Příprava komplexu kyselina ferulová – fosfolipid pro zlepšení rozpustnosti, rozpouštění a aktivity inhibice buněčné melanogeneze B16F10
Mar 29, 2023
Abstraktní
Pozadí
Kyselina ferulová(FA; kyselina 4-hydroxy-3-methoxyskořicová) je přítomna v mnoha potravinách, včetně pšenice, rýže, ječmene, ovsa, citrusových plodů a rajčat [1]. Ukázalo se, že FA poskytuje významnou ochranu pokožky před oxidačním stresem vyvolaným UV zářením [2]. Vrací chronické oxidativní poškození způsobené UVB zářením u kožních nádorů myší modulací exprese vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (iNOS), tumor nekrotizujícího faktoru (TNF)- a interleukinu (IL){{7} } [3]. Moduluje také expresi mutovaného p53, Bcl-2 a Bax v kožních nádorech myší indukovaných UVB [4]. Několik studií prokázalo, že FA inhibuje expresi cytotoxických a se zánětem spojených enzymů [5] a matrixových metaloproteináz (MMP) a zmírňuje degradaci kolagenových vláken [6].
Podle relevantních studiícistancheje obyčejná bylina, která je známá jako "zázračná bylina, která prodlužuje život". Jeho hlavní složkou jecistanosid, který má různé účinky, jako je antioxidační, protizánětlivý a podpora imunitních funkcí. Mechanismus mezicistancheabělení kůžespočívá v antioxidačním účinku cistanche glykosidů. Melanin v lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu.Cistancheobsahuje cistanosid, který je antioxidantem a může snížit tvorbu volných radikálů v těle, čímž inhibuje produkci melaninu.
Kromě toho má cistanche také funkci podpory produkce kolagenu, který může zvýšit elasticitu a lesk pokožky a pomoci opravit poškozené kožní buňky. Fenylethanolové glykosidy Cistanche mají významný účinek na snížení aktivity tyrosinázy a účinek na tyrosinázu se ukazuje jako kompetitivní a reverzibilní inhibice, která může poskytnout vědecký základ pro vývoj a použití bělicích složek v Cistanche. Proto má cistanche klíčovou roli při bělení kůže. Může inhibovat produkci melaninu, aby se snížilo zabarvení a matnost; a podporují produkci kolagenu pro zlepšení pružnosti a zářivosti pokožky. Vzhledem k širokému uznání těchto účinků cistanche začalo mnoho produktů na bělení pokožky obsahovat bylinné přísady, jako je Cistanche, aby uspokojily poptávku spotřebitelů, čímž se zvýšila komerční hodnota Cistanche vpřípravky na bělení kůže. Stručně řečeno, role cistanche vbělení kůžeje zásadní. Jeho antioxidační účinek a účinek produkující kolagen může snížit zabarvení a matnost, zlepšit elasticitu a lesk pokožky a dosáhnout tak bělícího účinku. Široké použití Cistanche v produktech pro bělení pokožky také ukazuje, že jeho roli v komerční hodnotě nelze podceňovat.
Klikněte na Cistanche pro bělení
Požádat o víc:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Fosfolipidové komplexy jsou široce používány ve farmaceutickém průmyslu. Mají dobrou propustnost a bezpečnost a je jim věnována stále větší pozornost pro použití v kosmetice. Protože fosfolipidy jsou biofunkční surfaktanty s dobrými solubilizačními vlastnostmi, mohou být použity jako nosné systémy pro méně rozpustná léčiva [7], zlepšující transdermální permeaci a kumulativní rychlost penetrace topických léčiv [8]. Transdermální permeace léčiv zahrnuje rozpouštění, distribuci a difúzi do kůže. Tento proces ovlivňují fyzikální a chemické vlastnosti, zejména rozdělovací koeficient olej-voda podávaného léčiva [9].
Metody
Materiály
Buněčná kultura
Příprava FA-PC pomocí odpařování rozpouštědla
Screening na optimální poměr kyseliny ferulové a fosfolipidů
FA a fosfolipidy v molárních poměrech 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 a 1:4 byly přidány do 10}0ml baněk s kulatým dnem a rozpuštěny v bezvodém ethanolu (FA, 2,0 mg/ml). Směsi byly neustále míchány při 40 stupních po dobu 1 hodiny a poté byl bezvodý ethanol odstraněn rotačním odpařováním. Vysušené komplexy FA-PC byly umístěny do exsikátoru na 24 hodin.
Screening pro optimální reakční teplotu pro přípravu FA-PC
Screening pro optimální reakční dobu pro přípravu FA-PC
Screening pro optimální koncentraci FA
Charakterizace FA–PC
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC)
Rozpustnost a rozdělovací koeficient olej-voda
Rozpustnost
Rozpustnosti práškového FA a FA-PC byly stanoveny přidáním přebytku vzorků do 10.0 ml [10] vody nebo n-oktanolu a následným třepáním na houpačce po dobu 3 hodin při 37 stupních. Směsi byly centrifugovány při 15, 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, aby se odstranil nerozpustný FA. Poté byly supernatanty filtrovány přes 0,45 um membrány. Poté byly filtráty desetinásobně zředěny methanolem a obsah FA byl stanoven pomocí UV spektrofotometru (UV-3150; Shimadzu; Japonsko).
Byly připraveny a protřepány vzorky (10 ml) FA a FA-PC ve vodou nasyceném n-oktanolu. Ke každému vzorku byla přidána voda nasycená n-oktanolem (10 ml) a mísitelná kapalina byla míchána po dobu 24 hodin. Poté byly vzorky ponechány stát pro vrstvení. Koncentrace FA v každé fázi byla stanovena UV spektrofotometrií (UV-3150; Shimadzu; Japonsko). Analýzy byly provedeny trojmo.
In vitro difúze
In vitro difúzní studie byly provedeny s použitím Franzových difúzních buněk (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Čína). Kromě toho jsme použili membrány Strat-M®, což jsou syntetické membrány s difúzními charakteristikami, které více korelují s lidskou kůží než modely zvířecí kůže [11]. Membrány byly upnuty mezi donorovou a přijímací komorou vertikálních difúzních komůrek a přijímací komory byly naplněny fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS; pH 7,4), aby se rozpustily FA nebo FA-PC a zajistily se podmínky propadu.
Chromatografická separace byla provedena pomocí systému řady Agilent 1260LC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) vybaveného online vakuovým odplyňovačem, kvartérním čerpadlem, automatickým vzorkovačem, termostatovaným oddílem kolony a detekcí diodového pole (DAD ). Byl použit software Agilent Technologies ChemStation pro kapalinovou chromatografii (LC; B.02.01) a HPLC separace byla provedena pomocí kolony Eclipse plus-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm). Detekční vlnová délka byla 0,05 procenta kyseliny octové (A) a methanolu (B) (40:60, obj./obj.). Průtok byl 1,0 ml/min. Teplota kolony byla nastavena na 30 stupňů. Byly provedeny kumulativní korekce, aby se zjistilo množství uvolněné FA v každém časovém intervalu. Všechna měření byla provedena trojmo a procento kumulativního FA, které proniklo membránou (procento Q), bylo vyneseno do grafu jako funkce času.
Inhibice melanogeneze
Test životaschopnosti buněk B16F10
Životaschopnost buněk a buněčná proliferace byly hodnoceny pomocí {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) test [2]. Buňky B16F10 byly předem ošetřeny koncentracemi 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 a 4.0 mg/ml FA a FA-PC. Po inkubaci po dobu 48 hodin byl přidán roztok MTT (konečná koncentrace: 5 mg/ml) a buňky byly inkubovány po dobu 3 hodin při 37 stupních. Nakonec byla měřena absorbance každého vzorku na čtečce mikrodestiček při 570 nm, aby se získalo procento životaschopných buněk.
Měření obsahu melaninu
Obsah melaninu byl měřen jak bylo popsáno dříve [6] s určitými modifikacemi. Buňky melanomu B16F10 byly nasazeny (2 x 105 buněk/jamka ve 3 ml média) do šestijamkových kultivačních destiček a inkubovány přes noc, aby se umožnilo buňkám přilnout. Na konci ošetření byly buňky promyty PBS a lyžovány 1M NaOH obsahujícím 10 procent dimethylsulfoxidu (DMSO) po dobu 30 minut při 80 stupních. Absorbance (optická hustota; OD) byla měřena při 475 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Obsah melaninu byl vypočten pomocí následujícího vzorce:
Analýza dat
Statistická významnost rozdílů mezi průměrnými měřeními každé léčené skupiny a kontrolní skupiny byla stanovena pomocí Dunnettova t-testu. P hodnoty<0.05 were considered statistically significant.
Výsledky a diskuse
Optimální příprava FA–PC
Rozpustnost a rozdělovací koeficient olej-voda FA-PC
Tabulka 1 ukazuje rozpustnost FA, PM a FA-PC ve vodě a v n-oktanolu. FA-PC vykazoval dobrou rozpustnost ve vodě a n-oktanolu (1,68 a 7,77 mg/ml, v daném pořadí) a bylo zjištěno, že rozpustnost FA-PC v n-oktanolu je významně vyšší než rozpustnost FA (1,34 mg/ml). .
Lipofilita se obvykle měří jako rozdělovací koeficient (P) mezi dvěma nemísitelnými fázemi. Obvykle se vyjadřuje jako log P. Byly stanoveny zdánlivé rozdělovací koeficienty FA a FA–PC v systému n-oktanol/voda. Výsledky ukázaly, že log P byl vyšší pro FA–PC (1,21) než pro FA (0,99) při měření při pH 5.0. Mírně zvýšený log P souvisel s významně zlepšenou rozpustností FA-PC v n-oktanolu ve srovnání s rozpustností FA. Zvýšenou rozpustnost FA-PC v n-oktanolu lze vysvětlit amorfními charakteristikami FA-PC. Vzhledem k tomu, že lipofilita a permeabilita spolu dobře korelují, tyto výsledky naznačují, že transdermální permeabilita FA by mohla být zlepšena jeho aplikací jako fosfolipidového komplexu.
DSC
DSC je spolehlivou metodou pro screening kompatibility lék-excipient a poskytuje maximum informací o možných interakcích mezi léky a pomocnými látkami [10]. Přítomnost interakce lze usuzovat z eliminace endotermických píku, výskytu nových píku, změn tvaru píku a nástupu, teploty píku/bodu tání a relativní plochy nebo entalpie. Obrázek 1 ukazuje termogramy DSC FA (obr. 1a), PC (obr. 1b), PM (obr. 1c) a FA–PC (obr. 1d). Tepelná křivka čistého FA má typické ostré endotermické tání při asi 172,7 stupně, což svědčí o jeho bezvodém a krystalickém stavu, zatímco fosfolipidy vykazují menší endotermický pík při 231,7–248,6 stupni. Křivka DSC pro PM, sestávající ze superponovaných tepelných profilů pro FA a fosfolipidy, nevykazuje žádné významnézměny s výjimkou malého posunu k vyšší teplotě (175,9 stupně), což ukazuje, že mezi složkami nedochází k žádné interakci. FA-PC má jeden hlavní vrchol na 158,2 stupně, cožse liší od píku FA, což ukazuje na interakci mezi FA a PC. Naše výsledky naznačují, že různé stupně interakce a/nebo amorfizace jsou různésměsi nebo komplexy lze získat v závislosti na způsobu jejich přípravy a to je spojeno s rozdíly v rozpustnosti.
FTIR
FTIR spektroskopie může potvrdit tvorbu FA-PC porovnáním spektra FA-PC se spektrem čistého FA. Obrázek 2 ukazuje FTIR spektra FA, PC, PM a FA-PC. Spektrum FA (obr. 2a) ukazuje charakteristický hydroxylový roztahovací pás při 3436 cm-1. Vše se stává širokým singletem ve spektrech FA–PC, PM a fosfolipid (obr. 2b–d). Spektrum FA (obr. 2a) vykazuje charakteristické píky při 1620 cm-1 (roztažení C=C) a 1450 cm-1 (roztažení aromatického kruhu C=C). Ve spektru FA-PC (obr. 2b) nejsou tyto dva píky viditelné, pravděpodobně kvůli zeslabení nebo odstranění nebo stínění molekulou fosfolipidu.
Spektrum FA (obr. 2a) vykazuje charakteristické vrcholy nenasycených karboxylů při 1691 cm-1 (C=}O roztažení) a 1664 cm-1 (C=}C roztažení). Ve spektru FA-PC (obr. 2b) tyto dva píky nejsou patrné, pravděpodobně kvůli přitažlivým silám mezi záporným karboxylovým nábojem ve FA a kladným dusíkovým nábojem ve fosfolipidech. Fosfolipidové spektrum (obr. 2d) dosáhlo vrcholu na 1733 cm-1 (natažení C=O), 1238 cm-1 (natažení P=0) a 1087 cm-1 (P-O –C protahování). The
SEM
Pomocí SEM byly zkoumány povrchové morfologie FA, PC, PM a FA–PC (obr. 3). Na obr. 3c se FA jeví jako krystalická, téměř pravoúhlá, zatímco částice FA–PC (obr. 3a) se jeví nepravidelného tvaru s hladkým povrchem. FA–PC má výrazně odlišný tvar a topografii povrchu ve srovnání s FA a PC (obr. 3b). Pravděpodobně je to kvůli úplné mísitelnosti FA v PC. V PM skenu (obr. 3d) jsou FA i fosfolipidy snadno rozlišitelné.
In vitro difúzní studie
Nedávno byla zavedena syntetická membrána Strat-M® jako náhrada za in vitro difúzní studie na lidské kůži [11]. Membrána Strat-M® se skládá ze dvou vrstev polyethersulfonu, které jsou odolné vůči difúzi. Polyethersulfonové vrstvy leží na jedné vrstvě polyolefinu, která je otevřenější a difúznější. Tato syntetická membrána se vyznačuje nízkou variabilitou mezi jednotlivými šaržemi, čímž poskytuje konzistentnější údaje. Navíc bylo prokázáno, že údaje o difúzi pro membrány Strat-M® dobře korelují s údaji z lidské kůže [11].
Pro vyhodnocení vlivu PC na in vitro difúzní vlastnosti FA bylo vyneseno procento Q FA a FA-PC proti času. Výsledky v této práci ukázaly trend, že fosfolipidy významně zvýšily permeaci FA do membrány Strat-M®. Navíc FA-PC sídlil déle na membráně Strat-M® než FA (obr. 4). Proto začlenění fosfolipidů do FA může prodloužit dobu jeho setrvání ve stratum corneum a učinit ho vhodnější pro prostup kůží. Co se týče doby permeace, ačkoliv bylo hlášeno, že membrána Strat-M® má dobrou korelaci s membránou lidskou kůží [11], má také texturní rozdíly ve srovnání s lidskou kůží. Faktory ovlivňující doby permeace mohou zahrnovat rozpouštědlo, koncentraci sloučenin, hodnotu pH a kol. V budoucí analýze by mělo být provedeno více experimentů.
Inhibice melanogeneze
Vliv FA-PC na syntézu melaninu
Podle literatury může FA inhibovat aktivitu buněčné tyrosinázy a melanogenezi v buňkách melanomu B16F10 prostřednictvím downregulace buněčných proteinů c-kit a ERK1/2 [12]. V této studii FA-PC snížil obsah melaninu v B16F1{{10}} buňkách zřetelněji než FA při testovaných koncentracích 0,25, 0,5 a 1,0 mg/ml (tabulka 2). Zjistili jsme tedy, že FA-PC je účinnější než FA při inhibici syntézy melaninu v buňkách B16F10.
Závěr
Příspěvky autorů
LL a LY významně přispěly ke koncepci a návrhu nebo získávání dat nebo analýze a interpretaci dat; XY a WX se podílely na přípravě rukopisu nebo jeho kritické revizi pro důležitý intelektuální obsah; a ZJ a DY daly konečný souhlas s verzí, která má být zveřejněna. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.
Poděkování
Tato práce byla podpořena National Natural Science Foundations of China (31501402).
Konkurenční zájmy
Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.
Přijato: 27. prosince 2016 Přijato: 14. března 2017
Zveřejněno online: 22. března 2017
