Čínská medicína Cistanche Chemické složení a analýza složek v těle Ⅲ

Kapitola 3 Kvantitativní analýza vícesložkových složek Cistanche deserticola založená na RPLC-HILIC-MS/MS

Chemické složení tradiční čínské medicíny je složité a obsahuje řadu sloučenin, jako jsou primární a sekundární metabolity [55-561. Dosažení komplexní a spolehlivé analýzy chemických složek tradiční čínské medicíny (včetně složek hydrofilních a hydrofobních) je stále velkým technickým problémem. Kromě toho se obsah každé složky v tradiční čínské medicíně velmi liší a konvenčními metodami hmotnostní spektrometrie kapalin je obtížné přesně kvantifikovat hlavní i stopové složky současně. 1571 Tradiční jednosloupcová separace nestačí a analýza stopových sloučenin v tradiční čínské medicíně bude omezena konstantami. V důsledku interference sloučenin je fenomén překrytí píku vážný. Přestože byla pro zlepšení separace komplexních matric použita řada pokročilých chromatografických technik, jako jsou kolony pro chromatografii s jádrem a submikronové částice, chromatografické kolony s hydrofilní interakcí atd., je stále obtížné dosáhnout komplexní separace různých sloučenin pomocí jeden sloupec [58 -59. Vícesloupcová chromatografie, která kombinuje alespoň dva ortogonální chromatografické mechanismy, jako je dvourozměrná LC, LC s přepínáním sloupců a tandemová dvousloupcová LC, byla považována za proveditelný nástroj, který může významně rozšířit pokrytí metabolity. Není pochyb o tom, že jak dvourozměrné LC, tak LC s přepínáním sloupců mohou výrazně zvýšit špičkovou kapacitu 160). Obě metody jsou však závislé na ventilu, přístrojové vybavení je složité a časově náročné a spojovací trubky a regulátory se snadno instalují. Existují rezidua a tyto dvě metody jsou náchylné k zavedení řady faktorů nejistoty vedoucích ke kvantitativní nereprodukovatelnosti1571. Chromatografie-tandem s hydrofilní interakcí s reverzní fází (RPLC-HILIC) sice nemůže výrazně zvýšit špičkovou kapacitu, ale přístrojové vybavení je jednoduché, ve spojovacích trubičkách a regulátorech nezůstávají žádné zbytky a přesto dokáže realizovat změnu z hydrofilní na hydrofobní. Komplexní retence velkého počtu široce polárních sloučenin [61-66. Kromě toho lze režim monitorování více reakcí (MRM) jedinečný pro hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem (QgQ) použít jako další separační rozměr pro další zlepšení separační schopnosti RPLC-HILIC. Stručně řečeno, RPLC-HILIC-MRM integruje inherentní výhody RPLC, HILIC a MRM a očekává se, že se stane spolehlivou analytickou metodou.

JAK DLOUHO TRVÁ, NEŽ CISTANCHE PŮSOBÍ?

Obsah jednotlivých složek tradiční čínské medicíny se velmi liší. Ve srovnání s hlavními složkami lidé věnují více pozornosti vývoji citlivějších metod pro dokončení detekce těchto stopových nebo dokonce ultrastopových sloučenin. Režim MRM je často doporučován pro jeho vynikající citlivost a dobrý lineární dynamický rozsah167. Vzhledem k saturaci koncových elektronových multiplikací v komoře Q3 hmotnostního spektrometru QqQ je však lineární rozsah obvykle zúžen a horní mez kvantifikace (ULOQ) nemůže plně pokrýt obsah některých hlavních sloučenin bez spolehlivého sledování. tyto stopové složky. Proto potlačení produkce produktových iontů může rozšířit ULOO. Pomocí oslabených parametrů sloučenin, jako jsou iontové páry,depotenciální(DP) asrážkovou energii(CE) může snížit počet iontů cílového produktu a tím rozšířit ULOQ[68-69]

Tradiční čínská medicínaCistanches Herbaje sušený dužnatý stonek se šupinatými listyRostlina cistanches. Patří mezi běžně používané tradiční čínské léky a je známý jako „pouštní ženšen“. Fenylethanoidové glykosidy byly vždy horkým výzkumným tématem v Cistanche deserticola, ale v posledních letech byly dobře rozpoznány i farmakologické účinky jiných hydrofilních složek, jako je mannitol! 70-721. V naší rutinní kvantitativní analýze CH však obsah hlavních složek, jako je napřechinaceaside,verbascosidea manitol byly někdy příliš vysoké na to, aby překročily rozsah měření UV detektoru nebo detektoru rozptylu světla odpařováním (ELSD). Z hlediska celkového hodnocení kvality je proto důležité stanovit analytickou metodu, která dokáže současně monitorovat hydrofilní a hydrofobní složky a přesně kvantifikovat hlavní i stopové složky.

Experiment v této kapitole stanovil spolehlivou metodu vhodnou pro analýzu komplexních matric - kapalinovou hmotnostní spektrometrii RPLC-HILIC-MS/MS (sériově spřažená chromatografie s reverzní fází-hydrofilní interakce-tandemová hmotnostní spektrometrie), která dosáhla detekce 23 polarit v Cistanche deserticola . Současná separace, analýza a stanovení obsahu široké škály sloučenin (pokrývajících hydrofilní a hydrofobní složky); při použití režimu SMRM k zajištění reprodukovatelnosti této metody, použití vhodných hodnot CE a různých iontových párů k rozšíření borové šišky ULOQ hlavních složek, jako je inulin a verbascosid, umožňuje současnou kvantifikaci hlavních složek a stopových složek v Cistanche deserticola, což poskytuje proveditelný nástroj pro zlepšení kontroly kvality Cistanche deserticola a pomoc při dosahování široce cíleného metabolismu rostlin. Genomika.

Část 1 Experimentální materiály

1. Nástroj

Kapalný hmotnostní spektrometr HPLC-Qtap-MS je vybaven Shimadzu HPLC (vybaveným 2 čerpadly LC-20ADxR, automatickým vzorkovačem SIL-20ACxR, UV detektorem SPD-M20A, CTO-20AC termostat, DGU-20A3R online odplyňování Skládá se ze stroje, regulátoru CBM-20A, Shimadzu Corporation, Japonsko) a hmotnostního spektrometru SCIEX5500 Qtrap (iontový zdroj ESI, SCIEX, Foster City, CA, USA) . Sběr dat a výpočet byly dokončeny softwarem Analyst Software1.6.2. Systém čištění ultračisté vody Mili-Q (Milipore Company, USA), elektronické analytické váhy Mettler ME204 (Mettler Toledo Company, Švýcarsko), ultrazvukový extraktor (230V, Bransonmodel 5510, Danburry, CT, USA).

2. Materiály a činidla

Kolona Waters Acquity UPLC HSS T3 (2,1 x 100 mm, 1,8 um), kolona Waters XBridge Amide (4,6 mm x 150 mm, 3,5 um).Polyetheretherketon(PEEK) potrubí (Agilent Company, USA). Metanol, acetonitril a kyselina mravenčí pro hmotnostní spektrometrii čistoty pro chromatografii a hmotnostní spektrometrii byly zakoupeny od společnosti ThermoFisher (Pittsburgh, PA, USA) a voda byla ultračistá voda Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) vyrobená v laboratoři. . Niacin (kyselina nikotinová, cLogP, 0,799), kyselina jantarová (cLogP, -0,526) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, USA): uridin (cLogP, -2.219), adenoidní adenosin (cLogP, -2.158), inosin (cLogP, {{10}}}.106) a guanosin (cLogP , -3.326) byly zakoupeny od společnosti Beijing Xinjingke Biotechnology Co., Ltd. Salidroside (cLogP -0.296), 6-deoxycatalpol (cLogP, -3.071), fenylalanin (cLogP, -1,556), 8-kyselina epi-loganová (cLogP, -2,366), mannitol (cLogP, -2,046), sacharóza (cLogP , -3.087), glurosid (cLogP, -1.757), alaschaniosid A (alaschaniosid A, cLogP -0,971), echinakosid (echinakosid, cLogP, -1 .811), kyselina ferulová (cLogP, 1,421), akteosid (cLogP, -0.890), isoakteosid (cLogP, -0.057) a pinoresinol- -D-glukopyranosid (cLogP, -0.384) poskytla Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs of Peking University, cistanoside F (cistanoside F, cLogP, -2.211) zakoupeno od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd., cistanosid A (cistanosid A, cLogP, -1.365), 2'-acetylakteosid (cLogP, -0.040) a liquiritin apiosid (cLogP, -0.267) byly zakoupeny ze Šanghaje Shidande Biotechnology Co., Ltd. a tubulosid A (tubulosideA, cLogP, 0,287) byly zakoupeny od Chengdu Weiqi Biotechnology Co., Ltd. Čistota všech referenčních látek byla testována pomocí HPLC-DAD-IT-TOF-MS a čistota byla vyšší než 98 %. Všechny hodnoty cLogP kontrolní látky byly vypočteny softwarem ChemBioDraw Ultra14.0 (CambridgeSoftCambridge, MA, USA).