.

Důležité je, že exprese kolagenu typu I a kolagenu typu III hrají zásadní roli ve vývoji jaterní fibrózy, jejíž blokování může zabránit a léčit jaterní fibrózu. Proto tvorba a ukládání kolagenu typu I a kolagenu typu III v jaterní tkáni může sloužit jako důležitý determinant účinnosti proti jaterní fibróze. TGF- 1 je také důležitým profibrogenním cytokinem při poškození jater a je biologicky aktivní s mnoha farmakologickými účinky[26]. K udržení tkáňové homeostázy je nutná rovnováha mezi těmito akcemi. Aberantní exprese TGF 1 se podílí na patogenezi jaterních onemocnění [27, 28]. Je známo, že TGF- 1 je klíčový cytokin, který se podílí na časných stadiích jaterní fibrózy. Oxidační stres spouští TGF- 1, což má za následek stimulaci produkce a ukládání ECM [29]. Proto je jednou z účinných strategií výroby léku proti jaterní fibróze identifikace látek proti TGF{11}}. Imunohistochemická analýza ukázala, že exprese kolagenu typu I, kolagenu typu III a TGF- 1 by mohla detekovat patologický proces jaterní fibrózy. Exprese kolagenu typu I, kolagenu typu III a TGF- 1 v léčených skupinách jsou sníženy, které byly výrazně nižší zejména ve skupině léčené vysokou dávkou CPhGs, a naznačují, že CPhGs je účinný kolagen typu I, kolagen typu III a inhibitorem TGF- 1. Předpokládá se, že CPhGs může zlepšit aktivitu kolagenázy, udržovat dynamickou rovnováhu syntézy a degradace ECM, čímž zpomaluje a zabraňuje vzniku jaterní fibrózy.

CPhG nejenže mohou zlepšit hepatickou fibrózu indukovanou BSA u potkanů, ale také mohou být spojeny s inhibicí aktivace HSC in vitro. Aktivace HSC je považována za klíčový krok fibrogeneze. V této studii výsledky ilustrovaly, že podávání CPhG od 25 do 100 ug/ml výrazně zeslabilo sníženou expresi NF-KB p65, expresi mRNA kolagenu I a expresi proteinu kolagenu I v HSC.

NF-κB hraje důležitou roli v modulaci imunitní odpovědi na infekci nebo podněty [30]. Hromadění NF-κB v jaterních buňkách může vést k náboru zánětlivých cytokinů/mediátorů, a tak indukovat rozvoj fibrózy [31, 32]. Kromě toho je kolagen také citlivým indexem, který odráží úroveň fibrózy a tvoří asi 50 procent celkového proteinu ve fibrózních játrech [33]. V důsledku toho jsme předpokládali, že molekulární mechanismus proti jaterní fibróze je spojen s CPhG zprostředkovanou inaktivací exprese NF-κB, ve které přínos přispívá k synergické roli zmírnění imunotoxicity a zánětlivého stresu v jaterní tkáni s lézí BSA, což dále koriguje dysmetabolismus na ameliorateliverové funkce.

Závěry

Závěrem lze říci, že naše studie ukazují, že CPhG významně zmírňují rozsah jaterní fibrózy indukované BSA u potkanů. Jeho mechanismus může být alespoň částečně způsoben inhibičním účinkem CPhG na složení ECM a stimulací degradace ECM a/nebo přímou inhibicí syntézy kolagenu typu I, kolagenu typu III a exprese TGF{{0 }}. Proto jsme očekávali, že CPhG mohou být použity ve zdravotnických produktech nebo v klinických lécích pro prevenci fibrózy lidských jater. Budoucí studie jsou nutné ke stanovení účinnosti CPhG jako silného léku proti jaterní fibróze.

Zkratky

CPhGs: anol glykosidy z cistanche;

BSA: hovězí sérový albumin;

HSC-T6: Jaterní hvězdicové buňky;

Hyp: Hydroxyprolin;

BJRG: tablety CompoundBiejiarangan;

TGF- 1: Transformující růstový faktor 1;

ALT: alaninaminotransferáza;

AST: aspartátaminotransferáza;

HA: kyselina hyaluronová;

LN: Laminin; PC III: prokolagen typu III;

IV-C: kolagen typu IV;

NF-KB: nukleární faktor kappa-lehký řetězec-zesilovač aktivovaných B buněk;

RT-PCR: Reverzní transkriptáza-polymerázová řetězová reakce;

SDS-PAGE: Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným.

Konkurenční zájmy

Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy

Příspěvky autorů

TL, JZ, SPY, LM, MT a SLZ vymyslely a navrhly experimenty. SPY, TL a JZ analyzovaly data. SPY a JZ napsali rukopis. TL,LM a JZ rukopis recenzovali. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Potvrzení

Tento výzkum byl podporován National Natural Science Foundation of China (81260624). Autoři by rádi vyjádřili své upřímné poděkování profesoru Tao Liuovi za jeho návrhy na zlepšení při psaní tohoto článku.

Podrobnosti o autorovi

1Katedra toxikologie, School of Public Health, Xinjiang MedicalUniversity, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Xinjiang Uyghur Autonomous AutonomousRegion, Čína. 2Klíčová laboratoř pro ujgurskou medicínu, Institute of MateriaMedica of Xinjiang, Urumqi 830004, Čína. 3Ne. 140 Xinhua South Road, okres Tianshan, Urumqi 830000 Xinjiang Ujgurská autonomní oblast, Čína.

Pro kontrolu klikněte semCistanchetubulosaprodukty

Reference
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Současný stav nových antifibrotických terapií u pacientů s chronickým onemocněním jater. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Jaterní hvězdicové buňky a jaterní fibróza. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogeneze jaterní fibrózy. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Přehledový článek: reverzibilita cirhózy. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Čínská akademie věd. 23. vyd. Čína: Redakční výbor Flora of China; 2013. str. 1–16.
6. Komise pro čínský lékopis Ministerstva zdravotnictví Čínské lidové republiky. Čínský lékopis, část 1. Čína: Nakladatelství chemického průmyslu; 2010. str. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Průběh výzkumufenylethanoidglykosidyzCistanchetubulosa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Účinek Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) na reprodukční toxicitu u myší indukovanou glykosidem Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H a kol. ACE a inhibitory agregace krevních destiček z Tamarix hohenackeri Bunge (hostitelská rostlinaHerbaCistanches) rostoucí v Sin-ťiangu. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P a kol. Zmírnění kolitidy vyvolané dextransulfátem sodným u myší extraktem obohaceným echinakosidemCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches stimuluje buněčný glutathionový redoxní cyklus reaktivními formami kyslíku generovanými mitochondriální respirací v H9c2 kardiomyocytech. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: RP-HPLC metoda pro současné stanovení echinakosidu a akteosidu v Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Studie zvířecího modelu imunitní fibrózy jater indukované hovězím sérovým albuminem. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Účinek extraktů Cichorium glandulosum na jaterní fibrózu indukovanou CCl4-. Iran Red Crescent Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF a kol. Clerodane diterpenoidy a prenylované flavonoidy z Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Korelace NF-κB a patologického stagingu jaterní fibrózy u pacientů s chronickou hepatitidou B. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Účinky celkových saponinů Panax notoginseng proti fibróze jater u potkanů. Acta Academiae Medicinae Militaris třetihorní. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Porovnání kolorimetrických testů s kvantitativní analýzou aminokyselin pro kvantifikaci proteinů zobecněných modulů pro membránové antigeny (GMMA). Mol Biotechnol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Pokroky v pochopení úlohy transformujícího růstového faktoru- 1 v patogenezi jaterní fibrózy. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z a kol. Ochranný účinek akteosidu na imunologické poškození jater vyvolané Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolysacharid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Účinky pilulek Fufang Biejia Ruangan na jaterní fibrózu in vivo a in vitro. World J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Úloha transformujícího růstového faktoru 1 a jeho receptoru v imunologicky indukované jaterní fibrogenezi u potkanů ​​a účinek polysacharidu cordyceps na ně. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Vztah mezi stagingem jaterfibróza a úrovně biochemie séra. HBPD INT. 2002;1:246–8.Vy a spol. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Strana 12 z 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Markery sérové ​​fibrózy v diagnostice jaterní fibrózy. BradaJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP a kol. Předběžná studie kombinace neinvazivních parametrů v diagnostice jaterní fibrózy. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Vztah mezi TGF- 1, PDGF-BB, CTGF a chronickou hepatitidou B s fibrózou. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D a kol. Extrakty Boswellia serrata a Salvia miltiorrhiza snižují DMN-indukovanou jaterní fibrózu u myší snížením TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY a kol. Účinek gypenosidů na dráhu TGF- 1/Smad u jaterní fibrózy vyvolané tetrachlormethanem u potkanů. Stážista J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Ochrana antioxidačním mechanismem berberinu proti fibróze jater potkana vyvolané četnými hepatotoxickými faktory. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Signální dráha jaderného faktoru kappa B: integrace metabolismu se zánětem. Trends Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB při poškození jater, fibróze a hepatocelulárním karcinomu. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Toll-like receptors in jaterní choroby. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Dietní suplementace borůvkové šťávy zvyšuje jaterní expresi metalothioneinu a zmírňuje jaterní fibrózu u potkanů. PLoS One. 2013; 8, e58659.