Preparativní izolace a čištění čtyř sloučenin z Cistanches Deserticola YC Ma vysokorychlostní protiproudovou chromatografií

1. Úvod

Cistanches deserticolaYC Ma, druhCistancheskterá patří kOrobanchaceaerodina, je známá tradiční čínská medicína pro léčbu nedostatku ledvin, ženské neplodnosti, chorobné leukorey, neurapraxie a stařecké zácpy [1]. Je to parazitická rostlina, která je široce rozšířena na severozápadě Číny. Dosud několik sloučenin, včetněfenylethanoidní glykosidy (PhGs)z tohoto druhu byly izolovány iridoidy a lignany [2]. U některých PhG byly hlášeny antioxidační, hepatoprotektivní a neuroprotektivní aktivity [3–6]. Avšak postup izolace a čištění PhG je obtížný a časově náročný. Navíc klasické vícenásobné chromatografické metody nejen využívají velké množství organických rozpouštědel, ale také poskytují nižší výtěžnost vzorku. Vysokorychlostní protiproudá chromatografie (HSCCC), technika separační chromatografie kapalina-kapalina bez nosiče, nabízí vynikající výtěžnost vzorku ve srovnání s některými konvenčními metodami a je široce používána pro separaci a čištění různých přírodních produktů [7–9]. . Ačkoli několik PhG bylo purifikováno zCistanchesrodu a dalších HSCCC [10–14], žádná práce neuvádí čištění akteosidu, isoakteosidu, syringalidu A 3'- -L-rhamnopyranosid a 2'-acetylakteosid v jednom dvoufázovém systému.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tomto článku uvádíme jednoduchou metodu separace a purifikace čtyř PhG z C. deserticola. Nakonec bylo jednostupňovou separací získáno 30,9 mg akteosidu, 13,0 mg isoakteosidu, 12,5 mg syringalidu A 3'- -L-rhamnopyranosidu a 7,2 mg 2'-acetylakteosidu z 297 mg frakce s čistotou 99 %, 95 %, 99 %, respektive 98 %. Jejich struktury byly charakterizovány na základě 'H- a 13C-NMR spektrálních dat a HR-MS spekter. Struktury čtyř PhG identifikovaných v tomto výzkumu jsou znázorněny na obrázku 1.

2. Výsledky a diskuse

2.1. HPLC analýza surového extraktu

Frakce n-butanolového extraktu z C. deserticola obohacená o složku byla analyzována pomocí HPLC-UV. Použitá kolona byla Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, vnitřní průměr 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, město, státní zkratka, USA), mobilní fáze byla methanol-voda (30:70, obj./obj.). Průtok byl 1 ml/min. Vlnová délka detektoru byla nastavena na 254 nm. HPLC chromatogram je znázorněn na obrázku 2. Píky 1 až 4 odpovídají akteosidu (1), isoakteosidu (2), syringalidu A 3'- -L-rhamnopyranosidu (3) a 2'-acetylakteosidu (4). .

2.2. Výběr dvoufázového rozpouštědlového systému

Úspěšná separace pomocí HSCCC do značné míry závisí na výběru vhodného dvoufázového systému rozpouštědel, dvoufázový systém rozpouštědel byl vybrán podle hodnot rozdělovacích koeficientů (K) každé cílové složky a optimální rozmezí K by mělo být od {{ 2}}.5 až 2.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V experimentu jsou hodnoty K pro cílové složky několika dvoufázových systémů rozpouštědel uvedeny v tabulce 1 (ačkoli o něco vyšší pro vrchol 4, výsledky se ukázaly jako přijatelné). Mezi nimi ethylacetát-n-butanol-ethanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v) poskytly vhodné rozdělovací koeficienty pro cílové sloučeniny. Nakonec byl systém rozpouštědel složený ze směsi ethylacetát-n-butanol-ethanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v) použit k izolaci a čištění čtyř sloučenin C. deserticola, jak je uvedeno na Obrázek 3. Jak je znázorněno na obrázku 2, analýza HPLC každé frakce HSCCC odhalila, že čtyři čisté PhG (akteosid, 99 %; isoakteosid, 95 %; syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid 99 % a 2'- ze surové frakce lze získat acetylakteosid 98 %).

3. Experimentální

3.1. Zařízení HSCCC

zařízením použitým v této studii byl vysokorychlostní protiproudý chromatografický systém TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Čína) se třemi preparativními vícevrstvými spirálovými separačními kolonami zapojenými do série (průměr zkumavky=2,6 mm, celkový objem=300 ml) a 2{{10}} ml vzorkovací smyčka. Poloměr otáčení neboli vzdálenost mezi osou držáku a středovou osou odstředivky (R) byl 5 cm a hodnota se pohybovala od 0,5 na vnitřním terminálu do 0,8 na externím terminálu (=r/R, kde r je vzdálenost od cívky k hřídeli držáku). K řízení teploty v experimentu bylo použito zařízení HX 105 s konstantní teplotou cirkulace (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Čína). Systém HSCCC byl vybaven modelem TBP-5002 středotlakým čerpadlem s konstantním průtokem, modelovým TBP-2000 UV detektorem pracujícím při 254 nm a modelovou pracovní stanicí V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Společnost, Šanghaj, Čína).

Použitým zařízením pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) byl systém Agilent 1200, který se skládá z binárního čerpadla G1312A, autosampleru G1329A, detektoru s proměnnou vlnovou délkou (VWD) G1314A, termostatovaného oddílu kolony G1316A, odplyňovače G1379B a pracovního zařízení Agilent LC. . Pro detekci čistoty byl použit alltech 3300 ELSD. Pro strukturní identifikaci sloučenin byly použity NMR spektrometry Agilent 6520 Q-TOF a Bruker AVANCE III 500-. 'H a 13C-NMR spektra (při 500 a 125 MHz, v daném pořadí) byla měřena při teplotě místnosti (22 stupňů /295,1 K).

3.2. Činidla a materiály

Ethylacetát, n-butanol a ethanol byly analytické čistoty a methanol byl čistoty pro HPLC. Všechna rozpouštědla byla zakoupena od Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Čína). Pro všechny roztoky a ředění byla použita voda Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA). Oddenek C. deserticola byl odebrán z provincie Vnitřní Mongolsko, Čínská lidová republika, v červnu 2009. Rostlinu identifikoval prof. Lijuan Zhang a do naší laboratoře byl uložen voucherový vzorek (č. 20091001).

3.3. Příprava surového vzorku

Dusité stonky C. deserticola (1 kg) sušené na vzduchu v prášku byly refluxovány dvakrát s vodným ethanolem (8 1, 60% v/v) pokaždé po dobu 2 hodin. Extrakt byl odpařen za sníženého tlaku a při teplotě 60 stupňů až do úplného odpaření ethanolu. Zbytek se suspenduje ve vodě a extrahuje se postupně třikrát chloroformem, ethylacetátem a n-butanolem, čímž se po odpaření do sucha za sníženého tlaku získá 5,16 g n-butanolového extraktu. N-butanový extrakt byl poté separován na silikagelové koloně (200–300 mesh) za použití progresivní gradientové eluce (CHCl3–MeOH, 10:1—>1:1), čímž bylo získáno osm frakcí. Frakce 6 (297 mg) byla použita pro další izolaci a separaci HSCCC.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA TRADIČNÍ ČÍNSKÉ LÉKY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Výběr dvoufázových rozpouštědlových systémů

Dvoufázové rozpouštědlové systémy byly vybrány podle rozdělovacího koeficientu (K) cílových složek ve frakci C. deserticola. Hodnoty K byly stanoveny LC analýzou následovně: Vhodné množství surového práškového extraktu (frakce 6) bylo rozpuštěno ve spodní fázi systému rozpouštědel a analyzováno pomocí HPLC. Oblasti píku byly zaznamenány jako A1. Poté byl k roztoku přidán stejný objem horní fáze a důkladně promíchán, aby se dosáhlo rozdělovací rovnováhy. Spodní fáze byla poté znovu analyzována pomocí HPLC. Plochy píku byly zaznamenány jako A2. K-hodnoty byly vypočteny podle následující rovnice: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Příprava dvoufázového systému rozpouštědel a roztoku vzorku

V této studii byl pro separaci HSCCC použit dvoufázový rozpouštědlový systém složený z ethylacetát-n-butanol-ethanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v). Každé rozpouštědlo bylo přidáno do dělicí nálevky a důkladně ekvilibrováno při teplotě místnosti. Horní fáze a spodní fáze byly odděleny a odplyněny sonikací po dobu 30 minut krátce před použitím. Roztok vzorku byl připraven rozpuštěním 297 mg frakce 6 v 15 ml spodní fáze ethylacetát-n-butanol-ethanol-voda (40:6:6:50, obj./obj./obj.).

3.6. Postup separace HSCCC

HSCCC byla provedena následovně. Vícevrstvá spirálová kolona byla nejprve naplněna horní organickou stacionární fází. Spodní vodná mobilní fáze byla potom čerpána do hlavy kolony průtokovou rychlostí 1,5 ml/min a ve stejnou dobu běžela aparatura HSCCC při rychlosti otáček 900 ot./min. Poté, co byla ustavena hydrodynamická rovnováha, jak je indikováno čirou mobilní fází eluující na koncovém výstupu (přibližně o dvě hodiny později), byl injekčním ventilem vstříknut 15 ml roztok vzorku obsahující 297 mg surového extraktu (frakce 6). Výtok z kolony byl kontinuálně monitorován při 254 nm. Čtyři vrcholové frakce byly shromážděny podle chromatogramu a poté odpařeny za sníženého tlaku. Teplota zařízení byla nastavena na 25 stupňů.

3.7. HPLC analýza a identifikace HSCCC vrcholových frakcí

Vrcholové frakce z HSCCC byly analyzovány pomocí HPLC-ELSD. Použitá kolona byla Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, vnitřní průměr 5 um) a mobilní fáze byla methanol-voda (30:70, obj./obj.). Průtok byl 1 ml/min. ELSD pracoval za následujících podmínek: Teplota 45 stupňů, plyn 1,6 l/min. Strukturní identifikace čtyř vrcholových frakcí HSCCC byla provedena pomocí HR-ESI-MS, 'H a 13C-NMR spektroskopie.

3.8. Strukturální identifikace

Frakce I: HR-ESI-MS pozorováno při m/z 623,2001 (M-H)-, vypočteno pro C29H35O15, 623,1981. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 rhamnosy), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} rhamnosy), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,1 (6H, aromatický H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{101}}), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc{122}} ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc{128}}), 103,1 (Rha{131}}), 72,3 (Rha{134}}), 72,1 (Rha{137}} ), 73,9 (Rha{140}}), 70,7 (Rha{143}}), 18,5 (Rha{146}}). Ve srovnání s údaji uvedenými v literatuře [17] odpovídala frakce I akteosidu.

Frakce II: HR-ESI-MS pozorováno při m/z 623,1987 (M-H)-, vypočteno pro C29H35O15, 623,1981. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 rhamnosy), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 rhamnózy), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatický H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{101}}), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc{122}} ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc{128}}), 102,8 (Rha{131}}), 72,4 (Rha{134}}), 72,4 (Rha{137}} ), 74,1 (Rha{140}}), 70,5 (Rha{143}}), 17,9 (Rha{146}}). 'H-NMR a 13C-NMR spektrální údaje byly v souladu s údaji pro isoakteosid, jak je uvedeno v literatuře [18].

Frakce III: HR-ESI-MS pozorováno při m/z 6{{10}8}}7,2032 (M-H)-, vypočteno pro C29H35O14, 607,2032. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 rhamnosy), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} rhamnosy), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6-7,1 (7H, aromatický H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{100}}), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc{121}} ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha{130}}), 72,3 (Rha{133}}), 72,2 (Rha{136}} ), 73,9 (Rha{139}}), 70,7 (Rha{142}}), 18,4 (Rha{145}}). Podle literatury [18] frakce III odpovídala syringalidu A 3'- -L-rhamnopyranosidu.

Frakce IV: HR-ESI-MS pozorováno při m/z 665,21{{20}} (M-H)-, vypočteno pro C31H37O16, 665,2087. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 rhamnosy), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 rhamnózy), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromatický H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf{102}}), 123,2 (Caf{105}}), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc{126}} ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc{132}}), 103,3 (Rha{135}}), 72,0 (Rha{138}}), 71,8 (Rha{141}} ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha{150}}), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 'H-NMR a 13C-NMR spektrální data byla v souladu s daty 2'-acetylakteosidu [17].

4. závěr

Byla zavedena metoda HSCCC pro preparativní separaci a čištění akteosidu, isoakteosidu, syringalidu A 3'- -L-rhamnopyranosidu a 2'-acetylakteosidu z Cistanches deserticola YC Ma. Tato studie ukazuje, že HSCCC je velmi výkonná technika pro preparativní separaci a čištění bioaktivních složek z rostlinných materiálů. Sloučeniny lze také izolovat v dostatečně velkém měřítku s vysokou čistotou a pak je lze použít jako referenční látky pro chromatografické studie nebo studie bioaktivity. Metoda je proveditelná, ekonomická a účinná technika pro rychlou preparativní izolaci komplikovaných přírodních produktů.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%